បច្ចុប្បន្ន *អាសយដ្ឋានបច្ចុប្បន្ន៖ ទីក្រុង Cologne 50931 ប្រទេសអាល្លឺម៉ង់ ការស្រាវជ្រាវចង្កោម Cologne Excellence Cluster ស្តីពីការឆ្លើយតបស្ត្រេសកោសិកាក្នុងជំងឺទាក់ទងនឹងភាពចាស់ (CECAD)។
ការខូចសរសៃប្រសាទនៃជំងឺមីតូខនឌ្រីត្រូវបានចាត់ទុកថាមិនអាចត្រឡប់វិញបាន ពីព្រោះភាពប្លាស្ទិកមេតាបូលីសនៃណឺរ៉ូនមានកម្រិត ប៉ុន្តែឥទ្ធិពលនៃមុខងារមីតូខនឌ្រីលើស្វ័យភាពកោសិកានៃការរំលាយអាហារណឺរ៉ូននៅក្នុងរាងកាយត្រូវបានគេយល់តិចតួច។ នៅទីនេះ យើងណែនាំប្រូតេអូមជាក់លាក់កោសិកានៃណឺរ៉ូន Purkinje ដែលមានកង្វះ OXPHOS រីកចម្រើនដែលបណ្តាលមកពីឌីណាមិកលាយមីតូខនឌ្រីដែលរំខាន។ យើងបានរកឃើញថា មុខងារមីតូខនឌ្រីបានបង្កឱ្យមានការផ្លាស់ប្តូរយ៉ាងជ្រាលជ្រៅនៅក្នុងវិស័យប្រូតេអូមិក ដែលនៅទីបំផុតនាំឱ្យមានការធ្វើឱ្យសកម្មជាបន្តបន្ទាប់នៃកម្មវិធីមេតាបូលីសជាក់លាក់មុនពេលកោសិកាស្លាប់។ ដោយមិននឹកស្មានដល់ យើងបានកំណត់ការបញ្ចូលជាក់ស្តែងនៃ pyruvate carboxylase (PCx) និងអង់ស៊ីមប្រឆាំងភាពចាស់ផ្សេងទៀតដែលបំពេញបន្ថែមកម្រិតមធ្យមនៃវដ្ត TCA។ ការរារាំង PCx បានធ្វើឱ្យភាពតានតឹងអុកស៊ីតកម្ម និងការខូចសរសៃប្រសាទកាន់តែធ្ងន់ធ្ងរ ដែលបង្ហាញថាជំងឺក្រិនសរសៃឈាមមានប្រសិទ្ធភាពការពារនៅក្នុងណឺរ៉ូនដែលខ្វះ OXPHOS។ ការស្តារឡើងវិញនៃការលាយមីតូខនឌ្រីនៅក្នុងណឺរ៉ូនដែលខូចទ្រង់ទ្រាយចុងក្រោយបញ្ច្រាស់លក្ខណៈមេតាបូលីសទាំងនេះទាំងស្រុង ដោយហេតុនេះការពារការស្លាប់កោសិកា។ ការរកឃើញរបស់យើងកំណត់អត្តសញ្ញាណផ្លូវដែលមិនស្គាល់ពីមុនដែលផ្តល់ភាពធន់នឹងមុខងារមីតូខនឌ្រី និងបង្ហាញថាការខូចសរសៃប្រសាទអាចត្រូវបានបញ្ច្រាស់សូម្បីតែនៅដំណាក់កាលចុងក្រោយនៃជំងឺក៏ដោយ។
តួនាទី​ស្នូល​របស់​មីតូខនឌ្រី​ក្នុង​ការរក្សា​ការរំលាយ​អាហារ​ថាមពល​ណឺរ៉ូន​ត្រូវ​បាន​សង្កត់ធ្ងន់​ដោយ​រោគសញ្ញា​សរសៃប្រសាទ​យ៉ាងទូលំទូលាយ​ដែល​ជាប់​ទាក់ទង​នឹង​ជំងឺ​មីតូខនឌ្រី​របស់​មនុស្ស។ ជំងឺ​ភាគច្រើន​ទាំងនេះ​បណ្តាលមកពី​ការផ្លាស់ប្តូរ​ហ្សែន​ដែល​គ្រប់គ្រង​ការបញ្ចេញ​ហ្សែន​មីតូខនឌ្រី (1, 2) ឬ​ការបំផ្លាញ​ហ្សែន​ដែល​ទាក់ទង​នឹង​ឌីណាមិក​មីតូខនឌ្រី ដែល​ប៉ះពាល់​ដោយ​ប្រយោល​ដល់​ស្ថេរភាព​នៃ DNA មីតូខនឌ្រី (mtDNA) (3, 4)។ ការងារ​ក្នុង​គំរូ​សត្វ​បាន​បង្ហាញ​ថា ដើម្បី​ឆ្លើយតប​ទៅនឹង​មុខងារ​មីតូខនឌ្រី​នៅក្នុង​ជាលិកា​ជុំវិញ ផ្លូវ​រំលាយ​អាហារ​អភិរក្ស (5-7) អាច​ត្រូវ​បាន​ធ្វើឱ្យ​សកម្ម ដែល​ផ្តល់​ព័ត៌មាន​សំខាន់ៗ​សម្រាប់​ការយល់ដឹង​ស៊ីជម្រៅ​អំពី​រោគវិទ្យា​នៃ​ជំងឺ​ស្មុគស្មាញ​ទាំងនេះ។ ផ្ទុយទៅវិញ ការយល់ដឹង​របស់​យើង​អំពី​ការផ្លាស់ប្តូរ​មេតាបូលីស​នៃ​ប្រភេទ​កោសិកា​ជាក់លាក់​ដែល​បណ្តាលមកពី​ការបរាជ័យ​ទូទៅ​នៃ​ការផលិត adenosine triphosphate (ATP) មីតូខនឌ្រី​ក្នុង​ខួរក្បាល​គឺជា​មូលដ្ឋានគ្រឹះ (8) ដោយ​សង្កត់ធ្ងន់​លើ​តម្រូវការ​ក្នុង​ការកំណត់អត្តសញ្ញាណ​គោលដៅ​ព្យាបាល​ដែល​អាច​ប្រើ​ដើម្បី​ការពារ​ឬ​បង្ការ​ជំងឺ។ ការពារ​ការខូច​សរសៃប្រសាទ (9)។ កង្វះ​ព័ត៌មាន​គឺ​ការពិត​ដែល​កោសិកា​សរសៃប្រសាទ​ត្រូវបាន​គេ​ចាត់ទុក​យ៉ាងទូលំទូលាយ​ថា​មាន​ភាពបត់បែន​មេតាបូលីស​មានកម្រិត​ខ្លាំង​បើ​ប្រៀបធៀប​ទៅនឹង​ប្រភេទ​កោសិកា​នៃ​ជាលិកា​ជុំវិញ (10)។ ដោយសារកោសិកាទាំងនេះដើរតួនាទីយ៉ាងសំខាន់ក្នុងការសម្របសម្រួលការផ្គត់ផ្គង់សារធាតុរំលាយអាហារទៅកាន់ណឺរ៉ូន ដើម្បីជំរុញការបញ្ជូនសញ្ញាស៊ីណាបទិក និងឆ្លើយតបទៅនឹងស្ថានភាពរបួស និងជំងឺ សមត្ថភាពក្នុងការសម្របខ្លួនទៅនឹងការរំលាយអាហារកោសិកាទៅនឹងស្ថានភាពលំបាកនៃជាលិកាខួរក្បាលស្ទើរតែមានកម្រិតចំពោះកោសិកាគ្លីយ៉ាល (11-14)។ លើសពីនេះ ភាពមិនដូចគ្នានៃកោសិកាដែលមាននៅក្នុងជាលិកាខួរក្បាលភាគច្រើនរារាំងការសិក្សាអំពីការផ្លាស់ប្តូរមេតាបូលីសដែលកើតឡើងនៅក្នុងក្រុមរងណឺរ៉ូនជាក់លាក់។ ជាលទ្ធផល មានព័ត៌មានតិចតួចណាស់អំពីផលវិបាកកោសិកា និងមេតាបូលីសពិតប្រាកដនៃភាពមិនដំណើរការរបស់មីតូខនឌ្រីនៅក្នុងណឺរ៉ូន។
ដើម្បីយល់ពីផលវិបាកមេតាប៉ូលីសនៃភាពមិនប្រក្រតីនៃមីតូខនឌ្រី យើងបានញែកណឺរ៉ូន Purkinje (PNs) នៅក្នុងដំណាក់កាលផ្សេងៗគ្នានៃការខូចសរសៃប្រសាទដែលបណ្តាលមកពីការបំផ្លាញនៃការលាយបញ្ចូលគ្នានៃភ្នាសខាងក្រៅមីតូខនឌ្រី (Mfn2)។ ទោះបីជាការផ្លាស់ប្តូរហ្សែន Mfn2 ចំពោះមនុស្សត្រូវបានផ្សារភ្ជាប់ជាមួយនឹងទម្រង់នៃជំងឺសរសៃប្រសាទញ្ញាណម៉ូទ័រតំណពូជ ដែលគេស្គាល់ថាជា Charcot-Marie-Tooth ប្រភេទ 2A (15) ក៏ដោយ ការបំផ្លាញ Mfn2 តាមលក្ខខណ្ឌចំពោះសត្វកណ្ដុរគឺជាការបញ្ចូលវិធីសាស្ត្រខូចមុខងារអុកស៊ីតកម្ម Phosphorylation (OXPHOS) ដែលត្រូវបានគេទទួលស្គាល់យ៉ាងច្បាស់។ អនុប្រភេទណឺរ៉ូនផ្សេងៗ (16-19) និងលក្ខណៈរោគវិនិច្ឆ័យនៃការខូចសរសៃប្រសាទដែលជាលទ្ធផលត្រូវបានអមដោយរោគសញ្ញាសរសៃប្រសាទដែលវិវឌ្ឍទៅមុខ ដូចជាជំងឺចលនា (18, 19) ឬ cerebellar ataxia (16)។ ដោយប្រើប្រាស់ការរួមបញ្ចូលគ្នានៃប្រូតេអូមិចបរិមាណ (LFQ) មេតាបូឡូមិច ការថតរូបភាព និងវិធីសាស្ត្រវីរុសវិទ្យា យើងបង្ហាញថា ការរលួយសរសៃប្រសាទជាលំដាប់បង្កឱ្យមានយ៉ាងខ្លាំងនូវ pyruvate carboxylase (PCx) និងកត្តាផ្សេងទៀតដែលពាក់ព័ន្ធនឹងជំងឺក្រិនសរសៃឈាមនៃ PNs នៅក្នុងខ្លួន។ ដើម្បីផ្ទៀងផ្ទាត់ភាពពាក់ព័ន្ធនៃការរកឃើញនេះ យើងបានបន្ថយការបញ្ចេញមតិរបស់ PCx នៅក្នុង PNs ដែលខ្វះ Mfn2 ហើយបានរកឃើញថាប្រតិបត្តិការនេះបានធ្វើឱ្យភាពតានតឹងអុកស៊ីតកម្មកាន់តែធ្ងន់ធ្ងរ និងបង្កើនល្បឿននៃការរលួយសរសៃប្រសាទ ដោយហេតុនេះបង្ហាញថា azoospermia ផ្តល់នូវការស្លាប់កោសិកា។ ការសម្របខ្លួនមេតាបូលីស។ ការបញ្ចេញមតិធ្ងន់ធ្ងរនៃ MFN2 អាចជួយសង្គ្រោះ PN រលួយចុងក្រោយទាំងស្រុងជាមួយនឹងកង្វះ OXPHOS ធ្ងន់ធ្ងរ ការប្រើប្រាស់ DNA មីតូខនឌ្រីយ៉ាងច្រើន និងបណ្តាញមីតូខនឌ្រីដែលខូច ដែលបញ្ជាក់បន្ថែមទៀតថា ទម្រង់នៃការរលួយសរសៃប្រសាទនេះអាចងើបឡើងវិញបានសូម្បីតែនៅដំណាក់កាលជឿនលឿននៃជំងឺមុនពេលកោសិកាស្លាប់។
