អាសយដ្ឋានបច្ចុប្បន្ន†៖ OX11 0DE, ចក្រភពអង់គ្លេស, អគារ Diamond, ឧទ្យានវិទ្យាសាស្ត្រ និងនវានុវត្តន៍ Harwell, Dietcote, Oxfordshire, ចក្រភពអង់គ្លេស, ក្រុមហ៊ុន Diamond Light Source Co., Ltd., មជ្ឈមណ្ឌលថតរូបភាពជីវសាស្រ្តអេឡិចត្រូនិច។
ស្មុគស្មាញប្រមូលពន្លឺមជ្ឈមណ្ឌលប្រតិកម្ម 1 (RC-LH1) គឺជាសមាសធាតុរស្មីសំយោគស្នូលនៃបាក់តេរី phototrophic ពណ៌ស្វាយ។ យើងបានណែនាំរចនាសម្ព័ន្ធមីក្រូទស្សន៍អេឡិចត្រុងត្រជាក់ពីរនៃស្មុគស្មាញ RC-LH1 ពី Rhodopseudomonas palustris។ រចនាសម្ព័ន្ធគុណភាពបង្ហាញ 2.65-Å នៃស្មុគស្មាញ RC-LH114-W មានរង្វិលជុំរង LH1 ចំនួន 14 ជុំវិញ RC ដែលត្រូវបានរំខានដោយប្រូតេអ៊ីន W ខណៈពេលដែលស្មុគស្មាញដែលគ្មានប្រូតេអ៊ីន-W គឺជាសមាសធាតុ RC ទាំងស្រុងដែលព័ទ្ធជុំវិញដោយ RC។ រង្វិលជុំរង LH1 ចំនួន 16 បិទ។ ការប្រៀបធៀបរចនាសម្ព័ន្ធទាំងនេះផ្តល់នូវការយល់ដឹងអំពីឌីណាមិកនៃ quinone នៅក្នុងស្មុគស្មាញ RC-LH1 រួមទាំងការផ្លាស់ប្តូររចនាសម្ព័ន្ធដែលមិនធ្លាប់កំណត់ពីមុននៅពេលភ្ជាប់ quinone នៅទីតាំង RC QB ក៏ដូចជាទីតាំងនៃកន្លែងភ្ជាប់ quinone ជំនួយ ដែលជួយបញ្ជូនពួកវាទៅ RC។ រចនាសម្ព័ន្ធតែមួយគត់នៃប្រូតេអ៊ីន W ការពារការបិទរង្វិលជុំ LH1 ដោយហេតុនេះបង្កើតឆានែលសម្រាប់បង្កើនល្បឿនការផ្លាស់ប្តូរ quinone/quinolone។
ថាមពលដែលផ្តល់ដោយរស្មីសំយោគអាចទ្រទ្រង់ជីវិតស្ទើរតែទាំងអស់នៅលើផែនដី ហើយវាមានសក្តានុពលដ៏អស្ចារ្យសម្រាប់ជីវបច្ចេកវិទ្យាពន្លឺព្រះអាទិត្យ។ ខណៈពេលដែលលើកកម្ពស់រស្មីសំយោគសកល បាក់តេរី phototrophic ពណ៌ស្វាយក៏បង្ហាញពីរបៀបថាមពល និងសមត្ថភាពមេតាបូលីសផ្សេងៗផងដែរ។ ពួកវាអាចជៀសវាងរស្មីសំយោគ និងលូតលាស់ជាបាក់តេរី heterotrophic នៅក្នុងទីងងឹត អាចជួសជុលអាសូត និងកាបូនឌីអុកស៊ីត ផលិតអ៊ីដ្រូសែន និងបំបែកសមាសធាតុអារ៉ូម៉ាទិច (1-3)។ ដើម្បីផ្តល់ថាមពលសម្រាប់ដំណើរការទាំងនេះ ពន្លឺត្រូវតែបំលែងទៅជាថាមពលគីមីយ៉ាងឆាប់រហ័ស និងមានប្រសិទ្ធភាព។ ដំណើរការនេះចាប់ផ្តើមនៅពេលដែលស្មុគស្មាញអង់តែនចាប់ពន្លឺស្រូបយកពន្លឺ និងផ្ទេរថាមពលដែលចាប់បានទៅមជ្ឈមណ្ឌលប្រតិកម្ម (RC) ដោយហេតុនេះចាប់ផ្តើមការបំបែកបន្ទុក (4 – 7)។ ឯកតាមូលដ្ឋាននៃរស្មីសំយោគនៅក្នុងបាក់តេរី phototrophic ពណ៌ស្វាយត្រូវបានផ្សំឡើងពីប្រភេទទី 2 RC ដែលហ៊ុំព័ទ្ធដោយស្មុគស្មាញប្រមូលផលពន្លឺ 1 (LH1) ដែលបង្កើតជាស្មុគស្មាញស្នូល RC-LH1។ LH1 ត្រូវបានបង្កើតឡើងដោយអារេនៃ heterodimers αβ កោង ដែលនីមួយៗភ្ជាប់ម៉ូលេគុលក្លរ៉ូហ្វីលបាក់តេរីពីរ (BChl) a និង carotenoids មួយឬពីរ (8-12)។ អង់តែន LH1 សាមញ្ញបំផុតមានអេតេរ៉ូឌីមឺរ αβ ចំនួន 16 ឬ 17 ដែលព័ទ្ធជុំវិញ RC (9-13) ក្នុងរង្វិលជុំបិទជិត ប៉ុន្តែនៅក្នុងស្មុគស្មាញស្នូលផ្សេងទៀត ប៉ិបទីតឆ្លងភ្នាសរំខានដល់ការបន្តនៃ LH1 ជុំវិញ ដោយហេតុនេះជំរុញការសាយភាយ quinol/quinone រវាង RC និងស្មុគស្មាញ cytochrome bc1 (11, 13-15)។ រុក្ខជាតិ phototrophic ពណ៌ស្វាយ Rhodopseudomonas (Rps.) គឺជាសារពាង្គកាយគំរូដែលអាចយល់ពីថាមពល និងការផ្ទេរអេឡិចត្រុងដែលគាំទ្រដល់រស្មីសំយោគ។ រចនាសម្ព័ន្ធគ្រីស្តាល់ដំបូងនៃ Rps។ គំរូនៃស្មុគស្មាញ palustris RC-LH1 គឺ RC ហ៊ុំព័ទ្ធដោយរង្វិលជុំ LH1 heterodimeric ចំនួន 15 ដែលត្រូវបានរំខានដោយប្រូតេអ៊ីនដែលមិនស្គាល់មួយហៅថា "ប្រូតេអ៊ីន W" (14)។ ប្រូតេអ៊ីន-W ត្រូវបានកំណត់នៅពេលក្រោយថាជា RPA4402 ដែលជាប្រូតេអ៊ីន 10.5kDa ដែលមិនបានកំណត់លក្ខណៈជាមួយនឹងវង់ឆ្លងភ្នាសបី (TMH) (16)។ យើងស្នើឱ្យប្តូរឈ្មោះហ្សែន rpa4402 ដែលអ៊ិនកូដប្រូតេអ៊ីន W ទៅជា pufW ដើម្បីឲ្យស្របនឹងនាមដែលប្រើសម្រាប់ហ្សែនដែលអ៊ិនកូដអនុឯកតា RC-L, M (pufL, pufM) និង LH1α, β (pufA, pufB)។ គួរឱ្យចាប់អារម្មណ៍ ប្រូតេអ៊ីន-W មានវត្តមានតែនៅក្នុងប្រហែល 10% នៃ RC-LH1 ប៉ុណ្ណោះ ដែលបង្ហាញថា Rps. palustris ផលិតស្មុគស្មាញ RC-LH1 ពីរផ្សេងគ្នា។ នៅទីនេះ យើងរាយការណ៍ពីរចនាសម្ព័ន្ធ cryo-EM (cryo-EM) ដែលមានគុណភាពបង្ហាញខ្ពស់នៃស្មុគស្មាញស្នូលពីរ មួយមានប្រូតេអ៊ីន W និង heterodimers αβ ចំនួន 14 មួយទៀតគ្មានប្រូតេអ៊ីន W និងរង្វិលជុំ Heterodimer LH1 ចំនួន 16 ដែលបិទជិត។ រចនាសម្ព័ន្ធរបស់យើងតំណាងឱ្យការផ្លាស់ប្តូរជំហានមួយនៅក្នុងការយល់ដឹងអំពីស្មុគស្មាញ RC-LH1 នៃ Rps. palustris ពីព្រោះយើងបានវិភាគចំនួនប្រជាជនដូចគ្នានៃវ៉ារ្យ៉ង់នីមួយៗ ហើយមានគុណភាពបង្ហាញគ្រប់គ្រាន់ដើម្បីកំណត់ peptide នីមួយៗ និងសារធាតុពណ៌ដែលចងភ្ជាប់ និង lipids និង quinones ដែលពាក់ព័ន្ធយ៉ាងច្បាស់លាស់។ ការប្រៀបធៀបរចនាសម្ព័ន្ធទាំងនេះបង្ហាញថា ប្រូតេអ៊ីន TMH ទាំងបី-W ដែលមិនត្រូវបានរកឃើញនៅក្នុងស្មុគស្មាញ RC-LH1 ផ្សេងទៀតរហូតមកដល់ពេលនេះ បង្កើតឆានែលគីណូន ដើម្បីពន្លឿនការផ្លាស់ប្តូរគីណូន/គីណូឡូន។ កន្លែងចងភ្ជាប់លីពីត និងគីណូនដែលត្រូវបានអភិរក្សមួយចំនួនត្រូវបានកំណត់អត្តសញ្ញាណ ហើយយើងបានបង្ហាញពីការផ្លាស់ប្តូររចនាសម្ព័ន្ធថ្មីមួយ បន្ទាប់ពីការរួមបញ្ចូលគ្នានៃគីណូន និង RC ដែលអាចសមស្របសម្រាប់ប្រព័ន្ធពន្លឺ II (PSII) RC នៃសារពាង្គកាយ phototrophic ដែលមានអុកស៊ីសែន។ ការរកឃើញរបស់យើងផ្តល់នូវការយល់ដឹងថ្មីៗអំពីចលនវិទ្យានៃការចង និងការផ្លាស់ប្តូរគីណូន/គីណូឡូននៅក្នុងស្មុគស្មាញស្នូល RC-LH1 នៃបាក់តេរី phototrophic ពណ៌ស្វាយ។
ដើម្បីសម្រួលដល់ការសិក្សាលម្អិតអំពីស្មុគស្មាញពីរដែលមាននៅក្នុង Rps. palustris យើងញែក RC-LH1 នីមួយៗដោយវិធីសាស្ត្រជីវគីមី។ ស្មុគស្មាញដែលខ្វះប្រូតេអ៊ីន W (តទៅនេះហៅថា ΔpufW) ត្រូវបានបន្សុទ្ធពីពូជដែលខ្វះហ្សែន pufW (16) ហើយមានតែស្មុគស្មាញ RC-LH1 មួយប៉ុណ្ណោះដែលអាចផលិតបាន។ ស្មុគស្មាញដែលមានប្រូតេអ៊ីន W ត្រូវបានផលិតដោយពូជមួយ។ ប្រូតេអ៊ីន W នៃពូជនេះត្រូវបានកែប្រែជាមួយនឹងស្លាក His 10x នៅចុង C របស់វា ដូច្នេះស្មុគស្មាញដែលមានប្រូតេអ៊ីន W អាចត្រូវបានផ្សំយ៉ាងមានប្រសិទ្ធភាពជាមួយប្រូតេអ៊ីន W ដែលខ្វះភាគច្រើនដោយការធ្វើឱ្យលោហៈមិនរើ។ ស្មុគស្មាញត្រូវបានបំបែកយ៉ាងមានប្រសិទ្ធភាព (16) Affinity Chromatography (IMAC)។
ដូចបង្ហាញក្នុងរូបភាពទី 1 ស្មុគស្មាញទាំងពីរមាន RC អនុឯកតាចំនួនបី (RC-L, RC-M និង RC-H) ហ៊ុំព័ទ្ធដោយអង់តែន LH1។ រចនាសម្ព័ន្ធ 2.80-A នៃស្មុគស្មាញដែលខ្វះប្រូតេអ៊ីន-W បង្ហាញអេតេរ៉ូឌីមឺរ αβ ចំនួន 16 ដែលបង្កើតជារង្វិលជុំ LH1 បិទជិតទាំងស្រុងជុំវិញ RC ដែលតទៅនេះហៅថាស្មុគស្មាញ RC-LH116។ រចនាសម្ព័ន្ធ 2.65Å នៃស្មុគស្មាញដែលមានប្រូតេអ៊ីន-W មានអេតេរ៉ូឌីមឺរ LH1 ចំនួន 14 ដែលត្រូវបានរំខានដោយប្រូតេអ៊ីន-W ដែលតទៅនេះហៅថា RC-LH114-W។
(A និង B) ការតំណាងផ្ទៃនៃសមាសធាតុ។ (C និង D) សារធាតុពណ៌ភ្ជាប់ដែលបង្ហាញជាដំបង។ (E និង F) ស្មុគស្មាញដែលសង្កេតឃើញពីផ្ទៃស៊ីតូប្លាស្មិកមានប៉ិបទីត និងអនុឯកតា LH1 ដែលតំណាងនៅក្នុងរូបតុក្កតា ហើយត្រូវបានដាក់លេខតាមទ្រនិចនាឡិកាពីគម្លាតប្រូតេអ៊ីន-W [ស្របនឹងការដាក់លេខ Rba។ ស្មុគស្មាញ sphaeroides (13)]។ សម្រាប់ LH1-α ពណ៌នៃអនុឯកតាប្រូតេអ៊ីនគឺពណ៌លឿង; សម្រាប់ LH1-β ពណ៌នៃអនុឯកតាប្រូតេអ៊ីនគឺពណ៌ខៀវ; សម្រាប់ប្រូតេអ៊ីន-W ប្រូតេអ៊ីនគឺពណ៌ក្រហម; សម្រាប់ RC-H វាមានពណ៌ខៀវខ្ចី; សម្រាប់ RC-L វាមានពណ៌ទឹកក្រូច; សម្រាប់ RC-M ពណ៌ស្វាយ។ សហហ្វាក់ទ័រត្រូវបានតំណាងដោយដំបង ពណ៌បៃតងតំណាងឱ្យម៉ូលេគុល BChl និង BPh a ពណ៌ស្វាយតំណាងឱ្យការ៉ូទីណូអ៊ីត និងពណ៌លឿងតំណាងឱ្យម៉ូលេគុល UQ10។ (G និង H) ទិដ្ឋភាពពង្រីកនៃគម្លាតប្រូតេអ៊ីន-W នៅក្នុងតំបន់សមមូលនៃស្មុគស្មាញ RC-LH114-W (G) និងស្មុគស្មាញ RC-LH116 (H)។ សហហ្វាក់ទ័រត្រូវបានបង្ហាញក្នុងទម្រង់ជាការបំពេញចន្លោះ គីណូនដែលមានជាតិ chelated ត្រូវបានបង្ហាញជាពណ៌ខៀវ។ គម្លាតប្រូតេអ៊ីន-W ត្រូវបានបន្លិចដោយបន្ទាត់ចំនុចពណ៌ខៀវនៅក្នុង (G) ហើយរន្ធតូចៗដែលគីណូន/គីណូឡូលសាយភាយនៅលើចិញ្ចៀន LH116 ត្រូវបានបន្លិចដោយបន្ទាត់ចំនុចពណ៌ខ្មៅនៅក្នុង (H)។
រូបភាពទី 1 (A និង B) បង្ហាញ RC ដែលហ៊ុំព័ទ្ធដោយអារេបើកចំហ ឬបិទនៃ heterodimers LH1αβ ដែលអារេនីមួយៗភ្ជាប់ BChl ពីរ និង carotenoid មួយ (រូបភាពទី 1, C និង D)។ ការសិក្សាពីមុនបានបង្ហាញថា Rps គឺជាស្មុគស្មាញ LH1។ នៅក្នុងផ្លូវជីវសំយោគនៃ spirulina xanthin ប្រភេទសត្វទាំងនេះមានចំនួនចម្រុះនៃ carotenoids (17)។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ spiropyrroxanthin គឺជា carotenoid លេចធ្លោ ហើយដង់ស៊ីតេរបស់វាគឺគួរឱ្យពេញចិត្ត។ ដូច្នេះ យើងបានជ្រើសរើសធ្វើគំរូ spiroxanthin នៅគ្រប់កន្លែងភ្ជាប់ LH1។ ប៉ូលីប៉ិបទីតអាល់ហ្វា និងបេតាគឺជា TMHs តែមួយដែលមានតំបន់ខាងក្រៅភ្នាសខ្លី (រូបភាពទី 1, A, B, E និង F)។ ទោះបីជាដង់ស៊ីតេនៃសំណល់ 17 នៅចុង C-terminus មិនត្រូវបានគេសង្កេតឃើញក៏ដោយ ប៉ូលីប៉ិបទីតអាល់ហ្វាត្រូវបានកាត់ចេញពី Met1 ទៅ Ala46 នៅក្នុងស្មុគស្មាញទាំងពីរ។ ប៉ូលីប៉ិបទីត β ត្រូវបានកាត់បន្ថយពី Gly4 ទៅ Tyr52 នៅក្នុង RC-LH116 និងពី Ser5 ទៅ Tyr52 នៅក្នុង RC-LH114-W។ មិនមានដង់ស៊ីតេនៃសំណល់ N-terminal ចំនួន 3 ឬ 4 ឬ C-terminal ចំនួន 13 ត្រូវបានគេសង្កេតឃើញទេ (រូបភាព S1)។ ការវិភាគម៉ាសស្ពិចត្រូម៉ែត្រីនៃស្មុគស្មាញ RC-LH1 ចម្រុះដែលរៀបចំពីពូជប្រភេទព្រៃបានបង្ហាញថាតំបន់ដែលបាត់គឺជាលទ្ធផលនៃការបំបែក heterologous នៃប៉ិបទីតទាំងនេះ (រូបភាព S1 និង S2)។ ការបង្កើត N-terminal នៃ α-Met1 ក៏ត្រូវបានគេសង្កេតឃើញផងដែរ (f)។ ការវិភាគបានបង្ហាញថា α-ប៉ិបទីតមានសំណល់ fMet1 ដល់ Asp42/Ala46/Ala47/Ala50 ហើយ β-ប៉ិបទីតមានសំណល់ Ser2 ដល់ Ala53 ដែលស្របគ្នាយ៉ាងល្អជាមួយនឹងផែនទីដង់ស៊ីតេ EM សីតុណ្ហភាពទាប។
ការសម្របសម្រួលនៃ α-His29 និង β-His36 ធ្វើឱ្យ BChls ប្រឈមមុខនឹងគ្នា។ αβ heterodimer នីមួយៗផ្គុំជាមួយជិតខាងរបស់វាដើម្បីបង្កើតជារង្វិលជុំបើកចំហ (RC-LH114-W) ឬរង្វិលជុំបិទ (RC-LH116) ជុំវិញ RC The exciton coupled pigment array (រូបភាពទី 1, C និង D)។ បើប្រៀបធៀបជាមួយក្រុម 877 nm នៃ RC-LH114-W ការផ្លាស់ប្តូរពណ៌ក្រហមស្រូបយក 880 nm នៃ RC-LH116 គឺ 3 nm (រូបភាពទី 2A)។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ វិសាលគមឌីក្រូអ៊ីមរាងជារង្វង់គឺស្ទើរតែដូចគ្នា (រូបភាពទី 2B) ដែលបង្ហាញថាទោះបីជាមានភាពខុសគ្នាយ៉ាងច្បាស់រវាងរង្វិលជុំបើកចំហ និងបិទក៏ដោយ បរិស្ថានក្នុងស្រុករបស់ BChls គឺស្រដៀងគ្នាខ្លាំងណាស់។ ការផ្លាស់ប្តូរពណ៌ក្រហមស្រូបយកអាចជាលទ្ធផលនៃចលនាកម្ដៅថយចុះ និងស្ថេរភាពកើនឡើងនៅលើរង្វិលជុំបិទ (18, 19) ការផ្លាស់ប្តូរនៅក្នុងការភ្ជាប់សារធាតុពណ៌ដែលបណ្តាលមកពីរង្វិលជុំបិទ (20, 21) ឬការរួមបញ្ចូលគ្នានៃឥទ្ធិពលទាំងពីរនេះ (11)។
(ក) វិសាលគមស្រូបយកពន្លឺអ៊ុលត្រាវីយូឡេ/អាចមើលឃើញ/ជិតអ៊ីនហ្វ្រារ៉េដ ដែលកំពូលរបស់វាត្រូវបានសម្គាល់ដោយសារធាតុពណ៌ដែលត្រូវគ្នា ហើយត្រូវបានធ្វើឱ្យមានលក្ខណៈធម្មតាដល់កំពូល BPh នៅ 775 nm។ (ខ) វិសាលគមឌីក្រូអ៊ីមរាងជារង្វង់ត្រូវបានធ្វើឱ្យមានលក្ខណៈធម្មតាទៅនឹងការស្រូបយក BChl នៅ 805 nm។ (គ និង ឃ) វិសាលគម ΔA ដែលបានជ្រើសរើសពីវិសាលគមស្រូបយកដែលដោះស្រាយតាមពេលវេលានៃស្មុគស្មាញ RC-LH114-W (គ) និងស្មុគស្មាញ RC-LH116 (ឃ)។ សម្រាប់ការប្រៀបធៀបកាន់តែប្រសើរ វិសាលគមទាំងអស់ត្រូវបានធ្វើឱ្យមានលក្ខណៈធម្មតាដល់ ∆A នៃ −A នៅ 0.2 ps។ (ង) អត្រានៃអុកស៊ីតកម្ម cytochrome c2 បន្ទាប់ពីការប៉ះពាល់នឹងវិទ្យុសកម្មនៅក្នុងវត្តមាននៃកំហាប់ផ្សេងៗនៃ UQ2 (សូមមើលរូបភាព S8 សម្រាប់ទិន្នន័យឆៅ)។ (ច) នៅក្នុងកោសិកាដែលលូតលាស់ក្រោមពន្លឺអាំងតង់ស៊ីតេទាប មធ្យម ឬខ្ពស់ (10, 30 ឬ 300μMm-2 s-1 រៀងគ្នា) អនុឯកតាប្រូតេអ៊ីន W និង RC-L នៅក្នុងស្មុគស្មាញដែលបានបន្សុទ្ធ និងសមាមាត្រភ្នាសដែលបានបំបែក។ កំណត់កម្រិតប្រូតេអ៊ីនដោយវិធីសាស្ត្រអេឡិចត្រូផូរីសជែល SDS-polyacrylamide និង immunoassay (សូមមើលរូបភាព S9 សម្រាប់ទិន្នន័យឆៅ)។ កំណត់សមាមាត្រទាក់ទងទៅនឹងស្មុគស្មាញ RC-LH114-W ដែលបានបន្សុទ្ធ។ សមាមាត្រស្តូគីយ៉ូម៉ែត្រិចនៃ RC-L ទៅនឹងប្រូតេអ៊ីន-W នៃស្មុគស្មាញគឺ 1:1។
BChls នៅទីតាំងទី 1 នៅក្នុងរង្វិលជុំ αβ14 ដែលខូចទ្រង់ទ្រាយនៃ RC-LH114-W (រូបភាពទី 1, A, C, និង E) គឺនៅជិតអ្នកផ្តល់បឋម RC (P) ជាង 6.8Å ជាង BChls សមមូលនៅក្នុង RC-LH116 (រូបភាពទី 1, B, D, និង F, និងរូបភាព S3); ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ ចលនវិទ្យាស្រូបយកបណ្តោះអាសន្ននៃស្មុគស្មាញទាំងពីរបង្ហាញថាសម្រាប់ RC-LH114-W និង RC-LH116 ថេរពេលវេលាផ្ទេរថាមពលរំភើបពី LH1 ទៅ RC គឺ 40 ±4 និង 44 ±3 ps (រូបភាពទី 2)។ ក៏មិនមានភាពខុសគ្នាគួរឱ្យកត់សម្គាល់នៅក្នុងការផ្ទេរអេឡិចត្រូនិចនៅក្នុង RC ដែរ (រូបភាព S5 និងអត្ថបទបន្ថែមដែលពាក់ព័ន្ធ)។ យើងសង្ស័យថាការឆ្លើយឆ្លងគ្នាយ៉ាងជិតស្និទ្ធនៃពេលវេលាផ្ទេរថាមពលរវាង LH1 និង RC-P គឺដោយសារតែចម្ងាយ មុំ និងថាមពលសក្តានុពលស្រដៀងគ្នានៃ BChl ភាគច្រើននៅក្នុងរង្វិលជុំ LH1 ទាំងពីរ។ វាហាក់ដូចជាការស្វែងយល់ពីគំរូថាមពល LH1 ដើម្បីឈានដល់ចម្ងាយអប្បបរមាមិនលឿនជាងការផ្ទេរថាមពលដោយផ្ទាល់ពីទីតាំងមិនល្អទៅ RC ទេ។ រង្វិលជុំ LH1 បើកចំហនៅក្នុង RC-LH114-W ក៏អាចឆ្លងកាត់ចលនាកម្ដៅមិនសំខាន់ក្រោមលក្ខខណ្ឌសីតុណ្ហភាពទាបសម្រាប់ការវិភាគរចនាសម្ព័ន្ធ ហើយមានការកំណត់រចនាសម្ព័ន្ធចិញ្ចៀន αβ14 វែងជាងនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់ពីចម្ងាយសារធាតុពណ៌នៃ βBChls នៅទីតាំង RC 1។
ស្មុគស្មាញ RC-LH116 មានផ្ទុក BChls ចំនួន 32 និង carotenoids ចំនួន 16 ហើយការរៀបចំរួមរបស់វាគឺដូចគ្នានឹងការរៀបចំដែលទទួលបានពី Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9), Thiorhodovibrio (Trv.) 970 strain (PDB ID 7C9R) (12) និងសារាយបៃតង (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10)។ បន្ទាប់ពីការតម្រឹម មានតែគម្លាតតិចតួចប៉ុណ្ណោះនៅក្នុងទីតាំងនៃ heterodimers αβ ដែលត្រូវបានគេសង្កេតឃើញ ជាពិសេស 1-5, 15, និង 16 (រូបភាព S6)។ វត្តមាននៃប្រូតេអ៊ីន-W មានឥទ្ធិពលយ៉ាងសំខាន់ទៅលើរចនាសម្ព័ន្ធរបស់ LH1។ TMHs ទាំងបីរបស់វាត្រូវបានភ្ជាប់ដោយរង្វិលជុំខ្លីៗ ជាមួយនឹងចុង N នៅផ្នែក lumen នៃស្មុគស្មាញ និងចុង C នៅផ្នែក cytoplasm (រូបភាព 1A និង 3, A ដល់ D)។ ប្រូតេអ៊ីន-W ភាគច្រើនមិនជ្រាបទឹក (រូបភាពទី 3B) ហើយ TMH2 និង TMH3 មានអន្តរកម្មជាមួយ LH1αβ-14 ដើម្បីបង្កើតជាផ្ទៃឆ្លងភ្នាស (រូបភាពទី 3, B និង E ដល់ G)។ ចំណុចប្រទាក់ភាគច្រើនត្រូវបានផ្សំឡើងដោយសំណល់ Phe, Leu និង Val នៅក្នុងតំបន់ឆ្លងភ្នាស។ សំណល់ទាំងនេះត្រូវបានដាក់ជង់ជាមួយអាស៊ីតអាមីណូដែលមិនជ្រាបទឹក និងសារធាតុពណ៌ αβ-14។ សំណល់ប៉ូលមួយចំនួនក៏រួមចំណែកដល់អន្តរកម្មផងដែរ រួមទាំងចំណងអ៊ីដ្រូសែនរវាង W-Thr68 និង β-Trp42 នៅលើផ្ទៃនៃប្រហោងស្មុគស្មាញ (រូបភាពទី 3, F និង G)។ នៅលើផ្ទៃនៃស៊ីតូប្លាស្មុគ្រស្មាញ Gln34 គឺនៅជាប់នឹងក្រុម keto នៃ αβ-14 carotenoids។ លើសពីនេះ ម៉ូលេគុល n-dodecyl β-d-maltoside (β-DDM) ត្រូវបានរំលាយ ហើយកន្ទុយមិនជ្រាបទឹករបស់វាលាតសន្ធឹងទៅចំណុចប្រទាក់រវាងប្រូតេអ៊ីន-W និង αβ-14 ហើយកន្ទុយ lipid អាចមានទីតាំងនៅក្នុងខ្លួន។ យើងក៏បានកត់សម្គាល់ផងដែរថា តំបន់ដោះស្រាយចុង C នៃប្រូតេអ៊ីន W និង RCH គឺនៅជិតគ្នាខ្លាំងណាស់ ប៉ុន្តែមិនស្ថិតនៅក្នុងវិសាលភាពនៃការបង្កើតអន្តរកម្មជាក់លាក់នោះទេ (រូបភាពទី 1, A និង E)។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ អាចមានអន្តរកម្មនៅក្នុងអាស៊ីតអាមីណូចុង C ដែលមិនទាន់ដោះស្រាយនៃប្រូតេអ៊ីនទាំងពីរនេះ ដែលអាចផ្តល់យន្តការសម្រាប់ការជ្រើសរើសប្រូតេអ៊ីន-W ក្នុងអំឡុងពេលនៃការផ្គុំស្មុគស្មាញ RC-LH114-W។
(ក) ប្រូតេអ៊ីន-W ដែលបែរមុខទៅចំណុចប្រទាក់ជាមួយ LH1αβ14 ក្នុងទម្រង់ជារូបតុក្កតា មានខ្សែចំហៀងរាងដំបង (ពណ៌ក្រហម) ដែលបង្ហាញនៅក្នុងផ្នែកមួយនៃដ្យាក្រាមសក្តានុពលអេឡិចត្រូស្តាទិច (ផ្ទៃពណ៌ប្រផេះថ្លាដែលមានកម្រិតវណ្ឌវង្ក 0.13)។ (ខ) ប្រូតេអ៊ីន-W តំណាងដោយផ្ទៃពណ៌ដែលមិនជ្រាបទឹក។ តំបន់ប៉ូល និងតំបន់ដែលមានបន្ទុកត្រូវបានបង្ហាញជាពណ៌ខៀវខ្ចី តំបន់ដែលមិនជ្រាបទឹកត្រូវបានបង្ហាញជាពណ៌ស និងតំបន់ដែលមិនជ្រាបទឹកខ្លាំងត្រូវបានបង្ហាញជាពណ៌ទឹកក្រូច។ (គ និង ឃ) ប្រូតេអ៊ីន-W តំណាងនៅក្នុងរូបតុក្កតា ទិសដៅរបស់វាគឺដូចគ្នានឹង (ក) (គ) និងបង្វិល 180° (ឃ)។ យោងតាមទីតាំងនៅក្នុងលំដាប់ សំណល់ដែលអាចសម្គាល់បានប្រើគ្រោងការណ៍ពណ៌ឥន្ទធនូ ដែលចុង N មានពណ៌ខៀវ និងចុង C មានពណ៌ក្រហម។ (ង) ប្រូតេអ៊ីន-W ក្នុងទិដ្ឋភាពដូចគ្នានឹង (ក) ហើយសំណល់នៅចំណុចប្រទាក់នៃប្រូតេអ៊ីន-W:LH1 ត្រូវបានតំណាងដោយដំបងដែលមានសញ្ញាសម្គាល់ភ្ជាប់។ (F) ប្រូតេអ៊ីន-W ត្រូវបានបង្វិល 90° ទាក់ទងទៅនឹង (E) និង LH1αβ14 នៅក្នុងការតំណាងរូបតុក្កតា និងទាក់ទងទៅនឹងសំណល់ចំណុចប្រទាក់នៅក្នុងការតំណាងរបារ។ សំណល់ដែលលាតសន្ធឹងចេញពីប៉ូលីប៉ិបទីតបេតាត្រូវបានដាក់ស្លាក។ សហហ្វាកទ័រត្រូវបានបង្ហាញជារបារដែលត្រូវនឹងពណ៌នៃរូបភាពទី 1 β-DDM ដែលរលួយត្រូវបានបង្ហាញជាពណ៌ប្រផេះ និងអុកស៊ីសែនត្រូវបានបង្ហាញជាពណ៌ក្រហម។ (G) ទិដ្ឋភាពនៅក្នុង (F) ត្រូវបានបង្វិល 180° ជាមួយនឹងសំណល់លេចធ្លោនៃប៉ូលីប៉ិបទីតអាល់ហ្វាដែលមានស្លាក។
ប្រូតេអ៊ីន-W ជំនួស​អេតេរ៉ូឌីមឺរ αβ (ទី 15 ក្នុងរូបភាពទី 1F) ដោយហេតុនេះការពារការបិទរង្វិលជុំ និងការផ្អៀងអេតេរ៉ូឌីមឺរ αβ បីដំបូង។ វាត្រូវបានគេសង្កេតឃើញថា មុំទំនោរអតិបរមានៃអេតេរ៉ូឌីមឺរ αβ-1 ដំបូងទាក់ទងទៅនឹងភាពធម្មតានៃខ្សែភាពយន្តគឺ 25° ដល់ 29° (រូបភាពទី 1, A និង E) ដែលត្រូវបានបង្កើតឡើងដោយទំនោរ 2° ដល់ 8° នៃ αβ-1 នៅក្នុង RC A កម្រិតពណ៌ច្បាស់-LH116 (រូបភាពទី 1, B និង F)។ អេតេរ៉ូឌីមឺរទីពីរ និងទីបីមានទំនោរនៅ 12° ដល់ 22° និង 5° ដល់ 10° រៀងគ្នា។ ដោយសារតែឧបសគ្គស្តេរ៉ូអ៊ីកនៃ RC ទំនោរនៃ αβ-1 មិនរាប់បញ្ចូលគូទីពីរនៃ αβ (ដែលត្រូវគ្នានឹង αβ ទី 16 ក្នុងរូបភាពទី 1F) ដោយហេតុនេះបង្កើតជាគម្លាតច្បាស់លាស់នៅក្នុងសង្វៀន LH1 (រូបភាពទី 1, A និង E)។ ដោយសារតែខ្វះអេតេរ៉ូឌីមឺរ αβ ពីរ អមដោយការបាត់បង់ BChl ចំនួនបួន និងការ៉ូទីណូអ៊ីតពីរ គ្មានការ៉ូទីណូអ៊ីតណាមួយភ្ជាប់ទៅនឹងអនុឯកតា αβ-1 ដែលរមួលនោះទេ ដែលបណ្តាលឱ្យមានចិញ្ចៀន LH114-W ដែលមានការ៉ូទីណូអ៊ីតបួសចំនួន 13 និង BChls ចំនួន 28។ ការប៉ាន់ស្មានគុណភាពបង្ហាញក្នុងស្រុកនៃស្មុគស្មាញទាំងពីរនៅក្នុងតំបន់ αβ1 ដល់ 7 គឺទាបជាងការប៉ាន់ស្មានគុណភាពបង្ហាញនៃរង្វិលជុំ LH1 ដែលនៅសល់ ដែលអាចឆ្លុះបញ្ចាំងពីភាពប្លាស្ទិកដែលមាននៅក្នុងអនុឯកតា LH1 ដែលនៅជាប់នឹងកន្លែង RC QB (រូបភាពទី 4)។