ដើម្បីមើលឃើញមីតូខន់ឌ្រីនៅក្នុង PNs នៃ Mfn2 knockout យើងបានប្រើពូជកណ្ដុរដែលអនុញ្ញាតឱ្យមីតូខន់ឌ្រីដែលពឹងផ្អែកលើ Cre ដើម្បីកំណត់គោលដៅការបញ្ចេញមតិ Cre នៃប្រូតេអ៊ីន fluorescent ពណ៌លឿង (YFP) (mtYFP) (20) ហើយបានពិនិត្យមើលរូបរាងមីតូខន់ឌ្រីនៅក្នុង vivo។ យើងបានរកឃើញថាការបំផ្លាញហ្សែន Mfn2 នៅក្នុង PNs នឹងនាំឱ្យមានការបែងចែកបន្តិចម្តងៗនៃបណ្តាញមីតូខន់ឌ្រី (រូបភាព S1A) ហើយការផ្លាស់ប្តូរដំបូងបំផុតត្រូវបានរកឃើញនៅអាយុ 3 សប្តាហ៍។ ផ្ទុយទៅវិញ ការរលួយគួរឱ្យកត់សម្គាល់នៃស្រទាប់កោសិកា PN ដូចដែលបានបង្ហាញដោយការបាត់បង់សារធាតុ Calbindin immunostaining មិនបានចាប់ផ្តើមរហូតដល់អាយុ 12 សប្តាហ៍ទេ (រូបភាពទី 1, A និង B)។ ភាពមិនស៊ីគ្នានៃពេលវេលារវាងការផ្លាស់ប្តូរដំបូងបំផុតនៅក្នុងរូបរាងមីតូខន់ឌ្រី និងការចាប់ផ្តើមដែលអាចមើលឃើញនៃការស្លាប់របស់ណឺរ៉ូនបានជំរុញឱ្យយើងស៊ើបអង្កេតការផ្លាស់ប្តូរមេតាប៉ូលីសដែលបង្កឡើងដោយមុខងារមីតូខន់ឌ្រីមិនប្រក្រតីមុនពេលកោសិកាស្លាប់។ យើងបានបង្កើតយុទ្ធសាស្ត្រតម្រៀបកោសិកាដែលបានធ្វើឱ្យសកម្មដោយសារធាតុ fluorescence (FACS) ដើម្បីញែក PN ដែលបញ្ចេញ YFP (YFP+) (រូបភាពទី 1C) និងនៅក្នុងកណ្ដុរត្រួតពិនិត្យ (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP: : L7-cre) ដែលតទៅនេះហៅថា CTRL (រូបភាព S1B)។ ការបង្កើនប្រសិទ្ធភាពនៃយុទ្ធសាស្ត្រ gating ដោយផ្អែកលើអាំងតង់ស៊ីតេដែលទាក់ទងនៃសញ្ញា YFP អនុញ្ញាតឱ្យយើងបន្សុទ្ធរាងកាយ YFP+ (YFPhigh) នៃ PNs ពីបំណែកអ័ក្ស/dendritic fluorescent ដែលទំនងជា (YFPlow; រូបភាព S1D ខាងឆ្វេង) ដែលបានបញ្ជាក់ដោយមីក្រូទស្សន៍ confocal (រូបភាព S1D ខាងស្តាំ)។ ដើម្បីផ្ទៀងផ្ទាត់អត្តសញ្ញាណនៃចំនួនប្រជាជនដែលបានចាត់ថ្នាក់ យើងបានធ្វើប្រូតេអូមិក LFQ ហើយបន្ទាប់មកវិភាគសមាសធាតុចម្បង ហើយបានរកឃើញថាមានការបែងចែកច្បាស់លាស់រវាងកោសិកា YFPhigh និង YFPneg (រូបភាព S1C)។ កោសិកា YFPhigh បានបង្ហាញពីការកើនឡើងសុទ្ធនៃសញ្ញាសម្គាល់ PN ដែលគេស្គាល់ (ឧ. Calb1, Pcp2, Grid2 និង Itpr3) (21, 22) ប៉ុន្តែមិនមានការកើនឡើងនៃប្រូតេអ៊ីនដែលបង្ហាញជាទូទៅនៅក្នុងណឺរ៉ូន ឬប្រភេទកោសិកាផ្សេងទៀតទេ (រូបភាពទី 1D)។ ការប្រៀបធៀបរវាងគំរូនៅក្នុងកោសិកា YFPhigh ដែលបានចាត់ថ្នាក់ដែលប្រមូលបានក្នុងការពិសោធន៍ឯករាជ្យបានបង្ហាញមេគុណសហសម្ព័ន្ធ > 0.9 ដែលបង្ហាញពីភាពអាចបង្កើតឡើងវិញបានល្អរវាងការចម្លងជីវសាស្រ្ត (រូបភាព S1E)។ សរុបមក ទិន្នន័យទាំងនេះបានផ្ទៀងផ្ទាត់ផែនការរបស់យើងសម្រាប់ការញែកដាច់ស្រយាលស្រួចស្រាវ និងជាក់លាក់នៃ PN ដែលអាចធ្វើទៅបាន។ ដោយសារតែប្រព័ន្ធកម្មវិធីបញ្ជា L7-cre ដែលប្រើបង្កឱ្យមានការរួមបញ្ចូលគ្នានៃ mosaic ក្នុងសប្តាហ៍ដំបូងបន្ទាប់ពីការសម្រាលកូន (23) យើងបានចាប់ផ្តើមសម្លាប់កណ្តុរពី CTRL និងណឺរ៉ូនប្រមូលតាមលក្ខខណ្ឌ (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre)។ បន្ទាប់ពីការបញ្ចូលគ្នាឡើងវិញត្រូវបានបញ្ចប់ វាត្រូវបានគេហៅថា Mfn2cKO នៅអាយុ 4 សប្តាហ៍។ ជាចំណុចបញ្ចប់ យើងបានជ្រើសរើសអាយុ 8 សប្តាហ៍ នៅពេលដែលស្រទាប់ PN នៅដដែល ទោះបីជាមានការបែកខ្ញែកមីតូខនឌ្រីយ៉ាងច្បាស់ក៏ដោយ (រូបភាពទី 1B និងរូបភាព S1A)។ សរុបមក យើងបានវាស់បរិមាណប្រូតេអ៊ីនសរុបចំនួន 3013 ដែលក្នុងនោះប្រហែល 22% ត្រូវបានផ្អែកលើចំណារពន្យល់ MitoCarta 2.0 ដោយផ្អែកលើប្រូតេអូមមីតូខនឌ្រីជាមីតូខនឌ្រី (រូបភាពទី 1E) (រូបភាពទី 1E) (24)។ ការវិភាគការបញ្ចេញហ្សែនឌីផេរ៉ង់ស្យែលដែលបានអនុវត្តនៅសប្តាហ៍ទី 8 បានបង្ហាញថា មានតែ 10.5% នៃប្រូតេអ៊ីនទាំងអស់ដែលមានការផ្លាស់ប្តូរគួរឱ្យកត់សម្គាល់ (រូបភាពទី 1F និងរូបភាព S1F) ដែលក្នុងនោះប្រូតេអ៊ីនចំនួន 195 ត្រូវបានគ្រប់គ្រងចុះក្រោម និងប្រូតេអ៊ីនចំនួន 120 ត្រូវបានគ្រប់គ្រងឡើងលើ (រូបភាពទី 1F)។ គួរកត់សម្គាល់ថា "ការវិភាគផ្លូវច្នៃប្រឌិត" នៃសំណុំទិន្នន័យនេះបង្ហាញថា ហ្សែនដែលបានបង្ហាញឌីផេរ៉ង់ស្យែលភាគច្រើនជាកម្មសិទ្ធិរបស់សំណុំផ្លូវមេតាបូលីសជាក់លាក់ដែលមានកម្រិត (រូបភាពទី 1G)។ គួរឱ្យចាប់អារម្មណ៍ ទោះបីជាការថយចុះនៃផ្លូវដែលទាក់ទងនឹង OXPHOS និងការបញ្ជូនសញ្ញាកាល់ស្យូមបញ្ជាក់ពីការបង្កឡើងនៃមុខងារមីតូខនឌ្រីនៅក្នុង PNs ដែលខ្វះការលាយបញ្ចូលគ្នាក៏ដោយ ប្រភេទផ្សេងទៀតដែលភាគច្រើនពាក់ព័ន្ធនឹងការរំលាយអាហារអាស៊ីតអាមីណូត្រូវបានធ្វើឱ្យកើនឡើងគួរឱ្យកត់សម្គាល់ ដែលស្របនឹងការរំលាយអាហារដែលកើតឡើងនៅក្នុង PNs មីតូខនឌ្រី។ ការភ្ជាប់ឡើងវិញគឺស្របគ្នា។ មុខងារមិនដំណើរការ។