រូបភាពនៃ RC-LH114-W (A និង B) និង RC-LH116 (C និង D) ត្រូវបានបង្ហាញពីទិដ្ឋភាពខាងលើ/ទិដ្ឋភាពចំហៀង (A និង B) (A និង C) និងផ្ទៃប្រហោងដូចគ្នានៃរូបភាពទី 1 (B និង D)។ គ្រាប់ចុចពណ៌ត្រូវបានបង្ហាញនៅខាងស្តាំ។
ស្មុគស្មាញស្នូលលក្ខណៈតែមួយគត់ដែលមានសមាមាត្រស្តូគីយ៉ូម៉ែត្រិច 1:14 គឺឌីមឺរ Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX (13)។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ ប្រូតេអ៊ីន W និង PufX មិនមានភាពដូចគ្នាច្បាស់លាស់ទេ ហើយមានឥទ្ធិពលគួរឱ្យកត់សម្គាល់លើរចនាសម្ព័ន្ធ LH1 រៀងៗខ្លួន។ PufX គឺជា TMH តែមួយដែលមានដែនស៊ីតូប្លាស្មិក N-terminal ដែលមានអន្តរកម្មជាមួយផ្នែកស៊ីតូប្លាស្មិកនៃអនុឯកតា RC-H (13) នៅទីតាំងដែលត្រូវគ្នាទៅនឹង Rps. palustris LH116αβ-16។ PufX បង្កើតឆានែលសម្រាប់ការផ្លាស់ប្តូរ quinone/quinolone រវាង RC-LH1 និងស្មុគស្មាញ cytochrome bcl ហើយមានវត្តមាននៅក្នុងស្មុគស្មាញស្នូល Rba. sphaeroides ទាំងអស់ (13)។ ទោះបីជាចំណុចប្រទាក់ monomer-monomer ស្ថិតនៅក្នុង Rba ក៏ដោយ។ ឌីមឺរ sphaeroides RC-LH1-PufX មានទីតាំងនៅទីតាំងភ្ជាប់នៃប្រូតេអ៊ីន W នៅក្នុង RC-LH114-W ហើយគម្លាតដែលបង្កឡើងដោយ PufX និងប្រូតេអ៊ីន-W គឺស្ថិតនៅទីតាំងសមមូល (រូបភាព S7A)។ គម្លាតនៅក្នុង RC-LH114-W ក៏ត្រូវបានតម្រឹមជាមួយនឹងឆានែល quinone សម្មតិកម្ម (8) នៃ Pseudomonas rosea LH1 ដែលត្រូវបានបង្កើតឡើងដោយ peptides ដែលមិនទាក់ទងនឹងប្រូតេអ៊ីន W ឬ PufX (រូបភាព S7B)។ លើសពីនេះ ឆានែល quinone នៅក្នុង Blc។ LH1 ពណ៌បៃតង emerald ដែលបង្កើតឡើងដោយការដកចេញនូវអនុឯកតា γ មួយ (7) មានទីតាំងនៅទីតាំងស្រដៀងគ្នា (រូបភាព S7C)។ ទោះបីជាសម្របសម្រួលដោយប្រូតេអ៊ីនផ្សេងៗគ្នាក៏ដោយ ការលេចឡើងនៃឆានែល quinone/quinolol ទាំងនេះនៅក្នុងទីតាំងរួមនៅក្នុងស្មុគស្មាញ RC-LH1 ហាក់ដូចជាឧទាហរណ៍នៃការវិវត្តន៍រួមគ្នា ដែលបង្ហាញថាគម្លាតដែលបង្កើតឡើងដោយប្រូតេអ៊ីន W អាចដើរតួជាឆានែល quinone។
គម្លាតនៅក្នុងរង្វិលជុំ LH114-W អនុញ្ញាតឱ្យមានការបង្កើតតំបន់ភ្នាសបន្តរវាងចន្លោះខាងក្នុងនៃស្មុគស្មាញ RC-LH114-W និងភ្នាសភាគច្រើន (រូបភាពទី 1G) ជាជាងការតភ្ជាប់ដែនទាំងពីរតាមរយៈរន្ធប្រូតេអ៊ីនដូចនៅក្នុងប្រូតេអ៊ីន។ ស្មុគស្មាញ RC-LH116 គឺស្រដៀងគ្នាទៅនឹងស្មុគស្មាញ Tch. ដែលបិទជិត (22) (រូបភាពទី 1H)។ ដោយសារតែការសាយភាយនៃគីណូនតាមរយៈភ្នាសគឺលឿនជាងការសាយភាយតាមរយៈឆានែលប្រូតេអ៊ីនតូចចង្អៀត រង្វិលជុំ LH114-W ដែលបើកចំហអាចអនុញ្ញាតឱ្យមានការផ្លាស់ប្តូរ RC លឿនជាងរង្វិលជុំ LH116 ដែលបិទជិត ហើយការសាយភាយនៃគីណូនចូលទៅក្នុង RC អាចត្រូវបានកំណត់ច្រើនជាង។ ដើម្បីសាកល្បងថាតើប្រូតេអ៊ីន W ប៉ះពាល់ដល់ការបំលែងគីណូនតាមរយៈ RC ដែរឬទេ យើងបានអនុវត្តការវិភាគអុកស៊ីតកម្ម cytochrome លើកំហាប់ជាក់លាក់នៃ ubiquinone 2 (UQ2) (អាណាឡូកនៃ UQ10 ធម្មជាតិជាមួយនឹងកន្ទុយ isoprene ខ្លីជាង) (រូបភាពទី 2E)។ ទោះបីជាវត្តមាននៃគីណូនដែលមានជាតិ chelated រារាំងការកំណត់ភាពត្រឹមត្រូវនៃថេរ Michaelis ជាក់ស្តែង (RC-LH114-W និង RC-LH116 គឺសមរម្យសម្រាប់ 0.2±0.1μM និង 0.5±0.2μM រៀងគ្នា) អត្រាអតិបរមានៃ RC-LH114-W (4.6±0.2 e-RC-1 s-1) គឺធំជាង RC-LH116 28±5% (3.6±0.1 e-RC-1 s-1)។
ដំបូងឡើយ យើងបានប៉ាន់ប្រមាណថា ប្រូតេអ៊ីន-W មានវត្តមាននៅក្នុងប្រហែល 10% នៃស្មុគស្មាញស្នូល (16); នៅទីនេះ អត្រាកាន់កាប់នៃកោសិកាលូតលាស់ក្នុងពន្លឺតិច ពន្លឺមធ្យម និងពន្លឺខ្លាំងគឺ 15±0.6%, 11±1% និង 0.9±0.5 រៀងគ្នា % (រូបភាពទី 2F)។ ការប្រៀបធៀបបរិមាណនៃម៉ាសស្ពិចត្រូម៉ែត្រីបានបង្ហាញថា ការបន្ថែមស្លាកហ៊ីស្ទីឌីនមិនបានកាត់បន្ថយភាពសម្បូរបែបដែលទាក់ទងនៃប្រូតេអ៊ីន-W បើប្រៀបធៀបទៅនឹងពូជប្រភេទព្រៃ (P = 0.59) ដូច្នេះកម្រិតទាំងនេះមិនមែនជាវត្ថុបុរាណនៃប្រូតេអ៊ីន-W ដែលបានកែប្រែទេ (រូបភាព S10)។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ ការកាន់កាប់ទាបនៃប្រូតេអ៊ីន-W នេះនៅក្នុងស្មុគស្មាញ RC-LH1 អាចអនុញ្ញាតឱ្យ RC មួយចំនួនត្រឡប់ក្នុងអត្រាកើនឡើង ដោយហេតុនេះកាត់បន្ថយការផ្លាស់ប្តូរ quinone/quinolone យឺតជាងនៅក្នុងស្មុគស្មាញ RC-LH116។ យើងបានកត់សម្គាល់ឃើញថា អត្រាកាន់កាប់ពន្លឺខ្លាំងមិនស៊ីសង្វាក់គ្នាជាមួយនឹងទិន្នន័យ transcriptomics ថ្មីៗទេ ដែលបង្ហាញថាការបញ្ចេញហ្សែន pufW កើនឡើងនៅក្រោមពន្លឺខ្លាំង (រូបភាព S11) (23)។ ភាពខុសគ្នារវាងការចម្លង pufW និងការដាក់បញ្ចូលប្រូតេអ៊ីន-W ទៅក្នុងស្មុគស្មាញ RC-LH1 គឺមានភាពច្របូកច្របល់ ហើយអាចឆ្លុះបញ្ចាំងពីបទប្បញ្ញត្តិស្មុគស្មាញនៃប្រូតេអ៊ីន។
នៅក្នុង RC-LH114-W ម៉ូលេគុល cardiolipin (CDL) ចំនួន 6 ផូស្វាទីឌីលកូលីន (POPC) ចំនួន 7 ផូស្វាទីឌីលគ្លីសេរ៉ុល (POPG) ចំនួន 1 និងម៉ូលេគុល β-DDM ចំនួន 29 ត្រូវបានបែងចែក និងធ្វើគំរូនៅក្នុងវា រួមមាន CDL ចំនួន 6 POPC ចំនួន 24 POPG ចំនួន 2 និង βDDM ចំនួន 12។ RC-LH116 (រូបភាពទី 5, A និង B)។ នៅក្នុងរចនាសម្ព័ន្ធទាំងពីរនេះ CDL ស្ទើរតែស្ថិតនៅផ្នែកស៊ីតូប្លាស្មិកនៃស្មុគស្មាញ ខណៈពេលដែល POPC, POPG និង β-DDM ភាគច្រើនស្ថិតនៅផ្នែកពន្លឺ។ ម៉ូលេគុល lipid និង detergent ចំនួនពីរត្រូវបានញែកដាច់ពីគ្នានៅក្នុងតំបន់ αβ-1 ដល់ αβ-6 នៃស្មុគស្មាញ RC-LH114-W (រូបភាពទី 5A) និងប្រាំត្រូវបានញែកដាច់ពីគ្នានៅក្នុងតំបន់សមមូលនៃ RC-LH116 (រូបភាពទី 5B)។ ជាតិខ្លាញ់ជាច្រើនទៀតត្រូវបានរកឃើញនៅម្ខាងទៀតនៃស្មុគស្មាញ ភាគច្រើនជា CDL ដែលកកកុញរវាង RC និង αβ-7 ដល់ αβ-13 (រូបភាពទី 5, A និង B)។ ជាតិខ្លាញ់ និងសាប៊ូបោកខោអាវដែលមានរចនាសម្ព័ន្ធផ្សេងទៀតមានទីតាំងនៅខាងក្រៅចិញ្ចៀន LH1 ហើយខ្សែសង្វាក់អាស៊ីលីដែលរលាយល្អលាតសន្ធឹងរវាងអនុឯកតា LH1 ដែលត្រូវបានកំណត់ជាបណ្តោះអាសន្នថាជា β-DDM នៅក្នុង RC-LH114-W និងត្រូវបានកំណត់ថាជា β-DDM នៅក្នុង RC ល្បាយនៃ β-DDM និង POPC-LH116។ ទីតាំងស្រដៀងគ្នានៃជាតិខ្លាញ់ និងសាប៊ូបោកខោអាវដែលមានជាតិ chelating នៅក្នុងរចនាសម្ព័ន្ធរបស់យើងបង្ហាញថាពួកវាជាកន្លែងភ្ជាប់ដែលពាក់ព័ន្ធនឹងសរីរវិទ្យា (រូបភាព S12A)។ ទីតាំងនៃម៉ូលេគុលសមមូលនៅក្នុង Tch ក៏មានភាពស៊ីសង្វាក់ល្អផងដែរ។ Gentle និង Trv។ ពូជ 970 RC-LH1s (រូបភាព S12, B ដល់ E) (9, 12) និង​សំណល់​ចំណង​អ៊ីដ្រូសែន​នៃ​ក្រុម​ក្បាល​លីពីត​បាន​បង្ហាញ​ពី​ការ​អភិរក្ស​ល្អ​គួរសម​ក្នុង​ការ​តម្រឹម​លំដាប់ (រូបភាព S13) ដែល​បង្ហាញ​ថា​ការ​អភិរក្ស CDL ដែល​ភ្ជាប់​ទៅ RC (24) កន្លែង​ទាំងនេះ​អាច​នឹង​ត្រូវ​បាន​អភិរក្ស​ក្នុង​ស្មុគស្មាញ RC-LH1។
(A និង B) ប៉ិបទីត RC-LH114-W (A) និង RC-LH116 (B) ត្រូវបានតំណាងដោយរូបតុក្កតា ហើយសារធាតុពណ៌ត្រូវបានតំណាងដោយដំបង ដោយប្រើគ្រោងពណ៌ក្នុងរូបភាពទី 1។ លីពីតត្រូវបានបង្ហាញជាពណ៌ក្រហម ហើយសាប៊ូបោកខោអាវត្រូវបានបង្ហាញជាពណ៌ប្រផេះ។ UQ ដែលភ្ជាប់ទៅនឹងកន្លែង RC QA និង QB មានពណ៌លឿង ខណៈពេលដែល UQ ដាច់ដោយឡែកមានពណ៌ខៀវ។ (C និង D) ទិដ្ឋភាពដូចគ្នានឹង (A) និង (B) ដោយមិនរាប់បញ្ចូលលីពីត។ (E ដល់ G) ទិដ្ឋភាពពង្រីកនៃ Q1(E), Q2(F) និង Q3(G) ពី RC-LH116 ជាមួយនឹងខ្សែសង្វាក់ចំហៀងដែលមានឥទ្ធិពលគ្នាទៅវិញទៅមក។ ចំណងអ៊ីដ្រូសែនត្រូវបានបង្ហាញជាបន្ទាត់ចំនុចពណ៌ខ្មៅ។
នៅក្នុង RC-LH116 ទាំង RC QA និង QB UQ ដែលចូលរួមក្នុងការផ្ទេរអេឡិចត្រុងនៅក្នុងដំណើរការបំបែកបន្ទុក ត្រូវបានរលួយនៅកន្លែងភ្ជាប់របស់វា។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ នៅក្នុង RC-LH114-W គីណូន QB មិនទាន់ត្រូវបានដោះស្រាយនៅឡើយទេ ហើយនឹងត្រូវបានពិភាក្សាលម្អិតខាងក្រោម។ បន្ថែមពីលើគីណូន QA និង QB ម៉ូលេគុល UQ ដែលត្រូវបាន chelated ពីរ (ដែលមានទីតាំងនៅចន្លោះចិញ្ចៀន RC និង LH1) ត្រូវបានបែងចែកនៅក្នុងរចនាសម្ព័ន្ធ RC-LH114-W យោងទៅតាមក្រុមក្បាលដែលត្រូវបានដោះស្រាយយ៉ាងល្អរបស់ពួកវា (ដែលមានទីតាំងនៅ Q1 និង Q2 រៀងៗខ្លួន)។ (រូបភាពទី 5C)។ ឯកតាអ៊ីសូប្រីនពីរត្រូវបានកំណត់ទៅ Q1 ហើយផែនទីដង់ស៊ីតេដោះស្រាយកន្ទុយអ៊ីសូប្រីនទាំង 10 ពេញលេញនៃ Q2។ នៅក្នុងរចនាសម្ព័ន្ធនៃ RC-LH116 ម៉ូលេគុល UQ10 ដែលត្រូវបាន chelated ចំនួនបី (Q1 ដល់ Q3 រូបភាពទី 5D) ត្រូវបានដោះស្រាយ ហើយម៉ូលេគុលទាំងអស់មានដង់ស៊ីតេច្បាស់លាស់ពេញមួយកន្ទុយ (រូបភាពទី 5, D ដល់ G)។ នៅក្នុងរចនាសម្ព័ន្ធទាំងពីរ ទីតាំងនៃក្រុមក្បាលគីណូននៃ Q1 និង Q2 មានភាពស៊ីសង្វាក់គ្នាល្អឥតខ្ចោះ (រូបភាព S12F) ហើយពួកវាមានអន្តរកម្មជាមួយ RC តែប៉ុណ្ណោះ។ Q1 មានទីតាំងនៅច្រកចូលនៃគម្លាត W នៃ RC-LH114-W (រូបភាពទី 1G និង 5, C, D និង E) ហើយ Q2 មានទីតាំងនៅជិតកន្លែងភ្ជាប់ QB (រូបភាពទី 5, C, D) និង F)។ សំណល់ L-Trp143 និង L-Trp269 ដែលរក្សាទុកគឺនៅជិត Q1 និង Q2 ខ្លាំងណាស់ ហើយផ្តល់នូវអន្តរកម្ម π-stacking ដ៏មានសក្តានុពល (រូបភាពទី 5, E និង F និងរូបភាព S12)។ L-Gln88 ចម្ងាយ 3.0 Å ពីអុកស៊ីសែនឆ្ងាយនៃ Q1 ផ្តល់នូវចំណងអ៊ីដ្រូសែនខ្លាំង (រូបភាពទី 5E)។ សំណល់នេះត្រូវបានអភិរក្សនៅក្នុង RC ទាំងអស់លើកលែងតែទំនាក់ទំនងឆ្ងាយបំផុត (រូបភាព S13)។ L-Ser91 ត្រូវបានជំនួសដោយ Thr ដោយអភិរក្សនៅក្នុង RCs ភាគច្រើនផ្សេងទៀត (រូបភាព S13) គឺមានចម្ងាយ 3.8 អង់ស្ត្រូមពីមេទីលអុកស៊ីហ្សែននៃ Q1 ហើយអាចផ្តល់ចំណងអ៊ីដ្រូសែនខ្សោយ (រូបភាព 5E)។ Q3 ហាក់ដូចជាមិនមានអន្តរកម្មជាក់លាក់ទេ ប៉ុន្តែមានទីតាំងនៅតំបន់អ៊ីដ្រូហ្វូប៊ីករវាងអនុឯកតា RC-M និងអនុឯកតា LH1-α 5 ដល់ 6 (រូបភាព 5, D និង G)។ Q1, Q2 និង Q3 ឬគីណូនដែលមានជាតិ chelated នៅក្បែរនោះក៏ត្រូវបានរំលាយនៅក្នុង Tch. Gentle, Trv. Strain 970 និង Blc ផងដែរ។ រចនាសម្ព័ន្ធ iris (9, 10, 12) ចង្អុលទៅកន្លែងភ្ជាប់គីណូនជំនួយដែលបានអភិរក្សនៅក្នុងស្មុគស្មាញ RC-LH1 (រូបភាព S12G)។ UQ ដែល​រលួយ​ទាំង​ប្រាំ​នៅ​ក្នុង RC-LH116 គឺ​ស្រប​គ្នា​យ៉ាង​ល្អ​ជាមួយ 5.8±0.7 នៃ​ស្មុគស្មាញ​នីមួយៗ​ដែល​កំណត់​ដោយ​វិធីសាស្ត្រ​ក្រូម៉ាតូក្រាហ្វី​រាវ​ដំណើរការ​ខ្ពស់ (HPLC) ខណៈ​ដែល UQ ដែល​រលួយ​ទាំង​បី​នៅ​ក្នុង RC-LH114-W គឺ​ទាប​ជាង​តម្លៃ​ដែល​វាស់​បាន 6.2±0.3 (រូបភាព S14) បង្ហាញ​ថា​មាន​ម៉ូលេគុល UQ ដែល​មិន​ទាន់​ដោះស្រាយ​នៅ​ក្នុង​រចនាសម្ព័ន្ធ។
ប៉ូលីប៉ិបទីត L និង M ដែលមានស៊ីមេទ្រីក្លែងក្លាយនីមួយៗមាន TMH ចំនួនប្រាំ ហើយបង្កើតជា heterodimer ដែលរួមបញ្ចូលគ្នានូវ dimer BChl មួយ ម៉ូណូម័រ BChl ពីរ ម៉ូណូម័រ bacteriophage (BPh) ពីរ និងជាតិដែកមិនមែន Heme មួយ និងម៉ូលេគុល UQ10 មួយ ឬពីរ។ តាមរយៈវត្តមាននៃចំណងអ៊ីដ្រូសែននៅលើក្រុម ketone ចុងក្រោយ និងការប្រមូលផ្តុំដែលគេស្គាល់របស់វានៅក្នុង Rps ការ៉ូទីណូអ៊ីតត្រូវបានបញ្ចូលទៅក្នុងអនុឯកតា M ដែលត្រូវបានគេដាក់ឈ្មោះថា cis-3,4-dehydroorhodopin។ ប្រភេទ (25)។ ដែនភ្នាសខាងក្រៅរបស់ RC-H ត្រូវបានភ្ជាប់ទៅនឹងភ្នាសដោយ TMH តែមួយ។ រចនាសម្ព័ន្ធ RC ទាំងមូលគឺស្រដៀងគ្នាទៅនឹងអនុឯកតា RC ទាំងបីនៃប្រភេទដែលពាក់ព័ន្ធ (ដូចជា Rba)។ sphaeroides (PDB ID: 3I4D)។ ម៉ាក្រូស៊ីកនៃ BChl និង BPh ដែលជាឆ្អឹងខ្នងការ៉ូទីណូអ៊ីត និងជាតិដែកមិនមែន heme ត្រួតស៊ីគ្នានៅក្នុងជួរគុណភាពបង្ហាញនៃរចនាសម្ព័ន្ធទាំងនេះ ដូចជាក្រុមក្បាល UQ10 នៅកន្លែង QA និង QB quinone នៅ RC-LH116 (រូបភាព S15)។
ភាពអាចរកបាននៃរចនាសម្ព័ន្ធ RC ពីរដែលមានអត្រាកាន់កាប់ទីតាំង QB ខុសៗគ្នាផ្តល់នូវឱកាសថ្មីមួយដើម្បីពិនិត្យមើលការផ្លាស់ប្តូររចនាសម្ព័ន្ធដែលស៊ីសង្វាក់គ្នាដែលអមជាមួយនឹងការភ្ជាប់ quinone QB។ នៅក្នុងស្មុគស្មាញ RC-LH116 quinone QB មានទីតាំងស្ថិតនៅក្នុងទីតាំង "proximal" ដែលចងភ្ជាប់យ៉ាងពេញលេញ (26) ប៉ុន្តែការបំបែក RC-LH114-W មិនមាន quinone QB ទេ។ មិនមាន quinone QB នៅក្នុង RC-LH114-W ទេ ដែលជារឿងគួរឱ្យភ្ញាក់ផ្អើលព្រោះស្មុគស្មាញនេះសកម្មជាងស្មុគស្មាញ RC-LH116 ដែលមាន quinone QB ដែលដោះស្រាយតាមរចនាសម្ព័ន្ធ។ ទោះបីជាចិញ្ចៀន LH1 ទាំងពីរ chelate ប្រហែលប្រាំមួយ quinones ក៏ដោយ ប្រាំត្រូវបានដោះស្រាយតាមរចនាសម្ព័ន្ធនៅក្នុងចិញ្ចៀន RC-LH116 ដែលបិទ ខណៈពេលដែលមានតែបីប៉ុណ្ណោះដែលត្រូវបានកំណត់រចនាសម្ព័ន្ធនៅក្នុងចិញ្ចៀន RC-LH114-W ដែលបើកចំហ។ ភាពមិនប្រក្រតីនៃរចនាសម្ព័ន្ធដែលកើនឡើងនេះអាចឆ្លុះបញ្ចាំងពីការជំនួសលឿនជាងមុននៃទីតាំង QB RC-LH114-W ចលនវិទ្យា quinone លឿនជាងមុននៅក្នុងស្មុគស្មាញ និងលទ្ធភាពកើនឡើងនៃការឆ្លងកាត់រង្វិលជុំ LH1។ យើងស្នើថា កង្វះ UQ នៅក្នុងទីតាំង RC QB នៃ RC-LH114-W អាចជាលទ្ធផលនៃស្មុគស្មាញដែលស្មុគស្មាញ និងសកម្មជាងមុន ហើយទីតាំង QB នៃ RC-LH114-W ត្រូវបានកកភ្លាមៗនៅក្នុងវេន UQ។ ដំណាក់កាលជាក់លាក់ (ច្រកចូលទៅកាន់ទីតាំង QB ត្រូវបានបិទ) ឆ្លុះបញ្ចាំងពីការកំណត់រចនាសម្ព័ន្ធនៃសកម្មភាពនេះ។
បើគ្មាន QB ទេ ការបង្វិលដែលភ្ជាប់មកជាមួយនៃ L-Phe217 ទៅកាន់ទីតាំងដែលមិនឆបគ្នាជាមួយនឹងការចង UQ10 ពីព្រោះវានឹងបណ្តាលឱ្យមានការប៉ះទង្គិចគ្នានៃលំហជាមួយឯកតាអ៊ីសូប្រីនដំបូងនៃកន្ទុយ (រូបភាពទី 6A)។ លើសពីនេះ ការផ្លាស់ប្តូររចនាសម្ព័ន្ធសំខាន់ៗជាក់ស្តែងគឺជាក់ស្តែង ជាពិសេស helix de (helix ខ្លីនៅក្នុងរង្វិលជុំរវាង TMH D និង E) ដែល L-Phe217 ត្រូវបានផ្លាស់ប្តូរទៅហោប៉ៅចង QB និងការបង្វិលនៃ L-Tyr223 (រូបភាពទី 6A) ដើម្បីបំបែកចំណងអ៊ីដ្រូសែនជាមួយនឹងក្របខ័ណ្ឌ M-Asp45 និងបិទច្រកចូលនៃកន្លែងចង QB (រូបភាពទី 6B)។ Helix de pivots នៅមូលដ្ឋានរបស់វា Cα នៃ L-Ser209 ត្រូវបានផ្លាស់ប្តូរដោយ 0.33Å ខណៈពេលដែល L-Val221Cα ត្រូវបានផ្លាស់ប្តូរដោយ 3.52Å។ មិនមានការផ្លាស់ប្តូរដែលអាចសង្កេតឃើញនៅក្នុង TMH D និង E ដែលអាចត្រួតលើគ្នានៅក្នុងរចនាសម្ព័ន្ធទាំងពីរ (រូបភាពទី 6A)។ តាមដែលយើងដឹង នេះគឺជារចនាសម្ព័ន្ធដំបូងនៅក្នុង RC ធម្មជាតិដែលបិទទីតាំង QB។ ការប្រៀបធៀបជាមួយនឹងរចនាសម្ព័ន្ធពេញលេញ (ចង QB) បង្ហាញថាមុនពេលគីណូនត្រូវបានកាត់បន្ថយ ការផ្លាស់ប្តូររចនាសម្ព័ន្ធត្រូវបានទាមទារដើម្បីធ្វើឱ្យវាចូលទៅក្នុងគីណូន។ L-Phe217 បង្វិលដើម្បីបង្កើតអន្តរកម្ម π-stacking ជាមួយក្រុមក្បាលគីណូន ហើយវង់រំកិលទៅខាងក្រៅ ដែលអនុញ្ញាតឱ្យគ្រោងឆ្អឹងរបស់ L-Gly222 និងខ្សែសង្វាក់ចំហៀងរបស់ L-Tyr223 បង្កើតជាបណ្តាញចំណងអ៊ីដ្រូសែនដែលមានរចនាសម្ព័ន្ធចំណងអ៊ីដ្រូសែនដែលមានស្ថេរភាព (រូបភាពទី 6, A និង C)។
(ក) រូបគំនូរតុក្កតាត្រួតស៊ីគ្នានៃរចនាសម្ព័ន្ធហូឡូក្រាម (ខ្សែសង្វាក់ L ខ្សែសង្វាក់ពណ៌ទឹកក្រូច/ខ្សែសង្វាក់ M ពណ៌ស្វាយ) និងរចនាសម្ព័ន្ធ apo (ពណ៌ប្រផេះ) ដែលសំណល់សំខាន់ៗត្រូវបានបង្ហាញក្នុងទម្រង់ជាតំណាងដូចដំបង។ UQ10 ត្រូវបានតំណាងដោយរបារពណ៌លឿង។ បន្ទាត់ចំនុចបង្ហាញពីចំណងអ៊ីដ្រូសែនដែលបង្កើតឡើងនៅក្នុងរចនាសម្ព័ន្ធទាំងមូល។ (ខ និង គ) ការតំណាងផ្ទៃនៃប្រូតេអ៊ីន apolipoprotein និងរចនាសម្ព័ន្ធរង្វង់ទាំងមូល ដោយបន្លិចអុកស៊ីហ្សែនខ្សែសង្វាក់ចំហៀងនៃ L-Phe217 ជាពណ៌ខៀវ និង L-Tyr223 ជាពណ៌ក្រហមរៀងៗខ្លួន។ អនុឯកតា L មានពណ៌ទឹកក្រូច; អនុឯកតា M និង H មិនមានពណ៌ទេ។ (ឃ និង ង) ប្រូតេអ៊ីន Apolipoprotein (ឃ) និងកន្លែង RC QB ទាំងមូល (អ) [ពណ៌តាម (ក) រៀងៗខ្លួន] និង Thermophilus thermophilus PSII (ពណ៌បៃតង ខៀវជាមួយ quinone ប្លាស្ទិក; លេខសម្គាល់ PDB៖ 3WU2) តម្រឹម (58)។
ដោយមិននឹកស្មានដល់ ទោះបីជាមានរចនាសម្ព័ន្ធជាច្រើននៃ RC ដែលខ្វះ QB ដោយគ្មាន LH1 ក៏ដោយ ក៏ការផ្លាស់ប្តូររចនាសម្ព័ន្ធដែលសង្កេតឃើញនៅក្នុងការសិក្សានេះមិនធ្លាប់ត្រូវបានរាយការណ៍ពីមុនមកទេ។ ទាំងនេះរួមមានរចនាសម្ព័ន្ធការថយចុះ QB ពី Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) និង Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29) ដែលទាំងអស់នេះស្ទើរតែដូចគ្នាទៅនឹងរចនាសម្ព័ន្ធ QB ទាំងមូលរបស់វា។ ការត្រួតពិនិត្យយ៉ាងដិតដល់នៃ 3PRC បានបង្ហាញថាម៉ូលេគុលសាប៊ូបោកខោអាវ LDAO (Lauryl Dimethyl Amine Oxide) ចងនៅច្រកចូលនៃទីតាំង QB ដែលអាចការពារការរៀបចំឡើងវិញទៅជារចនាសម្ព័ន្ធបិទជិត។ ទោះបីជា LDAO មិនរលួយនៅទីតាំងដូចគ្នានៅក្នុង 1EYS ឬ 1OGV ក៏ដោយ RCs ទាំងនេះត្រូវបានរៀបចំដោយប្រើសាប៊ូបោកខោអាវដូចគ្នា ហើយដូច្នេះអាចបង្កើតឥទ្ធិពលដូចគ្នា។ រចនាសម្ព័ន្ធគ្រីស្តាល់របស់ Rba។ ស្ពែរអៃដ៍ RC ដែល​បាន​ធ្វើ​គ្រីស្តាល់​រួមគ្នា​ជាមួយ​ស៊ីតូក្រូម c2 (PDB ID: 1L9B) ក៏ហាក់ដូចជាមានកន្លែង QB បិទជិតដែរ។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ ក្នុងករណីនេះ តំបន់ចុង N នៃប៉ូលីប៉ិបទីត RC-M (ដែលធ្វើអន្តរកម្មជាមួយកន្លែងចង QB តាមរយៈចំណង H នៃសំណល់ Tyr នៅលើវង់ Q) ទទួលយករចនាសម្ព័ន្ធមិនធម្មតា ហើយការផ្លាស់ប្តូររចនាសម្ព័ន្ធ QB មិនត្រូវបានស្វែងយល់បន្ថែមទៀតទេ (30)។ អ្វីដែលធានាបាននោះគឺថា យើងមិនបានឃើញការខូចទ្រង់ទ្រាយប្រភេទនេះនៃប៉ូលីប៉ិបទីត M នៅក្នុងរចនាសម្ព័ន្ធ RC-LH114-W ដែលស្ទើរតែដូចគ្នាទៅនឹងតំបន់ចុង N នៃ RC-LH116 RC នោះទេ។ គួរកត់សម្គាល់ផងដែរថា បន្ទាប់ពីការលុបបំបាត់អង់តែន LH1 ដែលមានមូលដ្ឋានលើសាប៊ូបោកខោអាវ RCs apolipoprotein នៅក្នុង PDB ត្រូវបានដោះស្រាយ ដែលបានលុបបំបាត់អាងគីណូនខាងក្នុង និងជាតិខ្លាញ់នៅក្នុងគម្លាតរវាង RC និងផ្ទៃខាងក្នុងនៃចិញ្ចៀន LH1 ជុំវិញ (31, 32)។ RC នៅតែដំណើរការបាន ពីព្រោះវារក្សាបាននូវសហកត្តាទាំងអស់ លើកលែងតែ quinone QB ដែលអាចរលួយបាន ដែលមិនសូវមានស្ថេរភាព ហើយជារឿយៗបាត់បង់ក្នុងអំឡុងពេលដំណើរការរៀបចំ (33)។ លើសពីនេះ វាត្រូវបានគេដឹងថា ការដកយក LH1 និងជាតិខ្លាញ់វដ្តធម្មជាតិចេញពី RC អាចមានផលប៉ះពាល់ដល់មុខងារ ដូចជាអាយុកាលខ្លីនៃស្ថានភាព P+QB ដែលបំបែកដោយបន្ទុក (31, 34, 35)។ ដូច្នេះ យើងសន្និដ្ឋានថា អត្ថិភាពនៃរង្វង់ LH1 ក្នុងស្រុកដែលព័ទ្ធជុំវិញ RC អាចរក្សាបាននូវទីតាំង QB "បិទ" ដោយហេតុនេះរក្សាបរិស្ថានក្នុងស្រុកនៅជិត QB។