(ក) រូបថតកុងហ្វូកាល់តំណាងនៃផ្នែកខួរក្បាលតូចនៃកណ្ដុរ CTRL និង Mfn2cKO ដែលបង្ហាញពីការបាត់បង់ PNs បន្តិចម្តងៗ (calbindin, ប្រផេះ); ស្នូលត្រូវបានទប់ទល់ជាមួយ DAPI។ (ខ) ការវាស់បរិមាណនៃ (ក) (ការវិភាគតែមួយផ្លូវនៃភាពខុសគ្នា, ***P<0.001; n = 4 ទៅ 6 រង្វង់ពីកណ្ដុរបី)។ (គ) លំហូរការងារពិសោធន៍។ (ឃ) ការចែកចាយផែនទីកំដៅនៃសញ្ញាសម្គាល់ជាក់លាក់ចំពោះ Purkinje (កំពូល) និងប្រភេទកោសិកាផ្សេងទៀត (កណ្តាល)។ (ង) ដ្យាក្រាម Venn បង្ហាញចំនួនប្រូតេអ៊ីនមីតូខនឌ្រីដែលត្រូវបានកំណត់នៅក្នុង PN ដែលបានចាត់ថ្នាក់។ (ច) គ្រោងភ្នំភ្លើងនៃប្រូតេអ៊ីនដែលបានបង្ហាញខុសគ្នានៅក្នុងណឺរ៉ូន Mfn2cKO នៅ 8 សប្តាហ៍ (តម្លៃកាត់ផ្តាច់សារៈសំខាន់ 1.3)។ (ឆ) ការវិភាគផ្លូវច្នៃប្រឌិតបង្ហាញពីផ្លូវឡើងចុះ (ក្រហម) និងចុះ (ខៀវ) សំខាន់បំផុតទាំងប្រាំនៅក្នុង PN Mfn2cKO ដែលត្រូវបានចាត់ថ្នាក់ជា 8 សប្តាហ៍។ កម្រិតនៃការបញ្ចេញមតិជាមធ្យមនៃប្រូតេអ៊ីននីមួយៗដែលបានរកឃើញត្រូវបានបង្ហាញ។ ផែនទីកំដៅមាត្រដ្ឋានប្រផេះ៖ តម្លៃ P ដែលបានកែតម្រូវ។ ns មិនសំខាន់ទេ។
ទិន្នន័យប្រូតេអូមិចបានបង្ហាញថា ការបញ្ចេញមតិប្រូតេអ៊ីននៃស្មុគស្មាញ I, III និង IV បានថយចុះជាលំដាប់។ ស្មុគស្មាញ I, III និង IV ទាំងអស់មានផ្ទុកអនុឯកតាសំខាន់ៗដែលបានអ៊ិនកូដដោយ mtDNA ខណៈពេលដែលស្មុគស្មាញ II ដែលត្រូវបានកំណត់កូដដោយនុយក្លេអ៊ែរតែប៉ុណ្ណោះ ជាទូទៅមិនរងផលប៉ះពាល់ទេ (រូបភាពទី 2A និងរូបភាព S2A)។ ស្របនឹងលទ្ធផលប្រូតេអូមិច ភាពស៊ាំនឹងអ៊ីស្តូគីមីវិទ្យានៃផ្នែកជាលិកាខួរក្បាលតូចបានបង្ហាញថា កម្រិតអនុឯកតា MTCO1 (អនុឯកតាស៊ីតូក្រូម C អុកស៊ីដាសមីតូខនឌ្រី 1) នៃស្មុគស្មាញ IV នៅក្នុង PN បានថយចុះជាលំដាប់ (រូបភាពទី 2B)។ អនុឯកតាដែលបានអ៊ិនកូដដោយ mtDNA Mtatp8 ត្រូវបានកាត់បន្ថយគួរឱ្យកត់សម្គាល់ (រូបភាព S2A) ខណៈពេលដែលកម្រិតស្ថានភាពស្ថិរភាពនៃអនុឯកតាសំយោគ ATP ដែលបានអ៊ិនកូដដោយនុយក្លេអ៊ែរនៅតែមិនផ្លាស់ប្តូរ ដែលស្របនឹងស្មុគស្មាញអនុសមាសធាតុសំយោគ ATP ដែលមានស្ថេរភាពដែលគេស្គាល់ F1 នៅពេលដែលការបញ្ចេញមតិ mtDNA មានស្ថេរភាព។ ការបង្កើតគឺស្របគ្នា។ ការរំខាន (7)។ ការវាយតម្លៃកម្រិត mtDNA នៅក្នុង Mfn2cKO PNs ដែលបានតម្រៀបដោយប្រតិកម្មខ្សែសង្វាក់ប៉ូលីមែរពេលវេលាជាក់ស្តែង (qPCR) បានបញ្ជាក់ពីការថយចុះបន្តិចម្តងៗនៃចំនួនច្បាប់ចម្លង mtDNA។ បើប្រៀបធៀបជាមួយក្រុមត្រួតពិនិត្យ នៅអាយុ 8 សប្តាហ៍ មានតែប្រហែល 20% នៃកម្រិត mtDNA ប៉ុណ្ណោះដែលត្រូវបានរក្សាទុក (រូបភាពទី 2C)។ ស្របនឹងលទ្ធផលទាំងនេះ ការជ្រលក់ពណ៌មីក្រូទស្សន៍ confocal នៃ Mfn2cKO PNs ត្រូវបានប្រើដើម្បីរកឃើញ DNA ដែលបង្ហាញពីការប្រើប្រាស់នុយក្លេអូទីតមីតូខនឌ្រីដែលអាស្រ័យលើពេលវេលា (រូបភាពទី 2D)។ យើងបានរកឃើញថា មានតែបេក្ខជនមួយចំនួនដែលពាក់ព័ន្ធនឹងការរិចរិលប្រូតេអ៊ីនមីតូខនឌ្រី និងការឆ្លើយតបស្ត្រេសប៉ុណ្ណោះដែលត្រូវបានធ្វើឱ្យប្រសើរឡើង រួមទាំង Lonp1, Afg3l2 និង Clpx និងកត្តាផ្គុំស្មុគស្មាញ OXPHOS។ មិនមានការផ្លាស់ប្តូរគួរឱ្យកត់សម្គាល់នៅក្នុងកម្រិតនៃប្រូតេអ៊ីនដែលពាក់ព័ន្ធនឹង apoptosis ត្រូវបានរកឃើញទេ (រូបភាព S2B)។ ស្រដៀងគ្នានេះដែរ យើងបានរកឃើញថា បណ្តាញមីតូខនឌ្រី និង reticulum endoplasmic ដែលពាក់ព័ន្ធនឹងការដឹកជញ្ជូនកាល់ស្យូមមានតែការផ្លាស់ប្តូរតិចតួចប៉ុណ្ណោះ (រូបភាព S2C)។ លើសពីនេះ ការវាយតម្លៃប្រូតេអ៊ីនដែលទាក់ទងនឹង autophagy មិនបានរកឃើញការផ្លាស់ប្តូរគួរឱ្យកត់សម្គាល់នោះទេ ដែលស្របនឹងការបង្កើត autophagosomes ដែលអាចមើលឃើញដែលសង្កេតឃើញនៅក្នុង vivo ដោយ immunohistochemistry និងមីក្រូទស្សន៍អេឡិចត្រុង (រូបភាព S3)។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ មុខងារ OXPHOS ដែលរីកចម្រើននៅក្នុង PNs ត្រូវបានអមដោយការផ្លាស់ប្តូរមីតូខនឌ្រី ultrastructural ជាក់ស្តែង។ ចង្កោមមីតូខនឌ្រីអាចត្រូវបានគេមើលឃើញនៅក្នុងតួកោសិកា និងដើមឈើ dendritic នៃ Mfn2cKO PNs ដែលមានអាយុ 5 និង 8 សប្តាហ៍ ហើយរចនាសម្ព័ន្ធភ្នាសខាងក្នុងបានឆ្លងកាត់ការផ្លាស់ប្តូរយ៉ាងខ្លាំង (រូបភាព S4, A និង B)។ ស្របនឹងការផ្លាស់ប្តូរ ultrastructural ទាំងនេះ និងការថយចុះគួរឱ្យកត់សម្គាល់នៃ mtDNA ការវិភាគនៃចំណិត cerebellar ខួរក្បាលស្រួចស្រាវជាមួយ tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM) បានបង្ហាញថាសក្តានុពលភ្នាសមីតូខនឌ្រីនៅក្នុង Mfn2cKO PNs ត្រូវបានថយចុះគួរឱ្យកត់សម្គាល់ (រូបភាព S4C)។
(ក) ការវិភាគពេលវេលានៃកម្រិតនៃការបញ្ចេញមតិនៃស្មុគស្មាញ OXPHOS។ ពិចារណាតែប្រូតេអ៊ីនដែលមាន P<0.05 នៅ 8 សប្តាហ៍ (ANOVA ពីរផ្លូវ)។ បន្ទាត់ចំនុច៖ គ្មានការកែតម្រូវបើប្រៀបធៀបទៅនឹង CTRL។ (ខ) ឆ្វេង៖ ឧទាហរណ៍នៃផ្នែកខួរក្បាលតូចដែលមានស្លាកសញ្ញាប្រឆាំង MTCO1 (របារមាត្រដ្ឋាន 20 μm)។ តំបន់ដែលកាន់កាប់ដោយសាកសពកោសិកា Purkinje ត្រូវបានគ្របដណ្ដប់ដោយពណ៌លឿង។ ស្តាំ៖ ការវាស់បរិមាណកម្រិត MTCO1 (ការវិភាគតែមួយផ្លូវនៃភាពខុសគ្នា; n = 7 ទៅ 20 កោសិកាដែលបានវិភាគពីកណ្តុរបី)។ (គ) ការវិភាគ qPCR នៃលេខចម្លង mtDNA នៅក្នុង PN ដែលបានតម្រៀប (ការវិភាគតែមួយផ្លូវនៃភាពខុសគ្នា; n = 3 ទៅ 7 កណ្តុរ)។ (ឃ) ឆ្វេង៖ ឧទាហរណ៍នៃចំណិតខួរក្បាលតូចដែលមានស្លាកសញ្ញាប្រឆាំង DNA (របារមាត្រដ្ឋាន 20 μm)។ តំបន់ដែលកាន់កាប់ដោយសាកសពកោសិកា Purkinje ត្រូវបានគ្របដណ្ដប់ដោយពណ៌លឿង។ ស្តាំ៖ ការវាស់បរិមាណនៃដំបៅ mtDNA (ការវិភាគតែមួយផ្លូវនៃភាពខុសគ្នា; n = 5 ទៅ 9 កោសិកាពីកណ្តុរបី)។ (E) ឧទាហរណ៍នៃផ្នែក cerebellar ស្រួចស្រាវដែលបង្ហាញកោសិកា mitoYFP + Purkinje (ព្រួញ) នៅក្នុងការថតក្លីបបំណះកោសិកាទាំងមូល។ (F) ការវាស់បរិមាណខ្សែកោង IV។ (G) ការថតតំណាងនៃការចាក់ចរន្ត depolarising នៅក្នុងកោសិកា CTRL និង Mfn2cKO Purkinje។ ដានខាងលើ៖ ជីពចរដំបូងដែលបង្កឱ្យមាន AP។ ដានខាងក្រោម៖ ប្រេកង់ AP អតិបរមា។ (H) ការវាស់បរិមាណនៃការបញ្ចូលដោយឯកឯងក្រោយស៊ីណាបទិក (sPSPs)។ ដានថតតំណាង និងសមាមាត្រពង្រីករបស់វាត្រូវបានបង្ហាញក្នុង (I)។ ការវិភាគឯកតោភាគីនៃភាពខុសគ្នាបានវិភាគកោសិកា n = 5 ដល់ 20 ពីកណ្តុរបី។ ទិន្នន័យត្រូវបានបង្ហាញជាមធ្យម ± SEM; *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001។ (J) ដានតំណាងនៃ AP ដោយឯកឯងដែលបានកត់ត្រាដោយប្រើរបៀបក្លីបបំណះដែលមានរន្ធ។ ដានខាងលើ៖ ប្រេកង់ AP អតិបរមា។ ដានខាងក្រោម៖ ការពង្រីកនៃ AP តែមួយ។ (K) វាស់បរិមាណប្រេកង់ AP ជាមធ្យម និងអតិបរមាយោងទៅតាម (J)។ ការធ្វើតេស្ត Mann-Whitney; n = 5 កោសិកាត្រូវបានវិភាគពីកណ្តុរបួន។ ទិន្នន័យត្រូវបានបង្ហាញជាមធ្យម ± SEM; មិនសំខាន់ទេ។
ការខូចខាត OXPHOS ជាក់ស្តែងត្រូវបានរកឃើញនៅក្នុង PN Mfn2cKO អាយុ 8 សប្តាហ៍ ដែលបង្ហាញថាមុខងារសរីរវិទ្យានៃណឺរ៉ូនមានភាពមិនប្រក្រតីធ្ងន់ធ្ងរ។ ដូច្នេះ យើងបានវិភាគលក្ខណៈអគ្គិសនីអកម្មនៃណឺរ៉ូនដែលខ្វះ OXPHOS នៅអាយុ 4 ទៅ 5 សប្តាហ៍ និង 7 ទៅ 8 សប្តាហ៍ ដោយធ្វើការថតចម្លងបំណះកោសិកាទាំងមូលនៅក្នុងចំណិត cerebellar ស្រួចស្រាវ (រូបភាពទី 2E)។ ដោយមិននឹកស្មានដល់ សក្តានុពលភ្នាសសម្រាកជាមធ្យម និងភាពធន់នឹងការបញ្ចូលរបស់ណឺរ៉ូន Mfn2cKO គឺស្រដៀងគ្នាទៅនឹងការគ្រប់គ្រង ទោះបីជាមានភាពខុសគ្នាបន្តិចបន្តួចរវាងកោសិកាក៏ដោយ (តារាងទី 1)។ ស្រដៀងគ្នានេះដែរ នៅអាយុ 4 ទៅ 5 សប្តាហ៍ មិនមានការផ្លាស់ប្តូរគួរឱ្យកត់សម្គាល់នៅក្នុងទំនាក់ទំនងចរន្ត-វ៉ុល (ខ្សែកោង IV) ត្រូវបានរកឃើញទេ (រូបភាពទី 2F)។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ គ្មានណឺរ៉ូន Mfn2cKO អាយុ 7 ទៅ 8 សប្តាហ៍ណាម្នាក់បានរស់រានមានជីវិតពីរបប IV (ជំហានអ៊ីពែរប៉ូឡារីសាស្យុង) ទេ ដែលបង្ហាញថាមានភាពរសើបយ៉ាងច្បាស់ចំពោះសក្តានុពលអ៊ីពែរប៉ូឡារីសាស្យុងនៅដំណាក់កាលចុងក្រោយនេះ។ ផ្ទុយទៅវិញ នៅក្នុងណឺរ៉ូន Mfn2cKO ចរន្តឌីប៉ូឡារីសដែលបណ្តាលឱ្យមានការបញ្ចេញសក្តានុពលសកម្មភាពដដែលៗ (AP) ត្រូវបានអត់ឱនឱ្យបានល្អ ដែលបង្ហាញថាលំនាំនៃការបញ្ចេញសរុបរបស់វាមិនខុសគ្នាគួរឱ្យកត់សម្គាល់ពីណឺរ៉ូនត្រួតពិនិត្យអាយុ 8 សប្តាហ៍ទេ (តារាងទី 1 និងរូបភាពទី 2G)។ ស្រដៀងគ្នានេះដែរ ប្រេកង់ និងទំហំនៃចរន្តក្រោយស៊ីណាបទិកដោយឯកឯង (sPSCs) គឺអាចប្រៀបធៀបទៅនឹងក្រុមត្រួតពិនិត្យ ហើយភាពញឹកញាប់នៃព្រឹត្តិការណ៍បានកើនឡើងពី 4 សប្តាហ៍ទៅ 5 សប្តាហ៍ ទៅ 7 សប្តាហ៍ទៅ 8 សប្តាហ៍ជាមួយនឹងការកើនឡើងស្រដៀងគ្នា (រូបភាពទី 2, H និង I)។ រយៈពេលនៃភាពចាស់ទុំនៃស៊ីណាបទិកនៅក្នុង PNs (25)។ លទ្ធផលស្រដៀងគ្នានេះត្រូវបានទទួលបន្ទាប់ពីបំណះ PNs ដែលមានរន្ធ។ ការកំណត់រចនាសម្ព័ន្ធនេះការពារការសងប្រាក់វិញដែលអាចកើតមាននៃពិការភាព ATP កោសិកា ដូចដែលអាចកើតឡើងនៅក្នុងការថតការគៀបបំណះកោសិកាទាំងមូល។ ជាពិសេស សក្តានុពលភ្នាសសម្រាក និងភាពញឹកញាប់នៃការបាញ់ដោយឯកឯងនៃណឺរ៉ូន Mfn2cKO មិនត្រូវបានប៉ះពាល់ទេ (រូបភាពទី 2, J និង K)។ សរុបមក លទ្ធផលទាំងនេះបង្ហាញថា PNs ដែលមានមុខងារមិនប្រក្រតីនៃ OXPHOS ជាក់ស្តែងអាចទប់ទល់នឹងលំនាំនៃការបញ្ចេញប្រេកង់ខ្ពស់បានយ៉ាងល្អ ដែលបង្ហាញថាមានយន្តការផ្តល់សំណងដែលអនុញ្ញាតឱ្យពួកគេរក្សាការឆ្លើយតបអេឡិចត្រូហ្វីស៊ីយ៉ូលីកស្ទើរតែធម្មតា។
ទិន្នន័យត្រូវបានបង្ហាញជាមធ្យម ± SEM (ការវិភាគវ៉ារ្យង់តែម្ខាង ការធ្វើតេស្តប្រៀបធៀបច្រើនរបស់ Holm-Sidak; *P<0.05)។ លេខឯកតាត្រូវបានចង្អុលបង្ហាញដោយវង់ក្រចក។
យើងបានចាប់ផ្តើមស៊ើបអង្កេតថាតើប្រភេទណាមួយនៅក្នុងសំណុំទិន្នន័យប្រូតេអូមិច (រូបភាពទី 1G) រួមបញ្ចូលផ្លូវដែលអាចទប់ទល់នឹងកង្វះ OXPHOS ធ្ងន់ធ្ងរដែរឬទេ ដោយហេតុនេះពន្យល់ពីមូលហេតុដែល PN ដែលរងផលប៉ះពាល់អាចរក្សាបាននូវអេឡិចត្រូសរីរវិទ្យាជិតធម្មតា (រូបភាពទី 2 ពី E ដល់ K)។ ការវិភាគប្រូតេអូមិចបានបង្ហាញថាអង់ស៊ីមដែលពាក់ព័ន្ធនឹងការរំលាយអាស៊ីតអាមីណូខ្សែសង្វាក់សាខា (BCAA) ត្រូវបានគ្រប់គ្រងកើនឡើងគួរឱ្យកត់សម្គាល់ (រូបភាពទី 3A និងរូបភាព S5A) ហើយផលិតផលចុងក្រោយ acetyl-CoA (CoA) ឬ succinyl CoA អាចបំពេញបន្ថែម tricarboxylates នៅក្នុងវដ្តអាស៊ីតសរសៃឈាម (TCA)។ យើងបានរកឃើញថាមាតិកានៃ BCAA transaminase 1 (BCAT1) និង BCAT2 ទាំងពីរបានកើនឡើង។ ពួកវាជំរុញជំហានដំបូងនៃដំណើរការរំលាយ BCAA ដោយបង្កើត glutamate ពី α-ketoglutarate (26)។ អនុឯកតាទាំងអស់ដែលបង្កើតជាស្មុគស្មាញ keto acid dehydrogenase (BCKD) ដែលមានខ្សែសង្វាក់សាខាត្រូវបានធ្វើឱ្យប្រសើរឡើង (ស្មុគស្មាញនេះជំរុញឱ្យមាន decarboxylation ជាបន្តបន្ទាប់ និងមិនអាចត្រឡប់វិញបាននៃគ្រោងឆ្អឹងកាបូន BCAA លទ្ធផល) (រូបភាពទី 3A និងរូបភាព S5A)។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ មិនមានការផ្លាស់ប្តូរជាក់ស្តែងនៅក្នុង BCAA ខ្លួនឯងត្រូវបានរកឃើញនៅក្នុង PN ដែលបានតម្រៀបនោះទេ ដែលអាចបណ្តាលមកពីការកើនឡើងនៃការស្រូបយកអាស៊ីតអាមីណូសំខាន់ៗទាំងនេះនៅក្នុងកោសិកា ឬការប្រើប្រាស់ប្រភពផ្សេងទៀត (គ្លុយកូស ឬអាស៊ីតឡាក់ទិក) ដើម្បីបំពេញបន្ថែមវដ្ត TCA (រូបភាព S5B)។ PN ដែលខ្វះ OXPHOS ក៏បានបង្ហាញពីការកើនឡើងនៃសកម្មភាពបំបែក និង transamination នៃ glutamine នៅអាយុ 8 សប្តាហ៍ ដែលអាចឆ្លុះបញ្ចាំងដោយការកើនឡើងនៃអង់ស៊ីមមីតូខនឌ្រី glutaminase (GLS) និង glutamine pyruvate transaminase 2 (GPT2) (រូបភាពទី 3, A និង C)។ គួរកត់សម្គាល់ថាការកើនឡើងនៃ GLS ត្រូវបានកំណត់ចំពោះ isoform glutaminase C (GLS-GAC) ដែលបំបែក (ការផ្លាស់ប្តូរ Mfn2cKO/CTRL គឺប្រហែល 4.5 ដង, P = 0.05) ហើយការកើនឡើងជាក់លាក់របស់វានៅក្នុងជាលិកាមហារីកអាចគាំទ្រដល់ជីវថាមពលមីតូខនឌ្រី។ (27)។
(ក) ផែនទីកំដៅបង្ហាញពីការផ្លាស់ប្តូរកម្រិតប្រូតេអ៊ីនសម្រាប់ផ្លូវដែលបានបញ្ជាក់នៅសប្តាហ៍ទី 8។ (ខ) ឧទាហរណ៍នៃចំណិតខួរក្បាលតូចដែលមានស្លាកសញ្ញាអង្គបដិប្រាណប្រឆាំងនឹង PCx (របារមាត្រដ្ឋាន 20 μm)។ ព្រួញពណ៌លឿងចង្អុលទៅតួកោសិកា Purkinje។ (គ) ការវិភាគការបញ្ចេញមតិប្រូតេអ៊ីនតាមពេលវេលាត្រូវបានកំណត់ថាជាបេក្ខជនសំខាន់សម្រាប់ជំងឺក្រិនសរសៃឈាម (ការធ្វើតេស្ត t ច្រើន *FDR <5%; n = 3-5 កណ្តុរ)។ (ឃ) ខាងលើ៖ ដ្យាក្រាមគ្រោងការណ៍បង្ហាញពីវិធីផ្សេងៗគ្នានៃការបញ្ចូលកាបូនដែលមានស្លាកសញ្ញាដែលមាននៅក្នុងឧបករណ៍តាមដាន [1-13C]pyruvate (ឧ. តាមរយៈ PDH ឬផ្លូវឆ្លងកាត់សរសៃឈាម)។ ខាងក្រោម៖ តារាងវីយូឡុងបង្ហាញពីភាគរយនៃកាបូនដែលមានស្លាកសញ្ញាតែមួយ (M1) ដែលបានបំលែងទៅជាអាស៊ីតអាស្ប៉ាទិក អាស៊ីតនៃក្រូចឆ្មា និងអាស៊ីតម៉ាលីក បន្ទាប់ពីដាក់ស្លាកចំណិតខួរក្បាលតូចស្រួចស្រាវជាមួយ [1-13C]pyruvate (ការធ្វើតេស្ត t គូ; ** P <0.01)។ (ង) ការវិភាគប្រវត្តិពេលវេលាដ៏ទូលំទូលាយនៃផ្លូវដែលបានចង្អុលបង្ហាញ។ ពិចារណាតែប្រូតេអ៊ីនដែលមាន P<0.05 នៅសប្តាហ៍ទី 8​។ បន្ទាត់​ចំនុចៗ៖ គ្មាន​តម្លៃ​កែតម្រូវ (ការវិភាគ​ទ្វេភាគី​នៃ​ភាព​ប្រែប្រួល; * P <0.05; *** P <0.001)។ ទិន្នន័យ​ត្រូវ​បាន​បង្ហាញ​ជា​មធ្យម ± SEM។
នៅក្នុងការវិភាគរបស់យើង ការបាត់បង់ BCAA បានក្លាយជាផ្លូវមួយក្នុងចំណោមផ្លូវសំខាន់ៗដែលបង្កើនប្រសិទ្ធភាព។ ការពិតនេះបង្ហាញយ៉ាងច្បាស់ថា បរិមាណខ្យល់ចេញចូលដែលចូលទៅក្នុងវដ្ត TCA អាចត្រូវបានផ្លាស់ប្តូរនៅក្នុង PN ដែលខ្វះ OXPHOS។ នេះអាចតំណាងឱ្យទម្រង់សំខាន់មួយនៃការភ្ជាប់ឡើងវិញនៃមេតាបូលីសណឺរ៉ូន ដែលអាចមានផលប៉ះពាល់ដោយផ្ទាល់ទៅលើសរីរវិទ្យាណឺរ៉ូន និងការរស់រានមានជីវិតក្នុងអំឡុងពេលរក្សាមុខងារ OXPHOS ធ្ងន់ធ្ងរ។ ស្របនឹងសម្មតិកម្មនេះ យើងបានរកឃើញថា អង់ស៊ីមប្រឆាំងជំងឺក្រិនសរសៃឈាមសំខាន់ PCx ត្រូវបានបង្កើនប្រសិទ្ធភាព (Mfn2cKO/CTRL ផ្លាស់ប្តូរប្រហែល 1.5 ដង; រូបភាពទី 3A) ដែលជំរុញការបំលែង pyruvate ទៅជា oxaloacetate (28) ដែលត្រូវបានគេជឿថាមាននៅក្នុងជាលិកាខួរក្បាល។ ការបញ្ចេញមតិនៅក្នុង ត្រូវបានកំណត់ចំពោះ astrocytes (29, 30)។ ស្របនឹងលទ្ធផល proteomics មីក្រូទស្សន៍ confocal បានបង្ហាញថា ការបញ្ចេញមតិ PCx បានកើនឡើងជាពិសេស និងគួរឱ្យកត់សម្គាល់នៅក្នុង PNs ដែលខ្វះ OXPHOS ខណៈពេលដែលប្រតិកម្ម PCx ត្រូវបានកំណត់ជាចម្បងចំពោះកោសិកា glial Bergmann ដែលនៅជាប់គ្នានៃការគ្រប់គ្រង (រូបភាពទី 3B)។ ដើម្បីសាកល្បងមុខងារនៃការកើនឡើងនៃ PCx ដែលសង្កេតឃើញ យើងបានព្យាបាលចំណិត cerebellar ស្រួចស្រាវជាមួយនឹងសារធាតុតាមដាន pyruvate [1-13C]។ នៅពេលដែល pyruvate ត្រូវបានកត់សុីដោយ pyruvate dehydrogenase (PDH) ស្លាកអ៊ីសូតូបរបស់វាបានបាត់ ប៉ុន្តែត្រូវបានបញ្ចូលទៅក្នុងអន្តរការីវដ្ត TCA នៅពេលដែល pyruvate ត្រូវបានរំលាយដោយប្រតិកម្មសរសៃឈាម (រូបភាពទី 3D)។ ដើម្បីគាំទ្រទិន្នន័យប្រូតេអូមិករបស់យើង យើងបានសង្កេតឃើញសញ្ញាសម្គាល់មួយចំនួនធំពីសារធាតុតាមដាននេះនៅក្នុងអាស៊ីតអាស្ប៉ាទិកនៃចំណិត Mfn2cKO ខណៈពេលដែលអាស៊ីតនៃក្រូចឆ្មា និងអាស៊ីតម៉ាលីកក៏មាននិន្នាការមធ្យមដែរ ទោះបីជាមិនសំខាន់ក៏ដោយ (រូបភាពទី 3D)។
នៅក្នុងណឺរ៉ូនដូប៉ាមីនរបស់កណ្ដុរ MitoPark ដែលមានមុខងារមិនប្រក្រតីនៃមីតូខនឌ្រីដែលបណ្តាលមកពីណឺរ៉ូនដូប៉ាមីនដែលបំផ្លាញហ្សែនកត្តាចម្លងមីតូខនឌ្រី A (Tfam) ជាពិសេស (រូបភាព S6B) ការបញ្ចេញមតិ PCx ក៏ត្រូវបានគ្រប់គ្រងយ៉ាងខ្លាំងផងដែរ (31) ដែលបង្ហាញថាជំងឺក្រិនសរសៃឈាមដោយសារអាស៊ីតអាសេតូន។ ការកើតឡើងនៃជំងឺនេះត្រូវបានគ្រប់គ្រងក្នុងអំឡុងពេលមុខងារមិនប្រក្រតីនៃណឺរ៉ូន OXPHOS នៅក្នុងខ្លួន។ វាគួរឱ្យកត់សម្គាល់ថា វាត្រូវបានគេរកឃើញថាអង់ស៊ីមតែមួយគត់ (32-34) ដែលអាចត្រូវបានបង្ហាញនៅក្នុងណឺរ៉ូនដែលអាចទាក់ទងនឹងជំងឺក្រិនសរសៃឈាមត្រូវបានគ្រប់គ្រងយ៉ាងខ្លាំងនៅក្នុង PNs ដែលខ្វះ OXPHOS ដូចជា propionyl-CoA carboxylase (PCC-A) Malonyl-CoA បំប្លែង propionyl-CoA ទៅជា succinyl-CoA និងអង់ស៊ីម malic មីតូខនឌ្រី 3 (ME3) ដែលតួនាទីសំខាន់របស់វាគឺដើម្បីស្តារ pyruvate ពី malate (រូបភាពទី 3, A និង C) (33, 35)។ លើសពីនេះ យើងបានរកឃើញការកើនឡើងគួរឱ្យកត់សម្គាល់នៅក្នុងអង់ស៊ីម Pdk3 ដែលផូស្វ័រ ហើយដូច្នេះធ្វើឱ្យ PDH អសកម្ម (36) ខណៈពេលដែលមិនមានការផ្លាស់ប្តូរណាមួយត្រូវបានរកឃើញនៅក្នុងអង់ស៊ីម Pdp1 ដែលធ្វើឱ្យ PDH ឬស្មុគស្មាញអង់ស៊ីម PDH សកម្មនោះទេ (រូបភាពទី 3A)។ ជាលំដាប់ នៅក្នុង Mern2cKO PNs ការផូស្វ័រនៃអនុឯកតា α1 α (PDHE1α) នៃសមាសធាតុ pyruvate dehydrogenase E1 នៃស្មុគស្មាញ PDH នៅក្នុង Ser293 (ដែលគេដឹងថារារាំងសកម្មភាពអង់ស៊ីមរបស់ PDH) ត្រូវបានបង្កើន (រូបភាព S6C) (រូបភាព S6C)។ Pyruvate មិនមានការចូលទៅកាន់សរសៃឈាមទេ។