ទោះបីជា apolipoprotein (ដោយគ្មាន QB quinone) និងរចនាសម្ព័ន្ធពេញលេញតំណាងឱ្យតែរូបថតពីរនៃការផ្លាស់ប្តូរទីតាំង QB ក៏ដោយ ជាជាងស៊េរីនៃព្រឹត្តិការណ៍ មានការចង្អុលបង្ហាញថាការចងអាចត្រូវបានបិទបាំងដើម្បីការពារការចងឡើងវិញដោយ hydroquinone ដើម្បីរារាំងការរារាំងស្រទាប់ខាងក្រោម។ អន្តរកម្មនៃ quinolol និង quinone នៅជិតទីតាំង QB នៃ apolipoprotein អាចខុសគ្នា ដែលនាំឱ្យវាត្រូវបានបដិសេធដោយ RC។ វាត្រូវបានគេស្នើឡើងជាយូរមកហើយថាការផ្លាស់ប្តូររចនាសម្ព័ន្ធដើរតួនាទីក្នុងការចង និងការកាត់បន្ថយ quinones។ សមត្ថភាពរបស់ RCs កកក្នុងការកាត់បន្ថយ quinones បន្ទាប់ពីការសម្របខ្លួនងងឹតត្រូវបានចុះខ្សោយ (36); គ្រីស្តាល់កាំរស្មីអ៊ិចបង្ហាញថាការខូចខាតនេះគឺដោយសារតែ quinones QB ត្រូវបានជាប់នៅក្នុងរចនាសម្ព័ន្ធ "ឌីស្តាល់" ប្រហែល 4.5 Å ពីទីតាំងប្រូកស៊ីម៉ាល់សកម្ម (26), 37)។ យើងស្នើថាការរចនាសម្ព័ន្ធចងឌីស្តាល់នេះគឺជារូបថតនៃស្ថានភាពមធ្យមរវាង apolipoprotein និងរចនាសម្ព័ន្ធចិញ្ចៀនពេញលេញ ដែលធ្វើតាមអន្តរកម្មដំបូងជាមួយ quinone និងការបើកទីតាំង QB។
ប្រភេទទី II RC ដែលត្រូវបានរកឃើញនៅក្នុងស្មុគស្មាញ PSII នៃបាក់តេរី phototrophic និង cyanobacteria សារាយ និងរុក្ខជាតិមួយចំនួនមានការអភិរក្សរចនាសម្ព័ន្ធ និងមុខងារ (38)។ ការតម្រឹមរចនាសម្ព័ន្ធដែលបង្ហាញក្នុងរូបភាពទី 6 (D និង E) សង្កត់ធ្ងន់លើភាពស្រដៀងគ្នារវាង PSII RCs និងទីតាំង QB នៃស្មុគស្មាញ RC បាក់តេរី។ ការប្រៀបធៀបនេះគឺជាគំរូសម្រាប់សិក្សាពីប្រព័ន្ធដែលទាក់ទងគ្នាយ៉ាងជិតស្និទ្ធនៃការចង និងកាត់បន្ថយ quinone។ ការបោះពុម្ពផ្សាយពីមុនបានបង្ហាញថាការផ្លាស់ប្តូររចនាសម្ព័ន្ធត្រូវបានអមដោយការកាត់បន្ថយ PSII នៃ quinones (39, 40)។ ដូច្នេះ ដោយពិចារណាលើការអភិរក្សវិវត្តនៃ RC យន្តការចងដែលមិនធ្លាប់មានការសង្កេតពីមុននេះក៏អាចអនុវត្តបានចំពោះទីតាំង QB នៃ PSII RC នៅក្នុងរុក្ខជាតិ phototrophic ដែលមានអុកស៊ីសែន។
Rps ΔpufW (ការលុប pufW ដែលមិនមានស្លាក) និង PufW-His (C-terminal 10x His-tagged protein-W ដែលបង្ហាញចេញពីពូជ pufW locus ធម្មជាតិ)។ palustris CGA009 ត្រូវបានពិពណ៌នានៅក្នុងការងារមុនរបស់យើង (16)។ ពូជទាំងនេះ និងមេប្រភេទព្រៃអ៊ីសូហ្សែនត្រូវបានរកឃើញពីទូរបង្កកដោយការលាបកោសិកាមួយចំនួនតូចលើចាន PYE (នីមួយៗ 5 ក្រាមលីត្រ -1) (រក្សាទុកក្នុង LB នៅសីតុណ្ហភាព -80 °C ដែលមានប្រូតេអ៊ីនគ្លីសេរ៉ុល 50% (w/v) សារធាតុចម្រាញ់ពីដំបែ និង succinate) agar [1.5% (w/v)]។ ចាននេះត្រូវបានភ្ញាស់ពេញមួយយប់ក្នុងទីងងឹតនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់ក្រោមលក្ខខណ្ឌអាណាអេរ៉ូប៊ីក ហើយបន្ទាប់មកបំភ្លឺដោយពន្លឺពណ៌ស (~50 μmolm-2 s-1) ដែលផ្តល់ដោយអំពូល halogen OSRAM 116-W (RS Components, UK) រយៈពេល 3 ទៅ 5 ថ្ងៃរហូតដល់អាណានិគមតែមួយលេចឡើង។ អាណានិគមតែមួយត្រូវបានប្រើដើម្បីចាក់បញ្ចូលឧបករណ៍ផ្ទុក M22+ ចំនួន 10 មីលីលីត្រ (41) ដែលបានបន្ថែមជាមួយអាស៊ីត casamino 0.1% (w/v) (តទៅនេះហៅថា M22)។ វប្បធម៌ត្រូវបានដាំដុះក្រោមលក្ខខណ្ឌអុកស៊ីសែនទាបនៅក្នុងទីងងឹតនៅសីតុណ្ហភាព 34°C ជាមួយនឹងការអង្រួននៅ 180 rpm រយៈពេល 48 ម៉ោង ហើយបន្ទាប់មកវប្បធម៌ចំនួន 70 មីលីលីត្រត្រូវបានចាក់បញ្ចូលក្រោមលក្ខខណ្ឌដូចគ្នារយៈពេល 24 ម៉ោង។ វប្បធម៌ពាក់កណ្តាលអេរ៉ូប៊ិកដែលមានបរិមាណ 1 មីលីលីត្រត្រូវបានប្រើដើម្បីចាក់បញ្ចូលឧបករណ៍ផ្ទុក M22 ចំនួន 30 មីលីលីត្រក្នុងដបកែវថ្លាដែលមានគម្របវីសជាសកលទំហំ 30 មីលីលីត្រ ហើយត្រូវបានបញ្ចេញដោយវិធីកូរ (~50μmolm-2 s-1) រយៈពេល 48 ម៉ោងដោយកម្លាំងម៉ាញេទិកមាប់មគ។ បន្ទាប់មកវប្បធម៌ចំនួន 30 មីលីលីត្រត្រូវបានចាក់បញ្ចូលជាមួយនឹងវប្បធម៌ប្រហែល 1 លីត្រក្រោមលក្ខខណ្ឌដូចគ្នា ដែលបន្ទាប់មកត្រូវបានប្រើដើម្បីចាក់បញ្ចូលវប្បធម៌ប្រហែល 9 លីត្រដែលបំភ្លឺនៅ ~200 μmolm-2 s-1 រយៈពេល 72 ម៉ោង។ កោសិកាត្រូវបានប្រមូលផលដោយការបង្វិលនៅ 7132 RCF រយៈពេល 30 នាទី រំលាយឡើងវិញក្នុងប្រហែល 10 មីលីលីត្រនៃ 20 mM tris-HCl (pH 8.0) ហើយរក្សាទុកនៅសីតុណ្ហភាព -20°C រហូតដល់ត្រូវការ។
បន្ទាប់ពីរលាយរួច សូមបន្ថែមគ្រីស្តាល់មួយចំនួននៃ deoxyribonuclease I (Merck, UK) lysozyme (Merck, UK) និងថ្នាំគ្រាប់ Roche holoenzyme protease inhibitor ចំនួនពីរគ្រាប់ (Merck, UK) ទៅក្នុងកោសិកាដែលបានរំលាយឡើងវិញ។ នៅក្នុងកោសិកាសម្ពាធបារាំង 20,000 psi (Aminco, USA) កោសិកាត្រូវបានបំបែក 8 ទៅ 12 ដង។ បន្ទាប់ពីយកកោសិកាដែលមិនទាន់បាក់ និងកំទេចកំទីដែលមិនរលាយចេញដោយការបង្វិលនៅ 18,500 RCF រយៈពេល 15 នាទីនៅសីតុណ្ហភាព 4°C ភ្នាសត្រូវបានធ្លាក់ចេញពី lysate ដែលមានសារធាតុពណ៌ដោយការបង្វិលនៅ 113,000 RCF រយៈពេល 2 ម៉ោងនៅសីតុណ្ហភាព 43,000°C។ បោះចោលប្រភាគរលាយ ហើយរំលាយភ្នាសពណ៌ឡើងវិញក្នុង 20 mM tris-HCl (pH 8.0) ចំនួន 100 ទៅ 200 មីលីលីត្រ ហើយធ្វើឱ្យដូចគ្នារហូតដល់មិនមានសារធាតុផ្សំដែលអាចមើលឃើញ។ ភ្នាស​ព្យួរ​ត្រូវ​បាន​ភ្ញាស់​ក្នុង 20 mM tris-HCl (pH 8.0) (Anatrace, USA) ដែល​មាន 2% (w/v) β-DDM រយៈពេល 1 ម៉ោង​ក្នុង​ទីងងឹត​នៅសីតុណ្ហភាព 4°C ដោយ​កូរ​ថ្នមៗ។ បន្ទាប់មក​បង្វិល​ក្នុង​ម៉ាស៊ីន​បង្វិល​នៅសីតុណ្ហភាព 70°C ដើម្បី​រំលាយ 150,000 RCF នៅ 4°C រយៈពេល 1 ម៉ោង ដើម្បី​យក​សារធាតុ​មិន​រលាយ​ដែល​នៅ​សេសសល់​ចេញ។
ភ្នាសរំលាយពីពូជ ΔpufW ត្រូវបានអនុវត្តទៅលើជួរឈរផ្លាស់ប្តូរអ៊ីយ៉ុង DEAE Sepharose 50 មីលីលីត្រ ដែលមានបរិមាណជួរឈរបី (CV) នៃសារធាតុចង [20 mM tris-HCl (pH 8.0) ដែលមានផ្ទុក 0.03% (w / v) β-DDM]។ លាងសម្អាតជួរឈរជាមួយនឹងសារធាតុចង CV ពីរ ហើយបន្ទាប់មកលាងសម្អាតជួរឈរជាមួយនឹងសារធាតុចងពីរដែលមានផ្ទុក 50 mM NaCl។ ស្មុគស្មាញ RC-LH116 ត្រូវបាន eluted ជាមួយនឹងជម្រាលលីនេអ៊ែរពី 150 ទៅ 300 mM NaCl (នៅក្នុងសារធាតុចង) លើ 1.75 CV ហើយស្មុគស្មាញចងដែលនៅសល់ត្រូវបាន eluted ជាមួយនឹងសារធាតុចងដែលមានផ្ទុក 300 mM NaCl លើ 0.5 CV។ ប្រមូលវិសាលគមស្រូបយករវាង 250 និង 1000 nm រក្សាប្រភាគដែលមានសមាមាត្រស្រូបយក (A880/A280) ធំជាង 1 នៅ 880 ដល់ 280 nm ពនលាយវាពីរដងក្នុងសារធាតុចង ហើយប្រើនីតិវិធីដូចគ្នាម្តងទៀតនៅលើជួរឈរ DEAE ស្តីពីការបន្សុទ្ធ។ ពនលាយប្រភាគដែលមានសមាមាត្រ A880/A280 ខ្ពស់ជាង 1.7 និងសមាមាត្រ A880/A805 ខ្ពស់ជាង 3.0 អនុវត្តជុំទីបីនៃការផ្លាស់ប្តូរអ៊ីយ៉ុង និងរក្សាប្រភាគដែលមានសមាមាត្រ A880/A280 ខ្ពស់ជាង 2.2 និងសមាមាត្រ A880/A805 ខ្ពស់ជាង 5.0។ ស្មុគស្មាញ​ដែល​បាន​បន្សុទ្ធ​ដោយ​ផ្នែក​ត្រូវ​បាន​ប្រមូលផ្តុំ​ដល់ ~2 ml ក្នុង​តម្រង centrifugal Amicon 100,000 ទម្ងន់​ម៉ូលេគុល​កាត់​ផ្តាច់ (MWCO) (Merck, UK) ហើយ​ផ្ទុក​លើ​ជួរឈរ​ដក​ទំហំ Superdex 200 16/600 (GE Healthcare, US) ដែល​មាន​សារធាតុ​រាវ NaCl 200 mM ហើយ​បន្ទាប់​មក​បាន​បញ្ចេញ​ក្នុង​សារធាតុ​រាវ​ដូចគ្នា​នៅ 1.5 CV។ ប្រមូល​វិសាលគម​ស្រូប​យក​នៃ​ប្រភាគ​ដក​ទំហំ ហើយ​ប្រមូលផ្តុំ​វិសាលគម​ស្រូប​យក​ជាមួយ​សមាមាត្រ A880/A280 លើស​ពី 2.4 និង​សមាមាត្រ A880/A805 លើស​ពី 5.8 ដល់ 100 A880 ហើយ​ប្រើ​វា​ភ្លាមៗ​សម្រាប់​ការ​រៀបចំ​ក្រឡាចត្រង្គ cryo-TEM ឬ​ការ​ផ្ទុក។ ទុក​នៅ -80°C រហូត​ដល់​ត្រូវការ។
ភ្នាសរំលាយពីពូជ PufW-His ត្រូវបានអនុវត្តទៅលើជួរឈរ HisPrep FF Ni-NTA Sepharose 20 មីលីលីត្រ (20 mM tris-HCl (pH 8.0) ដែលមានផ្ទុក 200 mM NaCl និង 0.03% (w/w)) នៅក្នុងសារធាតុ IMAC buffer (GE Healthcare)។ v) β-DDM]។ ជួរឈរត្រូវបានលាងសម្អាតជាមួយនឹងសារធាតុ IMAC CVs ចំនួនប្រាំ ហើយបន្ទាប់មកជាមួយនឹងសារធាតុ IMAC CVs ចំនួនប្រាំដែលមានផ្ទុក histidine 10 mM។ ស្មុគស្មាញស្នូលត្រូវបានយកចេញពីជួរឈរជាមួយនឹងសារធាតុ IMAC buffer ចំនួនប្រាំដែលមានផ្ទុក histidine 100 mM។ ប្រភាគដែលមានស្មុគស្មាញ RC-LH114-W ត្រូវបានប្រមូលផ្តុំដល់ ~10 មីលីលីត្រនៅក្នុងធុងកូរដែលបំពាក់ដោយតម្រង Amicon 100,000 MWCO (Merck, UK) ពនលាយ 20 ដងជាមួយនឹងសារធាតុ binding buffer ហើយបន្ទាប់មកបន្ថែមទៅ 25 មីលីលីត្រ។ នៅក្នុងជួរឈរ DEAE Sepharose សមាសធាតុ CVs ចំនួនបួនដែលភ្ជាប់ទៅនឹងសារធាតុ buffer ត្រូវបានប្រើប្រាស់ជាមុន។ លាងសម្អាតជួរឈរជាមួយនឹងសារធាតុរក្សាលំនឹង CV ចំនួនបួន បន្ទាប់មក elute complex លើ CV ចំនួនប្រាំបីលើជម្រាលលីនេអ៊ែរពី 0 ទៅ 100 mM NaCl (នៅក្នុងសារធាតុរក្សាលំនឹង) និង CV ចំនួនបួនដែលនៅសល់ដែលមានសារធាតុរក្សាលំនឹង 100 mM។ ស្មុគស្មាញដែលនៅសល់ដែលត្រូវបាន elute លើសូដ្យូមក្លរួ រួមផ្សំជាមួយនឹងសមាមាត្រ A880/A280 ខ្ពស់ជាង 2.4 និងសមាមាត្រ A880/A805 ខ្ពស់ជាង 4.6 ប្រភាគត្រូវបានប្រមូលផ្តុំដល់ ~2 ml នៅក្នុងតម្រង centrifugal Amicon 100,000 MWCO ហើយបំពេញដោយ IMAC 1.5 CV ជាមុន។ សារធាតុរក្សាលំនឹង Superdex 200 16/600 ជួរឈរដកចេញទំហំ ហើយបន្ទាប់មក elute ក្នុងសារធាតុរក្សាលំនឹងដូចគ្នាលើ 1.5 CV។ ប្រមូលវិសាលគមស្រូបយកនៃប្រភាគទំហំ-ការដកចេញ ហើយប្រមូលផ្តុំវិសាលគមស្រូបយកជាមួយនឹងសមាមាត្រ A880/A280 លើសពី 2.1 និងសមាមាត្រ A880/A805 លើសពី 4.6 ដល់ 100 A880 ដែលត្រូវបានប្រើភ្លាមៗសម្រាប់ការរៀបចំក្រឡាចត្រង្គ TEM កក ឬរក្សាទុកនៅសីតុណ្ហភាព -80°C រហូតដល់ត្រូវការ។
ទូរទឹកកក Leica EM GP ត្រូវបានប្រើដើម្បីរៀបចំក្រឡាចត្រង្គ TEM សីតុណ្ហភាពទាប។ ស្មុគស្មាញនេះត្រូវបានពនលាយក្នុងសារធាតុ IMAC buffer ដល់ A880 ចំនួន 50 ហើយបន្ទាប់មក 5μl ត្រូវបានផ្ទុកទៅលើសំណាញ់ទង់ដែងស្រោបដោយកាបូន QUANTIFOIL 1.2/1.3 ដែលទើបបញ្ចេញពន្លឺថ្មី (Agar Scientific, UK)។ ភ្ញាស់ក្រឡាចត្រង្គនៅសីតុណ្ហភាព 20°C និងសំណើមដែលទាក់ទង 60% រយៈពេល 30 វិនាទី បន្ទាប់មកជូតវាឱ្យស្ងួតរយៈពេល 3 វិនាទី ហើយបន្ទាប់មកពន្លត់វាក្នុងអេតានរាវនៅ -176°C។
ទិន្នន័យនៃស្មុគស្មាញ RC-LH114-W ត្រូវបានកត់ត្រានៅលើ eBIC (មជ្ឈមណ្ឌលរូបភាពជីវអេឡិចត្រូនិក) (ប្រភពពន្លឺពេជ្រអង់គ្លេស) ជាមួយមីក្រូទស្សន៍ Titan Krios ដែលដំណើរការនៅវ៉ុលបង្កើនល្បឿន 300kV ជាមួយនឹងការពង្រីកនាមករណ៍ 130,000× និងថាមពលនៃ - ជ្រើសរើសគម្លាត 20 eV។ ឧបករណ៍ចាប់សញ្ញាកំពូល Gatan 968 GIF Quantum ជាមួយឧបករណ៍ចាប់សញ្ញាកំពូល K2 ត្រូវបានប្រើដើម្បីថតរូបភាពក្នុងរបៀបរាប់ដើម្បីប្រមូលទិន្នន័យ។ ទំហំភីកសែលដែលបានក្រិតតាមខ្នាតគឺ 1.048Å និងអត្រាដូសគឺ 3.83 e-Å-2s-1។ បានប្រមូលខ្សែភាពយន្តក្នុងរយៈពេល 11 វិនាទី ហើយចែកវាជា 40 ផ្នែក។ ប្រើតំបន់ស្រោបដោយកាបូនដើម្បីផ្តោតឡើងវិញនូវមីក្រូទស្សន៍ ហើយបន្ទាប់មកប្រមូលខ្សែភាពយន្តចំនួនបីក្នុងមួយរន្ធ។ សរុបមក ខ្សែភាពយន្តចំនួន 3130 ត្រូវបានប្រមូល ជាមួយនឹងតម្លៃផ្ដេករវាង -1 និង -3μm។
ទិន្នន័យសម្រាប់ស្មុគស្មាញ RC-LH116 ត្រូវបានប្រមូលដោយប្រើមីក្រូទស្សន៍ដូចគ្នានៅមន្ទីរពិសោធន៍ Asterbury Biostructure (សាកលវិទ្យាល័យ Leeds ចក្រភពអង់គ្លេស)។ ទិន្នន័យត្រូវបានប្រមូលក្នុងរបៀបរាប់ជាមួយនឹងការពង្រីក 130 k ហើយទំហំភីកសែលត្រូវបានក្រិតតាមខ្នាតទៅ 1.065 Å ជាមួយនឹងកម្រិត 4.6 e-Å-2s-1។ ខ្សែភាពយន្តនេះត្រូវបានថតក្នុងរយៈពេល 12 វិនាទី និងបែងចែកជា 48 ផ្នែក។ សរុបមក ខ្សែភាពយន្តចំនួន 3359 ត្រូវបានប្រមូល ជាមួយនឹងតម្លៃផ្ដេករវាង -1 និង -3μm។
ដំណើរការទិន្នន័យទាំងអស់ត្រូវបានអនុវត្តនៅក្នុងបំពង់ Relion 3.0 (42)។ ប្រើ Motioncorr 2 (43) ដើម្បីកែតម្រូវចលនាធ្នឹមដោយការកំណត់ទម្ងន់កម្រិតថ្នាំ ហើយបន្ទាប់មកប្រើ CTFFIND 4.1 (44) ដើម្បីកំណត់ប៉ារ៉ាម៉ែត្រ CTF (អនុគមន៍ផ្ទេរកម្រិតពណ៌)។ រូបថតមីក្រូទស្សន៍ធម្មតាបន្ទាប់ពីដំណាក់កាលដំណើរការដំបូងទាំងនេះត្រូវបានបង្ហាញក្នុងរូបភាពទី 2។ S16។ គំរូជ្រើសរើសដោយស្វ័យប្រវត្តិត្រូវបានបង្កើតឡើងដោយការជ្រើសរើសដោយដៃប្រហែល 250 ភីកសែលនៃភាគល្អិតចំនួន 1000 នៅក្នុងស៊ុម 250 ភីកសែល និងគ្មានចំណាត់ថ្នាក់ពីរវិមាត្រ (2D) ដោយហេតុនេះបដិសេធចំណាត់ថ្នាក់ទាំងនោះដែលបំពេញតាមការបំពុលគំរូ ឬមិនមានលក្ខណៈសម្គាល់។ បន្ទាប់មក ការជ្រើសរើសដោយស្វ័យប្រវត្តិត្រូវបានអនុវត្តលើរូបថតមីក្រូទស្សន៍ទាំងអស់ ហើយ RC-LH114-W មានភាគល្អិតចំនួន 849,359 ហើយស្មុគស្មាញ RC-LH116 មានភាគល្អិតចំនួន 476,547។ ភាគល្អិតដែលបានជ្រើសរើសទាំងអស់បានឆ្លងកាត់ការចាត់ថ្នាក់ 2D មិនមែនឯកសារយោងចំនួនពីរជុំ ហើយបន្ទាប់ពីការដំណើរការនីមួយៗ ភាគល្អិតដែលត្រូវនឹងតំបន់កាបូន ការបំពុលគំរូ គ្មានលក្ខណៈពិសេសជាក់ស្តែង ឬភាគល្អិតដែលត្រួតស៊ីគ្នាខ្លាំងត្រូវបានបដិសេធ ដែលបណ្តាលឱ្យមាន 772,033 (90.9%) និង 359,678 (75.5%)។ ភាគល្អិតត្រូវបានប្រើសម្រាប់ការចាត់ថ្នាក់ 3D នៃ RC-LH114-W និង RC-LH116 រៀងៗខ្លួន។ គំរូយោង 3D ដំបូងត្រូវបានបង្កើតដោយប្រើវិធីសាស្ត្រចុះជម្រាលស្តូកាស្ទិក។ ដោយប្រើគំរូដំបូងជាឯកសារយោង ភាគល្អិតដែលបានជ្រើសរើសត្រូវបានចាត់ថ្នាក់ជាបួនប្រភេទក្នុង 3D។ ដោយប្រើគំរូក្នុងប្រភេទនេះជាឯកសារយោង អនុវត្តការកែលម្អ 3D លើភាគល្អិតក្នុងប្រភេទធំបំផុត បន្ទាប់មកប្រើតម្រងឆ្លងកាត់ទាប 15Å ដំបូងដើម្បីគ្របដណ្តប់លើផ្ទៃសារធាតុរំលាយ បន្ថែមភីកសែល 6 នៃគែមទន់ ហើយដំណើរការភីកសែលក្រោយដើម្បីកែតម្រូវមុខងារផ្ទេរម៉ូឌុលកំពូល Gatan K2 របស់ឧបករណ៍ចាប់សញ្ញាកំពូល។ សម្រាប់សំណុំទិន្នន័យ RC-LH114-W គំរូដំបូងនេះត្រូវបានកែប្រែដោយការដកដង់ស៊ីតេខ្លាំងនៅគែមនៃរបាំងមុខ (ផ្តាច់ចេញពីដង់ស៊ីតេស្មុគស្មាញស្នូលនៅក្នុង UCSF Chimera)។ គំរូលទ្ធផល (គុណភាពបង្ហាញរបស់ RC-LH114-W និង RC-LH116 គឺ 3.91 និង 4.16 Å រៀងគ្នា) ត្រូវបានប្រើជាឯកសារយោងសម្រាប់ជុំទីពីរនៃចំណាត់ថ្នាក់ 3D។ ភាគល្អិតដែលប្រើត្រូវបានដាក់ជាក្រុមទៅក្នុងថ្នាក់ 3D ដំបូង ហើយមិនមានទំនាក់ទំនងខ្លាំងជាមួយសង្កាត់នោះទេ។ ការត្រួតស៊ីគ្នា ឬខ្វះលក្ខណៈពិសេសរចនាសម្ព័ន្ធជាក់ស្តែង។ បន្ទាប់ពីជុំទីពីរនៃចំណាត់ថ្នាក់ 3D ប្រភេទដែលមានគុណភាពបង្ហាញខ្ពស់បំផុតត្រូវបានជ្រើសរើស [សម្រាប់ RC-LH114-W ប្រភេទមួយគឺភាគល្អិតចំនួន 377,703 (44.5%) សម្រាប់ RC-LH116 មានពីរប្រភេទ សរុបចំនួន 260,752 ភាគល្អិត (54.7%) ដែលពួកវាដូចគ្នាលុះត្រាតែតម្រឹមបន្ទាប់ពីការបង្វិលដំបូងជាមួយនឹងភាពខុសគ្នាបន្តិចបន្តួច]។ ភាគល្អិតដែលបានជ្រើសរើសត្រូវបានស្រង់ចេញឡើងវិញនៅក្នុងប្រអប់ 400 ភីកសែល ហើយត្រូវបានចម្រាញ់ដោយការចម្រាញ់ 3D។ របាំងសារធាតុរំលាយត្រូវបានបង្កើតដោយប្រើតម្រងឆ្លងកាត់ទាប 15Å ដំបូង ការពង្រីកផែនទីភីកសែល 3 និងរបាំងទន់ភីកសែល 3។ ដោយប្រើការចម្រាញ់ CTF ក្នុងមួយភាគល្អិត ការកែតម្រូវចលនាក្នុងមួយភាគល្អិត និងជុំទីពីរនៃការចម្រាញ់ CTF ក្នុងមួយភាគល្អិត ការចម្រាញ់ 3D ការបិទបាំងសារធាតុរំលាយ និងដំណើរការក្រោយត្រូវបានអនុវត្តបន្ទាប់ពីជំហាននីមួយៗដើម្បីចម្រាញ់បន្ថែមទៀតនូវវាយនភាពលទ្ធផល។ ដោយប្រើតម្លៃកាត់ផ្តាច់ FSC (មេគុណសហសម្ព័ន្ធ Fourier Shell) 0.143 គុណភាពបង្ហាញនៃម៉ូដែលចុងក្រោយនៃ RC-LH114-W និង RC-LH116 គឺ 2.65 និង 2.80Å រៀងគ្នា។ ខ្សែកោង FSC នៃម៉ូដែលចុងក្រោយត្រូវបានបង្ហាញក្នុងរូបភាពទី 2។ S17។
លំដាប់ប្រូតេអ៊ីនទាំងអស់ត្រូវបានទាញយកពី UniProtKB: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3)។ SWISS-MODEL (45) ត្រូវបានប្រើដើម្បីបង្កើតគំរូ homology នៃ RC ដែលមានលំដាប់ប្រូតេអ៊ីននៃ RC-L, RC-M និង RC-H និងរចនាសម្ព័ន្ធគ្រីស្តាល់នៃ Rba។ sphaeroides RC ត្រូវបានប្រើជាគំរូ (PDB ID: 5LSE) (46)។ ប្រើឧបករណ៍ “ផែនទីសម” នៅក្នុង UCSF Chimera ដើម្បីឱ្យសមគំរូដែលបានបង្កើតទៅនឹងផែនទី (47) កែលម្អរចនាសម្ព័ន្ធប្រូតេអ៊ីន និងសហកត្តា [4×BChl a (ឈ្មោះសំណល់បណ្ណាល័យម៉ូណូម័រ = BCL) 2×BPh a (BPH) UQ10 មួយឬពីរប្រភេទ (U10) ជាតិដែកមិនមែន heme មួយ (Fe) និង 3,4-dihydrohexacarbonylcholine (QAK) មួយ] ប្រើ Coot (48) ដើម្បីបន្ថែម។ ដោយសារ QAK មិនមាននៅក្នុងបណ្ណាល័យម៉ូណូម័រ វាត្រូវបានកំណត់ប៉ារ៉ាម៉ែត្រដោយប្រើឧបករណ៍ eLBOW នៅក្នុង PHENIX (49)។
បន្ទាប់មក អនុឯកតា LH1 ត្រូវបានសាងសង់។ ដំបូងឡើយ ឧបករណ៍សាងសង់ដោយស្វ័យប្រវត្តិនៅក្នុង PHENIX (49) ត្រូវបានប្រើដើម្បីបង្កើតផ្នែកនៃលំដាប់ LH1 ដោយស្វ័យប្រវត្តិដោយប្រើផែនទី និងលំដាប់ប្រូតេអ៊ីន LH1-α និង LH1-β ជាការបញ្ចូល។ ជ្រើសរើសអនុឯកតា LH1 ដែលពេញលេញបំផុត ស្រង់វាចេញ ហើយផ្ទុកវាទៅក្នុង Coot បន្ថែមលំដាប់ដែលបាត់នៅក្នុងវាដោយដៃ ហើយកែលម្អរចនាសម្ព័ន្ធទាំងមូលដោយដៃមុនពេលបន្ថែម BCls a (BCL) ពីរ និង spirilloxanthin (CRT) [យោងទៅតាម Rps ពាក់ព័ន្ធ ដង់ស៊ីតេនៃស្មុគស្មាញ LH1 និងមាតិកា carotenoid ដែលគេស្គាល់។ ប្រភេទសត្វ (17)]។ ចម្លងអនុឯកតា LH1 ពេញលេញ ហើយប្រើ "ឧបករណ៍ផែនទីចត" របស់ UCSF Chimera ដើម្បីចតនៅក្នុងតំបន់មិនមែនគំរូដែលនៅជាប់គ្នានៃដង់ស៊ីតេ LH1 ហើយបន្ទាប់មកកែលម្អវានៅក្នុង Coot; ធ្វើដំណើរការម្តងទៀតរហូតដល់អនុឯកតា LH1 ទាំងអស់ត្រូវបានធ្វើគំរូ។ ចំពោះរចនាសម្ព័ន្ធ RC-LH114-W ដោយការទាញយកដង់ស៊ីតេដែលមិនបានបែងចែកនៅក្នុង Coot ប្រូតេអ៊ីនត្រូវបានបំបែកចេញពីសមាសធាតុមិនមែនប្រូតេអ៊ីនដែលនៅសល់នៅក្នុងផែនទី USCF Chimera ហើយឧបករណ៍ Autobuild ត្រូវបានប្រើដើម្បីបង្កើតគំរូដំបូង និងគំរូអនុឯកតាដែលនៅសល់ (ប្រូតេអ៊ីន-W)។ នៅក្នុង PHENIX (49)។ បន្ថែមលំដាប់ដែលបាត់ណាមួយទៅគំរូលទ្ធផលនៅក្នុង Coot (48) ហើយបន្ទាប់មកកែលម្អអនុឯកតាទាំងមូលដោយដៃ។ ដង់ស៊ីតេដែលមិនបានបែងចែកដែលនៅសល់សមនឹងការរួមបញ្ចូលគ្នានៃ lipids (ID បណ្ណាល័យ monomer PDB នៃ CDL = CDL, POPC = 6PL និង POPG = PGT) សាប៊ូបោកខោអាវ β-DDM (LMT) និងម៉ូលេគុល UQ10 (U10)។ ប្រើការបង្កើនប្រសិទ្ធភាព PHENIX (49) និងការបង្កើនប្រសិទ្ធភាពដោយដៃនៅក្នុង Coot (48) ដើម្បីធ្វើឱ្យគំរូដំបូងពេញលេញល្អឥតខ្ចោះរហូតដល់ស្ថិតិគំរូ និងគុណភាពដែលមើលឃើញនៃការសមមិនអាចកែលម្អបន្ថែមទៀតបានទេ។ ជាចុងក្រោយ ប្រើ LocScale (50) ដើម្បីធ្វើឱ្យផែនទីក្នុងស្រុកច្បាស់ ហើយបន្ទាប់មកអនុវត្តវដ្តផ្សេងទៀតជាច្រើននៃការធ្វើគំរូដង់ស៊ីតេដែលមិនបានបែងចែក និងការបង្កើនប្រសិទ្ធភាពដោយស្វ័យប្រវត្តិ និងដោយដៃ។