ជាចុងក្រោយ យើងបានរកឃើញថា ផ្លូវកំពូលនៃជីវសំយោគសេរីន និងគ្លីស៊ីន វដ្តហ្វូឡាតមីតូខនឌ្រី (1C) ដែលពាក់ព័ន្ធ និងជីវសំយោគប្រូលីន (រូបភាពទី 1G និងរូបភាព S5C) ទាំងអស់ត្រូវបានធ្វើឱ្យសកម្មឡើងគួរឱ្យកត់សម្គាល់ ក្នុងអំឡុងពេលដំណើរការធ្វើឱ្យសកម្ម។ ជាលិកាជុំវិញត្រូវបានធ្វើឱ្យសកម្មជាមួយនឹងមុខងារមីតូខនឌ្រីមិនប្រក្រតី (5-7)។ ការវិភាគកុងហ្វូកាល់ដែលគាំទ្រទិន្នន័យប្រូតេអូមិកទាំងនេះបានបង្ហាញថា នៅក្នុង PN ដែលបាត់ OXPHOS ចំណិតខួរក្បាលតូចរបស់កណ្តុរអាយុ 8 សប្តាហ៍ត្រូវបានទទួលរងនូវសេរីនអ៊ីដ្រូស៊ីមេទីលត្រានហ្វែរេស 2 (SHMT2) ដែលជាអង់ស៊ីមសំខាន់នៃវដ្តហ្វូឡាតមីតូខនឌ្រី។ ការឆ្លើយតបនៃប្រព័ន្ធភាពស៊ាំគួរឱ្យកត់សម្គាល់ (រូបភាព S5D)។ នៅក្នុងចំណិតខួរក្បាលតូចស្រួចស្រាវចំនួន 13 ដែលភ្ញាស់ដោយគ្លុយកូស CU ការពិសោធន៍តាមដានមេតាប៉ូលីសបានបញ្ជាក់បន្ថែមទៀតអំពីការកើនឡើងនៃជីវសំយោគសេរីន និងប្រូលីន ដែលបង្ហាញថាលំហូរនៃអ៊ីសូហ្វមកាបូនទៅជាសេរីន និងប្រូលីនបានកើនឡើង (រូបភាព S5E)។ ដោយសារតែប្រតិកម្មដែលជំរុញដោយ GLS និង GPT2 ទទួលខុសត្រូវចំពោះការសំយោគ glutamate ពី glutamine និងការបញ្ជូន transamination រវាង glutamate និង α-ketoglutarate ការកើនឡើងនៃកម្រិតរបស់វាបង្ហាញថាណឺរ៉ូនដែលខ្វះ OXPHOS មានតម្រូវការកើនឡើងសម្រាប់ glutamate ដែលនេះអាចមានគោលបំណងរក្សាជីវសំយោគ proline កើនឡើង (រូបភាព S5C)។ ផ្ទុយពីការផ្លាស់ប្តូរទាំងនេះ ការវិភាគប្រូតេអូមិកនៃ cerebellar astrocytes ពីកណ្ដុរ Mfn2cKO ជាក់លាក់ PN បានបង្ហាញថាផ្លូវទាំងនេះ (រួមទាំង antiperoxidases ទាំងអស់) មិនមានការផ្លាស់ប្តូរគួរឱ្យកត់សម្គាល់នៅក្នុងការបញ្ចេញមតិទេ ដូច្នេះបង្ហាញថាការប្តូរទិសមេតាបូលីសនេះគឺជ្រើសរើសទៅ PN ដែលរិចរិល (រូបភាព S6, D ដល់ G)។
សរុបមក ការវិភាគទាំងនេះបានបង្ហាញពីគំរូខុសគ្នាគួរឱ្យកត់សម្គាល់នៃការធ្វើឱ្យសកម្មតាមពេលវេលានៃផ្លូវមេតាបូលីសជាក់លាក់នៅក្នុង PNs។ ទោះបីជាមុខងារមីតូខនឌ្រីណឺរ៉ូនមិនប្រក្រតីអាចនាំឱ្យមានជំងឺក្រិនសរសៃឈាមដំណាក់កាលដំបូង និងការរៀបចំឡើងវិញនូវ 1C (រូបភាពទី 3E និងរូបភាព S5C) និងសូម្បីតែការផ្លាស់ប្តូរដែលអាចព្យាករណ៍បាននៅក្នុងការបញ្ចេញមតិនៃស្មុគស្មាញ I និង IV ក៏ដោយ ការផ្លាស់ប្តូរនៅក្នុងការសំយោគ serine de novo គឺគ្រាន់តែលេចចេញជារូបរាងនៅដំណាក់កាលចុងក្រោយប៉ុណ្ណោះ។ ភាពមិនប្រក្រតីនៃ OXPHOS (រូបភាពទី 3E និងរូបភាព S5C)។ ការរកឃើញទាំងនេះកំណត់ដំណើរការជាបន្តបន្ទាប់ដែលមីតូខនឌ្រី (វដ្ត 1C) និងស៊ីតូប្លាស្មិក (ជីវសំយោគ serine) ដែលបង្កឡើងដោយភាពតានតឹងឆ្លើយតបរួមគ្នាជាមួយនឹងការកើនឡើងនៃជំងឺក្រិនសរសៃឈាមនៅក្នុងវដ្ត TCA ដើម្បីកំណត់រូបរាងមេតាបូលីសណឺរ៉ូនឡើងវិញ។
PNs អាយុ 8 សប្តាហ៍ដែលខ្វះ OXPHOS អាចរក្សាសកម្មភាពរំញោចប្រេកង់ខ្ពស់ និងឆ្លងកាត់ការតភ្ជាប់មេតាបូលីសឡើងវិញយ៉ាងសំខាន់ ដើម្បីទូទាត់សងសម្រាប់មុខងារមីតូខនឌ្រី។ ការរកឃើញនេះបង្កើនលទ្ធភាពគួរឱ្យចាប់អារម្មណ៍មួយដែលសូម្បីតែនៅពេលនេះ កោសិកាទាំងនេះក៏អាចទទួលបានអន្តរាគមន៍ព្យាបាលដើម្បីពន្យារពេល ឬការពារការខូចសរសៃប្រសាទផងដែរ។ យឺត។ យើងបានដោះស្រាយលទ្ធភាពនេះតាមរយៈអន្តរាគមន៍ឯករាជ្យពីរ។ នៅក្នុងវិធីសាស្ត្រទីមួយ យើងបានរចនាវ៉ិចទ័រមេរោគដែលទាក់ទងនឹងអាដេណូ (AAV) ដែលពឹងផ្អែកលើ Cre ដើម្បីឱ្យ MFN2 អាចត្រូវបានបង្ហាញជាជម្រើសនៅក្នុង PNs ដែលខ្វះ OXPHOS នៅក្នុងខ្លួន (រូបភាព S7A)។ AAV ដែលអ៊ិនកូដ MFN2 និងហ្សែនរាយការណ៍ fluorescent mCherry (Mfn2-AAV) ត្រូវបានផ្ទៀងផ្ទាត់នៅក្នុងការដាំដុះណឺរ៉ូនបឋមនៅក្នុងវីត្រូ ដែលបណ្តាលឱ្យ MFN2 ត្រូវបានបង្ហាញតាមរបៀបដែលពឹងផ្អែកលើ Cre និងជួយសង្គ្រោះរូបរាងមីតូខនឌ្រី ដោយហេតុនេះការពារការផ្លាស់ប្តូរណឺរ៉ូននៅក្នុងណឺរ៉ូន Mfn2cKO (រូបភាព S7, B, D និង E)។ បន្ទាប់មក យើងបានធ្វើការពិសោធន៍នៅក្នុងខ្លួន ដើម្បីបញ្ជូន Mfn2-AAV អាយុ 8 សប្តាហ៍ទៅកាន់ខួរក្បាលតូចរបស់ Mfn2cKO និងកណ្តុរត្រួតពិនិត្យដោយស្តេរ៉េអូតាក់ទិក ហើយបានវិភាគកណ្តុរអាយុ 12 សប្តាហ៍ (រូបភាពទី 4A)។ កណ្តុរ Mfn2cKO ដែលត្រូវបានព្យាបាលបានស្លាប់ (រូបភាពទី 1, A និង B) (16)។ ការបញ្ជូនមេរោគនៅក្នុងខ្លួនបានបណ្តាលឱ្យមានការបញ្ចេញមតិជ្រើសរើសនៃ PN នៅក្នុងរង្វង់ខួរក្បាលតូចមួយចំនួន (រូបភាព S7, G និង H)។ ការចាក់ AAV ត្រួតពិនិត្យដែលបង្ហាញតែ mCherry (Ctrl-AAV) មិនមានឥទ្ធិពលគួរឱ្យកត់សម្គាល់លើកម្រិតនៃការចុះខ្សោយសរសៃប្រសាទនៅក្នុងសត្វ Mfn2cKO ទេ។ ផ្ទុយទៅវិញ ការវិភាគ Mfn2cKOs ដែលបានបញ្ជូនជាមួយ Mfn2-AAV បានបង្ហាញពីឥទ្ធិពលការពារដ៏សំខាន់នៃស្រទាប់កោសិកា PN (រូបភាពទី 4, B និង C)។ ជាពិសេស ដង់ស៊ីតេណឺរ៉ូនហាក់ដូចជាស្ទើរតែមិនអាចបែងចែកបានពីសត្វត្រួតពិនិត្យ (រូបភាពទី 4, B និង C និងរូបភាព S7, H និង I)។ ការបញ្ចេញមតិរបស់ MFN1 ប៉ុន្តែមិនមែន MFN2 ទេ គឺមានប្រសិទ្ធភាពស្មើគ្នាក្នុងការជួយសង្គ្រោះការស្លាប់របស់ណឺរ៉ូន (រូបភាពទី 4C និងរូបភាព S7, C និង F) ដែលបង្ហាញថាការបញ្ចេញមតិរបស់ MFN1 