ប៉ិបទីត សហហ្វាក់ទ័រ និងលីពីត និងគីណូនផ្សេងទៀតដែលចតក្នុងដង់ស៊ីតេរៀងៗខ្លួនត្រូវបានបង្ហាញក្នុងរូបភាពទី 1 និងទី 2។ S18 ដល់ S23។ ព័ត៌មានស្ថិតិនៃគំរូចុងក្រោយត្រូវបានបង្ហាញក្នុងតារាង S1។
លុះត្រាតែមានការបញ្ជាក់ផ្សេងពីនេះ វិសាលគមស្រូបយក UV/Vis/NIR ត្រូវបានប្រមូលនៅលើម៉ាស៊ីនវិសាលគម Cary60 (Agilent សហរដ្ឋអាមេរិក) ក្នុងចន្លោះពេល 1 nm ពី 250 nm ដល់ 1000 nm និងពេលវេលាធ្វើសមាហរណកម្ម 0.1 វិនាទី។
ពនលាយសំណាកក្នុង cuvette quartz ដែលមានផ្លូវ 2 mm ទៅកាន់ A880 ចំនួន 1 ហើយប្រមូលវិសាលគមស្រូបយករវាង 400 និង 1000 nm។ វិសាលគមឌីក្រូអ៊ីករាងជារង្វង់ត្រូវបានប្រមូលនៅលើ spectropolarimeter Jasco 810 (Jasco ប្រទេសជប៉ុន) នៅចន្លោះពេល 1 nm រវាង 400 nm និង 950 nm ក្នុងអត្រាស្កេន 20 nm min-1។
មេគុណ​ផុតពូជ​ម៉ូល​ត្រូវ​បាន​កំណត់​ដោយ​ការ​ពនលាយ​ស្មុគស្មាញ​ស្នូល​ទៅ​ជា A880 ប្រហែល 50។ ពនលាយ​បរិមាណ 10μl ក្នុង​សារធាតុ​ចង​សតិបណ្ដោះអាសន្ន 990μl ឬ​មេតាណុល ហើយ​ប្រមូល​វិសាលគម​ស្រូប​យក​ភ្លាមៗ​ដើម្បី​កាត់​បន្ថយ​ការ​រិចរិល BChl។ មាតិកា BChl នៃ​គំរូ​មេតាណុល​នីមួយៗ​ត្រូវ​បាន​គណនា​ដោយ​មេគុណ​ផុតពូជ​នៅ 771 nm នៃ 54.8 mM-1 cm-1 ហើយ​មេគុណ​ផុតពូជ​ត្រូវ​បាន​កំណត់ (51)។ ចែក​កំហាប់ BChl ដែល​វាស់​បាន​ដោយ 32 (RC-LH114-W) ឬ 36 (RC-LH116) ដើម្បី​កំណត់​កំហាប់​ស្មុគស្មាញ​ស្នូល ដែល​បន្ទាប់​មក​ត្រូវ​បាន​ប្រើ​ដើម្បី​កំណត់​វិសាលគម​ស្រូប​យក​នៃ​គំរូ​ដូចគ្នា​ដែល​ប្រមូល​បាន​ក្នុង​សារធាតុ​ចង​សតិបណ្ដោះអាសន្ន។ ការ​វាស់វែង​ម្តង​ហើយ​ម្តង​ទៀត​ត្រូវ​បាន​ធ្វើ​ឡើង​សម្រាប់​គំរូ​នីមួយៗ ហើយ​ការ​ស្រូប​យក​ជា​មធ្យម​នៃ​អតិបរមា BChl Qy ត្រូវ​បាន​ប្រើ​សម្រាប់​ការ​គណនា។ មេគុណ​ផុតពូជ​នៃ RC-LH114-W ដែល​វាស់​នៅ​រលក​ពន្លឺ 878 nm គឺ 3280±140 mM-1 cm-1 ខណៈ​ដែល​មេគុណ​ផុតពូជ​នៃ RC-LH116 ដែល​វាស់​នៅ​រលក​ពន្លឺ 880 nm គឺ 3800±30 mM-1 cm-1។
UQ10 ត្រូវបានវាស់បរិមាណតាមវិធីសាស្ត្រក្នុង (52)។ សរុបមក HPLC ដំណាក់កាលបញ្ច្រាស (RP-HPLC) ត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើប្រព័ន្ធ Agilent 1200 HPLC។ រំលាយ RC-LH116 ឬ RC-LH114-W ប្រហែល 0.02 nmol ក្នុង 50μl នៃមេតាណុល៖ក្លរ៉ូហ្វម 50:50 ដែលមាន ferric chloride 0.02% (w/v) ហើយចាក់ Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4.6 mm ដែលមានលំនឹងជាមុន រំលាយក្នុង 1 ml-1 min-1 នៅសីតុណ្ហភាព 40°C ក្នុងសារធាតុរំលាយ HPLC (80:20 មេតាណុល៖2-propanol) លើជួរឈរ ×25 cm។ អនុវត្តការរំលាយអ៊ីសូក្រាតក្នុងសារធាតុរំលាយ HPLC ដើម្បីតាមដានការស្រូបយកនៅ 275 nm (UQ10), 450 nm (carotenoids) និង 780 nm (BChl) រយៈពេល 1 ម៉ោង។ កំពូលនៅក្នុងក្រូម៉ាតូក្រាម 275 nm នៅ 25.5 នាទី ត្រូវបានរួមបញ្ចូល ដែលមិនមានសមាសធាតុផ្សេងទៀតដែលអាចរកឃើញនោះទេ។ ផ្ទៃរួមបញ្ចូលគ្នាត្រូវបានប្រើដើម្បីគណនាបរិមាណម៉ូលនៃ UQ10 ដែលស្រង់ចេញដោយយោងទៅលើខ្សែកោងក្រិតតាមខ្នាតដែលគណនាចេញពីការចាក់ស្តង់ដារសុទ្ធពី 0 ដល់ 5.8 nmol (រូបភាព S14)។ គំរូនីមួយៗត្រូវបានវិភាគជាបីច្បាប់ចម្លង ហើយកំហុសដែលបានរាយការណ៍ត្រូវគ្នាទៅនឹង SD នៃមធ្យមភាគ។
ដំណោះស្រាយដែលមានស្មុគស្មាញ RC-LH1 ជាមួយនឹងការស្រូបយក Qy អតិបរមា 0.1 ត្រូវបានរៀបចំជាមួយ cytochrome c2 បេះដូងសេះដែលបានកាត់បន្ថយ 30 μM (Merck, UK) និង 0 ទៅ 50 μMUQ2 (Merck, UK)។ គំរូ 1 មីលីលីត្រចំនួនបីត្រូវបានរៀបចំនៅកំហាប់ UQ2 នីមួយៗ ហើយបានភ្ញាស់ពេញមួយយប់ក្នុងទីងងឹតនៅសីតុណ្ហភាព 4°C ដើម្បីធានាបាននូវការសម្របខ្លួនពេញលេញទៅនឹងទីងងឹតមុនពេលវាស់វែង។ ដំណោះស្រាយត្រូវបានផ្ទុកទៅក្នុងម៉ាស៊ីនវាស់វិសាលគមម៉ូឌុល OLIS RSM1000 ដែលបំពាក់ដោយក្រឡាចត្រង្គអណ្តាតភ្លើង/បន្ទាត់ 500 ទំហំ 300 nm ច្រកចូលទំហំ 1.24 mm រន្ធកណ្តាលទំហំ 0.12 mm និងរន្ធចេញទំហំ 0.6 mm។ តម្រងឆ្លងកាត់ប្រវែង 600 nm ត្រូវបានដាក់នៅច្រកចូលនៃបំពង់រូបថតគំរូ និងបំពង់ម៉ាស៊ីនវាស់វិសាលគមយោងដើម្បីមិនរាប់បញ្ចូលពន្លឺរំញោច។ ការស្រូបយកត្រូវបានត្រួតពិនិត្យនៅ 550 nm ជាមួយនឹងពេលវេលារួមបញ្ចូល 0.15 វិនាទី។ ពន្លឺរំញោចត្រូវបានបញ្ចេញចេញពីអំពូល LED M880F2 ទំហំ 880 nm (Light Emitting Diode) (Thorlabs Ltd., UK) តាមរយៈខ្សែកាបអុបទិកក្នុងកម្រិតអាំងតង់ស៊ីតេ 90% តាមរយៈឧបករណ៍បញ្ជា DC2200 (Thorlabs Ltd., UK) ហើយត្រូវបានបញ្ចេញទៅកាន់ប្រភពពន្លឺនៅមុំ 90°។ ធ្នឹមវាស់គឺផ្ទុយពីកញ្ចក់ដើម្បីបញ្ជូនពន្លឺណាមួយដែលមិនត្រូវបានស្រូបយកដោយគំរូដំបូង។ ត្រួតពិនិត្យការស្រូបយក 10 វិនាទីមុនពេលបំភ្លឺ 50 វិនាទី។ បន្ទាប់មកការស្រូបយកត្រូវបានត្រួតពិនិត្យបន្ថែមទៀតរយៈពេល 60 វិនាទីនៅក្នុងទីងងឹតដើម្បីវាយតម្លៃពីវិសាលភាពដែល quinolol កាត់បន្ថយ cytochrome c23+ ដោយឯកឯង (សូមមើលរូបភាព S8 សម្រាប់ទិន្នន័យឆៅ)។
ទិន្នន័យត្រូវបានដំណើរការដោយការតម្រឹមអត្រាដំបូងលីនេអ៊ែរក្នុងរយៈពេល 0.5 ទៅ 10 វិនាទី (អាស្រ័យលើកំហាប់ UQ2) និងធ្វើមធ្យមភាគអត្រានៃគំរូទាំងបីនៅកំហាប់ UQ2 នីមួយៗ។ កំហាប់ RC-LH1 ដែលគណនាដោយមេគុណពន្លត់រៀងៗខ្លួនត្រូវបានប្រើដើម្បីបំលែងអត្រាទៅជាប្រសិទ្ធភាពកាតាលីករ ដែលត្រូវបានគូសវាសនៅក្នុង Origin Pro 2019 (OriginLab, សហរដ្ឋអាមេរិក) ហើយត្រូវបានតម្រឹមទៅនឹងគំរូ Michaelis-Menten ដើម្បីកំណត់តម្លៃ Km និង Kcat ជាក់ស្តែង។
សម្រាប់ការវាស់វែងការស្រូបយកបណ្ដោះអាសន្ន គំរូ RC-LH1 ត្រូវបានពនលាយទៅ ~2μM នៅក្នុងសារធាតុ IMAC ដែលមានផ្ទុកសូដ្យូម ascorbate 50 mM (Merck, USA) និង Terbutin 0.4 mM (Merck, USA)។ អាស៊ីតអាស្កូប៊ីកត្រូវបានប្រើជាអ្នកបរិច្ចាគអេឡិចត្រុងសម្រាប់បូជា ហើយ tert-butaclofen ត្រូវបានប្រើជាសារធាតុទប់ស្កាត់ QB ដើម្បីធានាថាអ្នកបរិច្ចាគ RC សំខាន់នៅតែត្រូវបានកាត់បន្ថយ (នោះគឺមិនត្រូវបាន photooxidized) ពេញមួយដំណើរការវាស់វែង។ គំរូប្រហែល 3 មីលីលីត្រត្រូវបានបន្ថែមទៅក្នុងក្រឡាបង្វិលផ្ទាល់ខ្លួន (អង្កត់ផ្ចិតប្រហែល 0.1 ម៉ែត្រ 350 RPM) ដែលមានប្រវែងផ្លូវអុបទិក 2 មីលីម៉ែត្រ ដើម្បីធានាថាគំរូនៅក្នុងផ្លូវឡាស៊ែរមានពេលវេលាគ្រប់គ្រាន់សម្រាប់ការសម្របខ្លួនងងឹតរវាងជីពចររំញោច។ ប្រើជីពចរឡាស៊ែរ ~100-fs ដើម្បីពង្រីកប្រព័ន្ធឡាស៊ែរ Ti: Sapphire (Spectra Physics, USA) ដើម្បីរំញោចគំរូនៅ 880 nm ក្នុងអត្រាធ្វើម្តងទៀត 1 kHz (20 nJ សម្រាប់ NIR ឬ 100 nJ សម្រាប់ Vis)។ មុនពេលប្រមូលទិន្នន័យ សូមដាក់គំរូឱ្យត្រូវពន្លឺរំញោចប្រហែល 30 នាទី។ ការប៉ះពាល់នឹងបណ្តាលឱ្យ QA អសកម្ម (អាចកាត់បន្ថយ QA ម្តងឬពីរដង)។ ប៉ុន្តែសូមចំណាំថាដំណើរការនេះអាចត្រឡប់វិញបាន ពីព្រោះបន្ទាប់ពីរយៈពេលយូរនៃការសម្របខ្លួនក្នុងទីងងឹត RC នឹងត្រលប់ទៅសកម្មភាព QA វិញយឺតៗ។ ឧបករណ៍វាស់វិសាលគម Helios (Ultrafast Systems, USA) ត្រូវបានប្រើដើម្បីវាស់វិសាលគមបណ្ដោះអាសន្នជាមួយនឹងពេលវេលាពន្យាពេលពី -10 ដល់ 7000 ps។ ប្រើកម្មវិធី Surface Xplorer (Ultrafast Systems, USA) ដើម្បីបំបែកសំណុំទិន្នន័យ បន្ទាប់មកបញ្ចូលចូលគ្នា និងធ្វើឱ្យមានលក្ខណៈស្តង់ដារ។ ប្រើកញ្ចប់កម្មវិធី CarpetView (Light Conversion Ltd., Lithuania) ដើម្បីប្រើសំណុំទិន្នន័យរួមបញ្ចូលគ្នា ដើម្បីទទួលបានវិសាលគមឌីផេរ៉ង់ស្យែលដែលទាក់ទងនឹងការរលួយ ឬប្រើមុខងារដែលបញ្ចូលនិទស្សន្តច្រើនជាមួយនឹងការឆ្លើយតបរបស់ឧបករណ៍ ដើម្បីឱ្យសមនឹងការវិវត្តន៍វិសាលគមរលកតែមួយនៅក្នុង Origin (OriginLab, USA)។
ដូចដែលបានរៀបរាប់ខាងលើ (53) ខ្សែភាពយន្តរស្មីសំយោគដែលមានស្មុគស្មាញ LH1 ដែលខ្វះទាំងអង់តែន RC និង LH2 គ្រឿងកុំផ្លិចត្រូវបានរៀបចំ។ ភ្នាសត្រូវបានពនលាយក្នុង 20 mM tris (pH 8.0) ហើយបន្ទាប់មកផ្ទុកទៅក្នុង cuvette រ៉ែថ្មខៀវដែលមានផ្លូវអុបទិក 2 mm។ ជីពចរឡាស៊ែរ 30nJ ត្រូវបានប្រើដើម្បីរំញោចគំរូនៅ 540 nm ជាមួយនឹងពេលវេលាពន្យាពេលពី -10 ដល់ 7000 ps។ ដំណើរការសំណុំទិន្នន័យដូចដែលបានពិពណ៌នាសម្រាប់គំរូ Rps. pal។
ភ្នាសត្រូវបានកំទេចជាដុំៗដោយការបង្វិលកណ្តាលនៅសីតុណ្ហភាព 150,000 RCF រយៈពេល 2 ម៉ោងនៅសីតុណ្ហភាព 4°C ហើយបន្ទាប់មកការស្រូបយករបស់វានៅ 880 nm ត្រូវបានរំលាយឡើងវិញនៅក្នុង 20 mM tris-HCl (pH 8.0) និង 200 mM NaCl។ រំលាយភ្នាសដោយកូរយឺតៗក្នុង β-DDM កំហាប់ 2% (w/v) រយៈពេល 1 ម៉ោងក្នុងទីងងឹតនៅសីតុណ្ហភាព 4°C។ គំរូត្រូវបានពនលាយក្នុង 100 mM triethylammonium carbonate (pH 8.0) (TEAB; Merck, UK) ទៅនឹងកំហាប់ប្រូតេអ៊ីន 2.5 mg ml-1 (ការវិភាគ Bio-Rad)។ ដំណើរការបន្ថែមទៀតត្រូវបានអនុវត្តពីវិធីសាស្ត្រដែលបានបោះពុម្ពផ្សាយពីមុន (54) ដោយចាប់ផ្តើមជាមួយនឹងការពនលាយប្រូតេអ៊ីន 50 μg ទៅជា TEAB សរុបចំនួន 50 μl ដែលមានផ្ទុក sodium laurate 1% (w/v) (Merck, UK)។ បន្ទាប់ពីការ sonication រយៈពេល 60 វិនាទី វាត្រូវបានកាត់បន្ថយជាមួយ 5 mM tris(2-carboxyethyl)phosphine (Merck, UK) នៅសីតុណ្ហភាព 37°C រយៈពេល 30 នាទី។ ចំពោះ S-alkylation សូមភ្ញាស់គំរូជាមួយ 10 mM methyl S-methylthiomethanesulfonate (Merck, UK) ហើយបន្ថែមវាពីដំណោះស្រាយស្តុក isopropanol 200 mM រយៈពេល 10 នាទីនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។ ការរំលាយអាហារ proteolytic ត្រូវបានអនុវត្តដោយបន្ថែម 2 μg trypsin/endoproteinase Lys-C mixture (Promega UK) ហើយភ្ញាស់នៅសីតុណ្ហភាព 37°C រយៈពេល 3 ម៉ោង។ surfactant laurate ត្រូវបានស្រង់ចេញដោយបន្ថែម 50 μl ethyl acetate និង 10 μl 10% (v/v) LC grade trifluoroacetic acid (TFA; Thermo Fisher Scientific, UK) និង vortexing រយៈពេល 60 វិនាទី។ ការបំបែកដំណាក់កាលត្រូវបានជំរុញដោយការ centrifugation នៅ 15,700 RCF រយៈពេល 5 នាទី។ យោងតាមពិធីការរបស់អ្នកផលិត ជួរឈរបង្វិល C18 (Thermo Fisher Scientific, UK) ត្រូវបានប្រើដើម្បីបឺត និងបន្សាបជាតិអំបិលដោយប្រុងប្រយ័ត្ននូវដំណាក់កាលខាងក្រោមដែលមាន peptide។ បន្ទាប់ពីសម្ងួតដោយការបង្វិលក្នុងសុញ្ញកាស គំរូត្រូវបានរំលាយក្នុង TFA 0.5% និង acetonitrile 3% ហើយ 500 ng ត្រូវបានវិភាគដោយ nanoflow RP chromatography រួមផ្សំជាមួយ mass spectrometry ដោយប្រើប៉ារ៉ាម៉ែត្រប្រព័ន្ធដែលបានរៀបរាប់លម្អិតពីមុន។
សូមប្រើប្រាស់ MaxQuant កំណែ 1.5.3.30 (56) សម្រាប់ការកំណត់អត្តសញ្ញាណប្រូតេអ៊ីន និងការវាស់បរិមាណ ដើម្បីស្វែងរកមូលដ្ឋានទិន្នន័យប្រូតេអូម Rps. palustris (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426)។ ទិន្នន័យប្រូតេអូមិចម៉ាសស្ពិចត្រូម៉ែត្រីត្រូវបានរក្សាទុកនៅក្នុង ProteomeXchange Alliance តាមរយៈឃ្លាំងដៃគូ PRIDE (http://proteomecentral.proteomexchange.org) ក្រោមឧបករណ៍កំណត់អត្តសញ្ញាណសំណុំទិន្នន័យ PXD020402។
សម្រាប់ការវិភាគដោយ RPLC រួមផ្សំជាមួយនឹងវិសាលគមម៉ាស់អ៊ីយ៉ូដអេឡិចត្រូស្ព្រាយ ស្មុគស្មាញ RC-LH1 ត្រូវបានរៀបចំពី Rps ប្រភេទធម្មជាតិ។ ដោយប្រើវិធីសាស្ត្រដែលបានបោះពុម្ពផ្សាយពីមុន (16) កំហាប់ប្រូតេអ៊ីនដែលផលិតនៅក្នុងកោសិកា palustris គឺ 2 mg ml-1 ក្នុង 20 mM Hepes (pH 7.8), 100 mM NaCl និង 0.03% (w/v) β- (ការវិភាគ Bio-Rad)) DDM។ យោងតាមពិធីការរបស់អ្នកផលិត សូមប្រើឧបករណ៍បន្សុទ្ធ 2D (GE Healthcare, USA) ដើម្បីទាញយកប្រូតេអ៊ីន 10 μg ដោយវិធីសាស្ត្រទឹកភ្លៀង ហើយរំលាយទឹកភ្លៀងក្នុង 20 μl 60% (v/v) អាស៊ីតហ្វមីក (FA), 20% (v/v) Acetonitrile និង 20% (v/v) ទឹក។ មីក្រូលីត្រចំនួនប្រាំត្រូវបានវិភាគដោយ RPLC (Dionex RSLC) រួមផ្សំជាមួយនឹងវិសាលគមម៉ាស់ (Maxis UHR-TOF, Bruker)។ ប្រើជួរឈរ MabPac 1.2×100 mm (Thermo Fisher Scientific, UK) សម្រាប់ការបំបែកនៅសីតុណ្ហភាព 60°C និង 100μlmin -1 ជាមួយនឹងជម្រាលនៃ 85% (v / v) សារធាតុរំលាយ A [0.1% (v / v) FA និង 0.02% (V/v) ដំណោះស្រាយទឹក TFA] ទៅ 85%(v/v) សារធាតុរំលាយ B [0.1%(v/v) FA និង 0.02%(v/v) ក្នុង acetonitrile TFA 90%(v/v)] ដោយប្រើប្រភពអ៊ីយ៉ូដអេឡិចត្រូស្ព្រាយស្តង់ដារ និងប៉ារ៉ាម៉ែត្រលំនាំដើមរយៈពេលជាង 60 នាទី ម៉ាស្សស្ពិចត្រូម៉ែត្រទទួលបាន 100 ទៅ 2750 m/z (សមាមាត្រម៉ាស់ទៅនឹងបន្ទុក)។ ដោយមានជំនួយពីឧបករណ៍ FindPept វិបផតថលធនធានជីវព័ត៌មានវិទ្យា ExPASy (https://web.expasy.org/findpept/) សូមគូសផែនទីវិសាលគមម៉ាស់ទៅនឹងអនុឯកតានៃស្មុគស្មាញ។
កោសិកាត្រូវបានដាំដុះរយៈពេល 72 ម៉ោងក្រោមពន្លឺ 100 មីលីលីត្រ NF-ទាប (10μMm-2 s-1) មធ្យម (30μMm-2 s-1) ឬខ្ពស់ (300μMm-2 s-1)។ ឧបករណ៍ផ្ទុក M22 (ឧបករណ៍ផ្ទុក M22 ដែលក្នុងនោះអាម៉ូញ៉ូមស៊ុលហ្វាតត្រូវបានលុបចោល ហើយសូដ្យូមស៊ុលហ្វាតត្រូវបានជំនួសដោយសូដ្យូមអាសេតាត) ក្នុងដបវីសគម្រប 100 មីលីលីត្រ (23)។ ក្នុងវដ្ត 30 វិនាទីចំនួនប្រាំ គ្រាប់កញ្ចក់ 0.1 មីក្រូនត្រូវបានដាំក្នុងសមាមាត្របរិមាណ 1:1 ដើម្បីរំលាយកោសិកា ហើយទុកឱ្យត្រជាក់លើទឹកកករយៈពេល 5 នាទី។ សារធាតុមិនរលាយ កោសិកាដែលមិនទាន់បាក់ និងគ្រាប់កញ្ចក់ត្រូវបានយកចេញដោយការបង្វិលនៅ 16,000 RCF រយៈពេល 10 នាទីនៅក្នុងម៉ាស៊ីនបង្វិលមីក្រូលើតុ។ ភ្នាសត្រូវបានបំបែកនៅក្នុងរ៉ូទ័រ Ti 70.1 ជាមួយ 100,000 RCF ក្នុង 20 mM tris-HCl (pH 8.0) ជាមួយនឹងជម្រាលស៊ុយក្រូស 40/15% (w/w) រយៈពេល 10 ម៉ោង។
ដូចដែលបានពិពណ៌នានៅក្នុងការងារមុនរបស់យើង ការរកឃើញភាពស៊ាំនៃស្លាក His លើ PufW (16)។ សរុបមក ស្មុគស្មាញស្នូលដែលបានបន្សុទ្ធ (11.8 nM) ឬភ្នាសដែលមានកំហាប់ RC ដូចគ្នា (កំណត់ដោយអុកស៊ីតកម្មដកវិសាលគមភាពខុសគ្នាដែលបានកាត់បន្ថយ និងការផ្គូផ្គងបន្ទុកលើជែលប្រឡាក់ពណ៌) ក្នុងសារធាតុផ្ទុក SDS 2x (Merck, UK) ត្រូវបានពនលាយពីរដង។ ប្រូតេអ៊ីនត្រូវបានបំបែកនៅលើជែល bis-tris NuPage ចម្លង 12% (Thermo Fisher Scientific, UK)។ ជែលមួយត្រូវបានប្រឡាក់ជាមួយ Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, UK) ដើម្បីផ្ទុក និងមើលឃើញអនុឯកតា RC-L។ ប្រូតេអ៊ីននៅលើជែលទីពីរត្រូវបានផ្ទេរទៅភ្នាស polyvinylidene fluoride (PVDF) ដែលបានធ្វើឱ្យសកម្មដោយមេតាណុល (Thermo Fisher Scientific, UK) សម្រាប់ការវិភាគភាពស៊ាំ។ ភ្នាស PVDF ត្រូវបានរារាំងក្នុង 50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0.2% (v / v) Tween-20 និង 5% (w / v) ម្សៅទឹកដោះគោដែលមានជាតិខ្លាញ់ទាប ហើយបន្ទាប់មកភ្ញាស់ជាមួយអង្គបដិប្រាណបឋម anti-His (ក្នុងសារធាតុរំលាយអង្គបដិប្រាណ [50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl និង 0.05% (v/v) Tween-20] ក្នុង 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, សហរដ្ឋអាមេរិក) រយៈពេល 4 ម៉ោង។ បន្ទាប់ពីលាងសម្អាត 3 ដងរយៈពេល 5 នាទីក្នុងសារធាតុប្រឆាំងអង្គបដិប្រាណ ភ្នាសត្រូវបានផ្សំជាមួយអង្គបដិប្រាណបន្ទាប់បន្សំប្រឆាំងកណ្ដុរ horseradish peroxidase (Sigma-Aldrich, UK) (ពនលាយ 1:10,000 ក្នុងសារធាតុប្រឆាំងអង្គបដិប្រាណ) ភ្ញាស់ដើម្បីអនុញ្ញាតឱ្យមានការរកឃើញ (5 នាទីបន្ទាប់ពីលាងសម្អាត 3 ដងក្នុងសារធាតុប្រឆាំងអង្គបដិប្រាណ) ដោយប្រើស្រទាប់ខាងក្រោម chemiluminescence WESTAR ETA C 2.0 (Cyanagen, អ៊ីតាលី) និង Amersham Imager 600 (GE Healthcare, UK)។
តាមរយៈការគូរការចែកចាយអាំងតង់ស៊ីតេនៃជែលប្រឡាក់ពណ៌ ឬផ្លូវអ៊ីមមូណូអាស្សៃនីមួយៗ ដោយរួមបញ្ចូលតំបន់នៅក្រោមកំពូល និងគណនាសមាមាត្រអាំងតង់ស៊ីតេនៃ RC-L (ជែលប្រឡាក់ពណ៌) និងប្រូតេអ៊ីន-W (អ៊ីមមូណូអាស្សៃ) នៅក្នុង ImageJ (57) ដំណើរការរូបភាព។ សមាមាត្រទាំងនេះត្រូវបានបម្លែងទៅជាសមាមាត្រម៉ូឡាដោយសន្មតថាសមាមាត្រនៃ RC-L ទៅនឹងប្រូតេអ៊ីន-W នៅក្នុងគំរូ RC-LH114-W សុទ្ធគឺ 1:1 ហើយធ្វើឱ្យសំណុំទិន្នន័យទាំងមូលមានលក្ខណៈធម្មតាតាមនោះ។
សម្រាប់​ឯកសារ​បន្ថែម​សម្រាប់​អត្ថបទ​នេះ សូម​មើល http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
នេះ​ជា​អត្ថបទ​ដែល​អាច​ចូល​ប្រើប្រាស់​បាន​ដោយ​សេរី ដែល​ចែកចាយ​ក្រោម​លក្ខខណ្ឌ​នៃ​អាជ្ញាប័ណ្ណ Creative Commons Attribution។ អត្ថបទ​នេះ​អនុញ្ញាត​ឱ្យ​មាន​ការ​ប្រើប្រាស់ ការ​ចែកចាយ និង​ការ​ផលិត​ឡើង​វិញ​ដោយ​គ្មាន​ការ​រឹតត្បិត​ក្នុង​មធ្យោបាយ​ណាមួយ ក្រោម​លក្ខខណ្ឌ​ដែល​ស្នាដៃ​ដើម​ត្រូវ​បាន​ដកស្រង់​យ៉ាង​ត្រឹមត្រូវ។
ចំណាំ៖ យើងគ្រាន់តែស្នើសុំឱ្យអ្នកផ្តល់អាសយដ្ឋានអ៊ីមែលរបស់អ្នក ដើម្បីឱ្យមនុស្សដែលអ្នកណែនាំទៅកាន់ទំព័រដឹងថាអ្នកចង់ឱ្យពួកគេឃើញអ៊ីមែល ហើយវាមិនមែនជាសារឥតបានការទេ។ យើងនឹងមិនចាប់យកអាសយដ្ឋានអ៊ីមែលណាមួយឡើយ។
សំណួរនេះត្រូវបានប្រើដើម្បីសាកល្បងថាតើអ្នកជាអ្នកទស្សនា និងការពារការដាក់ស្នើសារឥតបានការដោយស្វ័យប្រវត្តិឬអត់។
ដេវីដ ជេខេ ស្វានស៍ប៊ឺរី, ផាក ឈាន, ភីលីព ជេ. ជែកសុន, កៃតលីន អិម. ហ្វារីស, ដារីយូស អិម. នីដហ្សវីដស្គី, អេលីហ្សាបែត ស៊ី. ម៉ាទីន, ដេវីដ អេ. ហ្វាមើរ, ឡូណា អេ. ម៉ាឡូន, រេបេកា អេហ្វ. ថមសុន, នីល អេ. រ៉ានសុន, ដានីញ៉ែល ភី កានីហ្វ, ម៉ាក ជេ. ឌីកមែន, ឌូវី ហូលថេន, គ្រីស្ទីន ឃើម៉ៃអឺរ, អេនឌ្រូ ហ៊ីចខុក, ស៊ី. នីល ហាន់ធើរ
រចនាសម្ព័ន្ធដែលមានគុណភាពបង្ហាញខ្ពស់នៃស្មុគស្មាញអន្ទាក់ពន្លឺ 1 នៅក្នុងមជ្ឈមណ្ឌលប្រតិកម្មផ្តល់នូវការយល់ដឹងថ្មីៗអំពីឌីណាមិកគីណូន។
ដេវីដ ជេខេ ស្វានស៍ប៊ឺរី, ផាក ឈាន, ភីលីព ជេ. ជែកសុន, កៃតលីន អិម. ហ្វារីស, ដារីយូស អិម. នីដហ្សវីដស្គី, អេលីហ្សាបែត ស៊ី. ម៉ាទីន, ដេវីដ អេ. ហ្វាមើរ, ឡូណា អេ. ម៉ាឡូន, រេបេកា អេហ្វ. ថមសុន, នីល អេ. រ៉ានសុន, ដានីញ៉ែល ភី កានីហ្វ, ម៉ាក ជេ. ឌីកមែន, ឌូវី ហូលថេន, គ្រីស្ទីន ឃើម៉ៃអឺរ, អេនឌ្រូ ហ៊ីចខុក, ស៊ី. នីល ហាន់ធើរ
រចនាសម្ព័ន្ធដែលមានគុណភាពបង្ហាញខ្ពស់នៃស្មុគស្មាញអន្ទាក់ពន្លឺ 1 នៅក្នុងមជ្ឈមណ្ឌលប្រតិកម្មផ្តល់នូវការយល់ដឹងថ្មីៗអំពីឌីណាមិកគីណូន។
© 2021 សមាគមអាមេរិចសម្រាប់ការជឿនលឿននៃវិទ្យាសាស្ត្រ។ រក្សាសិទ្ធិគ្រប់យ៉ាង។ AAAS គឺជាដៃគូរបស់ HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef និង CountER ។ ScienceAdvances ISSN 2375-2548 ។