ដែលមិនមែនជាលក្ខណៈធម្មជាតិអាចបំពេញបន្ថែមការខ្វះខាត MFN2 បានយ៉ាងមានប្រសិទ្ធភាព។ ការវិភាគបន្ថែមនៅកម្រិត PN តែមួយបានបង្ហាញថា Mfn2-AAV ភាគច្រើនបានជួយសង្គ្រោះរចនាសម្ព័ន្ធអ៊ុលត្រាសោននៃមីតូខនឌ្រី កម្រិត mtDNA ធម្មតា និងបញ្ច្រាសការបញ្ចេញមតិខ្ពស់នៃសញ្ញាសម្គាល់ប្រឆាំង angiogenesis PCx ​​(រូបភាពទី 4, C ដល់ E)។ ការត្រួតពិនិត្យដោយមើលឃើញនៃកណ្ដុរ Mfn2cKO ដែលត្រូវបានជួយសង្គ្រោះក្នុងស្ថានភាពសម្រាកបានបង្ហាញថាឥរិយាបថ និងរោគសញ្ញាម៉ូទ័ររបស់ពួកវា (ចលនា S1 ដល់ S3) ត្រូវបានធ្វើឱ្យប្រសើរឡើង។ សរុបមក ការពិសោធន៍ទាំងនេះបង្ហាញថាការណែនាំឡើងវិញយឺតនៃ MFN2 ទៅក្នុង PNs ដែលខ្វះខាតយ៉ាងខ្លាំងនៅក្នុង OXPHOS គឺគ្រប់គ្រាន់ដើម្បីបញ្ច្រាសការប្រើប្រាស់ mtDNA និងបង្កឱ្យមានជំងឺសរសៃឈាមរឹង ដោយហេតុនេះការពារការចុះខ្សោយអ័ក្ស និងការស្លាប់របស់ណឺរ៉ូននៅក្នុងខ្លួន។
(ក) គ្រោងការណ៍ដែលបង្ហាញពីកាលវិភាគពិសោធន៍សម្រាប់ចាក់ AAV ដែលអ៊ិនកូដ MFN2 នៅពេលដែលផ្លូវមេតាបូលីសដែលបានចង្អុលបង្ហាញត្រូវបានធ្វើឱ្យសកម្ម។ (ខ) រូបភាពកុងហ្វូកាល់តំណាងនៃចំណិតខួរក្បាលតូចអាយុ 12 សប្តាហ៍ដែលត្រូវបានបញ្ជូននៅសប្តាហ៍ទី 8 នៅក្នុងសត្វកណ្តុរ Mfn2cKO និងដាក់ស្លាកដោយអង្គបដិប្រាណប្រឆាំងនឹង Calbindin។ ស្តាំ៖ ការធ្វើមាត្រដ្ឋាននៃសរសៃអ័ក្ស។ មាត្រដ្ឋាននៃការពង្រីកអ័ក្សគឺ 450 និង 75 μm។ (គ) ឆ្វេង៖ ការវាស់បរិមាណដង់ស៊ីតេកោសិកា Purkinje នៅក្នុងរង្វិលជុំបញ្ជូន AAV (AAV+) (ការវិភាគតែមួយផ្លូវនៃភាពខុសគ្នា; n = 3 សត្វកណ្តុរ)។ ស្តាំ៖ ការវិភាគការផ្តោតអារម្មណ៍ mtDNA នៅក្នុង PN ដែលបានបញ្ជូននៅសប្តាហ៍ទី 12 (ការធ្វើតេស្ត t ដែលមិនបានផ្គូផ្គង; n = 6 កោសិកាពីសត្វកណ្តុរបី)។ * P <0.05; ** P <0.01។ (ឃ) មីក្រូទស្សន៍អេឡិចត្រុងបញ្ជូនតំណាងនៃ PNs នៃផ្នែកខួរក្បាលតូច Mfn2cKO ដែលបានបញ្ជូនជាមួយវ៉ិចទ័រមេរោគដែលបានចង្អុលបង្ហាញ។ របាំងពណ៌ផ្កាឈូកបង្ហាញពីតំបន់ដែលកាន់កាប់ដោយដង់ឌ្រីត ហើយការ៉េចំណុចពណ៌លឿងបង្ហាញពីការពង្រីកដែលបានផ្តល់នៅខាងស្តាំ; n តំណាងឱ្យស្នូល។ របារមាត្រដ្ឋាន 1μm។ (E) បង្ហាញឧទាហរណ៍នៃការជ្រលក់ពណ៌ PCx នៅក្នុង PN ដែលបានបញ្ជូននៅ 12 សប្តាហ៍។ របារមាត្រដ្ឋាន 20μm។ OE, ការបញ្ចេញមតិលើសកម្រិត; FC, ការផ្លាស់ប្តូរផ្នត់។
ជាចុងក្រោយ យើងបានស៊ើបអង្កេតពីសារៈសំខាន់នៃការរស់រានមានជីវិតរបស់កោសិកាដែលបង្កឡើងដោយ peroxidase នៅក្នុង PNs ដែលមានបញ្ហា OXPHOS ។ យើងបានបង្កើត mCherry encoding AAV-shRNA (RNA ខ្លី hairpin) ដែលកំណត់គោលដៅជាពិសេសលើ mRNA PCx របស់កណ្ដុរ (AAV-shPCx) ហើយបានចាក់មេរោគ ឬមេរោគដែលច្របល់ចូលគ្នារបស់វា (AAV-scr) ចូលទៅក្នុង cerebellum របស់កណ្ដុរ Mfn2cKO ។ ការចាក់នេះត្រូវបានអនុវត្តនៅសប្តាហ៍ទីបួននៃអាយុ (រូបភាពទី 5A) ដើម្បីសម្រេចបាននូវការគោះ PCx ប្រកបដោយប្រសិទ្ធភាពក្នុងអំឡុងពេលដែលការបញ្ចេញមតិ PCx កើនឡើង (រូបភាពទី 3C) ហើយស្រទាប់កោសិកា PN នៅតែដដែល (រូបភាពទី 1A) ។ គួរកត់សម្គាល់ថាការគោះ PCx (រូបភាព S8A) នាំឱ្យមានការបង្កើនល្បឿនគួរឱ្យកត់សម្គាល់នៃការស្លាប់របស់ PN ដែលត្រូវបានកំណត់ចំពោះចិញ្ចៀនដែលឆ្លងមេរោគ (រូបភាពទី 5, B និង C) ។ ដើម្បីយល់ពីយន្តការនៃឥទ្ធិពលមេតាបូលីសដែលបង្កឡើងដោយការកើនឡើងនៃ PCx យើងបានសិក្សាពីស្ថានភាព redox នៃ PNs បន្ទាប់ពីការ knockdown PCx និង biosensor អុបទិកដែលសម្របសម្រួលដោយ AAV Grx1-roGFP2 ត្រូវបានបង្ហាញក្នុងពេលដំណាលគ្នា (រូបភាព S8, B ដល់ D) ដើម្បីវាយតម្លៃ glutathione ការផ្លាស់ប្តូរដែលទាក់ទងនៃសក្តានុពល redox peptide (38)។ បន្ទាប់មក យើងបានអនុវត្តមីក្រូទស្សន៍រូបភាពពេញមួយជីវិត fluorescence ពីរហ្វូតុង (FLIM) នៅក្នុងចំណិតខួរក្បាលស្រួចស្រាវនៃ Mfn2cKO អាយុ 7 សប្តាហ៍ ឬកូនក្នុងពូជត្រួតពិនិត្យ ដើម្បីរកឃើញការផ្លាស់ប្តូរដែលអាចកើតមាននៅក្នុងស្ថានភាព redox cytoplasmic បន្ទាប់ពីផ្ទៀងផ្ទាត់លក្ខខណ្ឌ FLIM (រូបភាព S8, E ដល់ G)។ ការវិភាគបានបង្ហាញពីការកើនឡើងគួរឱ្យកត់សម្គាល់នៃស្ថានភាពអុកស៊ីតកម្មនៃ Mfn2cKO PNs តែមួយដែលខ្វះការបញ្ចេញមតិ PCx ដែលខុសពីណឺរ៉ូនត្រួតពិនិត្យ ឬ Mfn2cKO PNs ដែលបង្ហាញតែ shRNA ដែលច្របល់ (រូបភាព 5, D និង E)។ នៅពេលដែលការបញ្ចេញមតិ PCx ត្រូវបានកំណត់កម្រិតទាប ភាគរយនៃ Mfn2cKO PNs ដែលបង្ហាញពីស្ថានភាពអុកស៊ីតកម្មខ្ពស់បានកើនឡើងច្រើនជាងបីដង (រូបភាពទី 5E) ដែលបង្ហាញថាការកើនឡើងនៃ PCx រក្សាសមត្ថភាព redox នៃណឺរ៉ូនដែលខូច។
(ក) គ្រោងការណ៍ដែលបង្ហាញពីកាលវិភាគពិសោធន៍សម្រាប់ចាក់ AAV ដែលអ៊ិនកូដ shPCx នៅពេលដែលផ្លូវមេតាបូលីសដែលបានចង្អុលបង្ហាញត្រូវបានធ្វើឱ្យសកម្ម។ (ខ) រូបថតកុងហ្វូកាល់តំណាងនៃផ្នែកខួរក្បាលតូចអាយុ 8 សប្តាហ៍នៅក្នុងសត្វកណ្ដុរ Mfn2cKO ដែលត្រូវបានបញ្ចូល និងដាក់ស្លាកជាមួយអង្គបដិប្រាណប្រឆាំងកាល់ស៊ីនូរិននៅអាយុ 4 សប្តាហ៍។ របារមាត្រដ្ឋាន 450μm។ (គ) ការវាស់បរិមាណដង់ស៊ីតេកោសិកា Purkinje នៅក្នុងរង្វិលជុំដែលបានបញ្ចូល AAV (ការវិភាគតែមួយផ្លូវនៃភាពខុសគ្នា; n = 3 ទៅ 4 សត្វកណ្ដុរ)។ ទិន្នន័យត្រូវបានបង្ហាញជាមធ្យម ± SEM; ***P<0.001។ (ឃ) រូបភាព FLIM តំណាងបង្ហាញពីអាយុកាលជាមធ្យមរបស់ឧបករណ៍ចាប់សញ្ញា glutathione redox Grx1-roGFP2 អាយុ 7 សប្តាហ៍ដែលបង្ហាញ PN ក្រោមលក្ខខណ្ឌពិសោធន៍ដែលបានបញ្ជាក់។ សមាមាត្រ LUT (តារាងរកមើល)៖ ចន្លោះពេលរស់រានមានជីវិត (ជា picoseconds)។ របារមាត្រដ្ឋាន 25μm។ (E) អ៊ីស្តូក្រាមបង្ហាញពីការចែកចាយតម្លៃអាយុកាល Grx1-roGFP2 ពី (D) (n=158 ដល់ 368 កោសិកានៅក្នុងកណ្ដុរពីរក្រោមលក្ខខណ្ឌនីមួយៗ)។ តារាងចំណិតខាងលើអ៊ីស្តូក្រាមនីមួយៗ៖ បង្ហាញពីចំនួនកោសិកាដែលមានតម្លៃអាយុកាលវែងជាង (ក្រហម អុកស៊ីតកម្ម) ឬខ្លីជាង (ខៀវ កាត់បន្ថយ) ដែលលើសពី 1 SD នៃតម្លៃអាយុកាលជាមធ្យមនៅក្នុង CTRL-AAV-scr។ (F) គំរូដែលបានស្នើឡើងបង្ហាញពីប្រសិទ្ធភាពការពារនៃការកើនឡើងនៃ PCx ណឺរ៉ូន។
សរុបមក ទិន្នន័យដែលយើងផ្តល់ជូននៅទីនេះបង្ហាញថា ការបញ្ចេញមតិឡើងវិញនៃ MFN2 អាចជួយសង្គ្រោះ PN កម្រិតខ្ពស់បានទាំងស្រុងជាមួយនឹងកង្វះ OXPHOS ធ្ងន់ធ្ងរ ការថយចុះ mtDNA ធ្ងន់ធ្ងរ និងរូបរាងដូច ista មិនប្រក្រតីខ្លាំង ដោយហេតុនេះផ្តល់នូវវឌ្ឍនភាពជាបន្តបន្ទាប់សូម្បីតែនៅក្នុងជំងឺកម្រិតខ្ពស់ក៏ដោយ។ ការរលួយសរសៃប្រសាទផ្តល់នូវភស្តុតាងដែលអាចបញ្ច្រាស់បាននៃដំណាក់កាលមុនពេលកោសិកាស្លាប់។ កម្រិតនៃភាពបត់បែនមេតាប៉ូលីសនេះត្រូវបានសង្កត់ធ្ងន់បន្ថែមទៀតដោយសមត្ថភាពរបស់ណឺរ៉ូនក្នុងការបង្កឱ្យមានជំងឺក្រិនសរសៃឈាម (ការតភ្ជាប់ឡើងវិញនៃវដ្ត TCA) ដែលរារាំងការបញ្ចេញមតិ PCx នៅក្នុង PN ដែលខ្វះ OXPHOS និងបង្កើនការស្លាប់កោសិកា ដោយហេតុនេះដើរតួនាទីការពារ (រូបភាពទី 5F)។
នៅក្នុងការសិក្សានេះ យើងបានផ្តល់ភស្តុតាងថា ការឆ្លើយតបរបស់ PNs ទៅនឹងមុខងារមិនប្រក្រតីរបស់ OXPHOS គឺការបញ្ចូលគ្នាបន្តិចម្តងៗទៅនឹងជំងឺក្រិនសរសៃឈាមក្នុងវដ្ត TCA តាមរយៈផ្លូវធ្វើឱ្យសកម្មឌីផេរ៉ង់ស្យែលដែលត្រូវបានធ្វើឱ្យសកម្មដោយកម្មវិធីមេតាបូលីស។ យើងបានបញ្ជាក់ពីការវិភាគប្រូតេអូមិចជាមួយនឹងវិធីសាស្ត្របំពេញបន្ថែមជាច្រើន ហើយបានបង្ហាញថា នៅពេលដែលត្រូវបានជំទាស់ដោយមុខងារមិនប្រក្រតីរបស់មីតូខនឌ្រីធ្ងន់ធ្ងរ ណឺរ៉ូនមានទម្រង់នៃការបត់បែនមេតាបូលីសដែលមិនធ្លាប់ស្គាល់ពីមុនមក។ យើងពិតជាភ្ញាក់ផ្អើលណាស់ ដំណើរការតភ្ជាប់ឡើងវិញទាំងមូលមិនចាំបាច់សម្គាល់ស្ថានភាពមេតាបូលីសចុងក្រោយដែលអមដោយការខូចសរសៃប្រសាទបន្តិចម្តងៗ និងមិនអាចត្រឡប់វិញបាននោះទេ ប៉ុន្តែទិន្នន័យរបស់យើងបង្ហាញថា វាអាចបង្កើតជាណឺរ៉ូនថែទាំ សូម្បីតែនៅក្នុងដំណាក់កាលមុនពេលកោសិកាស្លាប់ក៏ដោយ។ យន្តការផ្តល់សំណងមុខងារ។ ការរកឃើញនេះបង្ហាញថា ណឺរ៉ូនមានកម្រិតប្លាស្ទិកមេតាបូលីសគួរឱ្យកត់សម្គាល់នៅក្នុងរាងកាយ។ ការពិតនេះបង្ហាញថា ការណែនាំឡើងវិញនៅពេលក្រោយនៃ MFN2 អាចបញ្ច្រាសការបញ្ចេញមតិនៃសញ្ញាសម្គាល់មេតាបូលីសសំខាន់ៗ និងការពារការខូច PN។ ផ្ទុយទៅវិញ វារារាំងជំងឺក្រិនសរសៃឈាម និងបង្កើនល្បឿនសរសៃប្រសាទ។ អ្នកប្តូរភេទ។
ការរកឃើញដ៏គួរឱ្យចាប់អារម្មណ៍បំផុតមួយនៅក្នុងការស្រាវជ្រាវរបស់យើងគឺថា PNs ដែលខ្វះ OXPHOS អាចកែប្រែការរំលាយអាហារវដ្ត TCA ដោយបង្កើនអង់ស៊ីមដែលជំរុញជាពិសេសដល់ជំងឺក្រិនសរសៃឈាម។ ការរៀបចំឡើងវិញនូវមេតាបូលីសគឺជាលក្ខណៈទូទៅនៃកោសិកាមហារីក ដែលខ្លះពឹងផ្អែកលើ glutamine ដើម្បីបំពេញបន្ថែមកម្រិតមធ្យមវដ្ត TCA ដើម្បីផលិតសារធាតុកាត់បន្ថយសមមូល ដែលជំរុញខ្សែសង្វាក់ផ្លូវដង្ហើម និងរក្សាការផលិតសារធាតុជីវសំយោគ lipid និង nucleotide (39, 40)។ ការសិក្សាថ្មីៗនេះបានបង្ហាញថា នៅក្នុងជាលិកាគ្រឿងកុំព្យូទ័រដែលជួបប្រទះនឹងមុខងារមិនប្រក្រតីរបស់ OXPHOS ការតភ្ជាប់ឡើងវិញនៃការរំលាយអាហារ glutamine/glutamate ក៏ជាលក្ខណៈលេចធ្លោផងដែរ (5, 41) ដែលទិសដៅនៃការចូលទៅក្នុងវដ្ត TCA អាស្រ័យលើភាពធ្ងន់ធ្ងរនៃរបួស OXPHOS (41)។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ មានការខ្វះខាតភស្តុតាងច្បាស់លាស់លើភាពស្រដៀងគ្នានៃភាពប្លាស្ទិកមេតាបូលីសនៃណឺរ៉ូននៅក្នុងរាងកាយ និងភាពពាក់ព័ន្ធដែលអាចកើតមានរបស់វានៅក្នុងបរិបទនៃជំងឺ។ នៅក្នុងការសិក្សាក្នុងវីត្រូថ្មីៗនេះ ណឺរ៉ូន cortical បឋមត្រូវបានបង្ហាញថាបានប្រមូលផ្តុំអាង glutamate សម្រាប់ការបញ្ជូនសរសៃប្រសាទ ដោយហេតុនេះជំរុញការរំលាយអាហារអុកស៊ីតកម្ម និងជំងឺក្រិនសរសៃឈាមក្រោមលក្ខខណ្ឌស្ត្រេសមេតាបូលីស (42)។ គួរកត់សម្គាល់ថា ក្រោមការរារាំងឱសថសាស្ត្រនៃអង់ស៊ីមវដ្ត TCA succinate dehydrogenase អង់ស៊ីម pyruvate carboxylation ត្រូវបានគេជឿថារក្សាការសំយោគ oxaloacetate នៅក្នុងណឺរ៉ូន granule cerebellar ដែលបានដាំដុះ (34)។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ ភាពពាក់ព័ន្ធខាងសរីរវិទ្យានៃយន្តការទាំងនេះទៅនឹងជាលិកាខួរក្បាល (ដែលជំងឺ atherosclerosis ត្រូវបានគេជឿថាភាគច្រើនត្រូវបានកំណត់ចំពោះ astrocytes) នៅតែមានសារៈសំខាន់ខាងសរីរវិទ្យាដ៏សំខាន់ (43)។ ក្នុងករណីនេះ ទិន្នន័យរបស់យើងបង្ហាញថា PNs ដែលខូចខាតដោយ OXPHOS នៅក្នុងខ្លួនអាចត្រូវបានប្តូរទៅជាការរិចរិល BCAA និង pyruvate carboxylation ដែលជាប្រភពសំខាន់ពីរនៃការបំពេញបន្ថែមនៃអន្តរការីអាង TCA។ ទោះបីជាការរួមចំណែកដែលសន្មត់នៃ catabolism BCAA ទៅនឹងការរំលាយអាហារថាមពលណឺរ៉ូនត្រូវបានស្នើឡើងក៏ដោយ បន្ថែមពីលើតួនាទីរបស់ glutamate និង GABA សម្រាប់ការបញ្ជូនសរសៃប្រសាទ (44) នៅតែមិនមានភស្តុតាងសម្រាប់យន្តការទាំងនេះនៅក្នុង vivo ទេ។ ដូច្នេះវាងាយស្រួលក្នុងការស្មានថា PNs ដែលមិនដំណើរការអាចទូទាត់សងដោយស្វ័យប្រវត្តិសម្រាប់ការប្រើប្រាស់អន្តរការី TCA ដែលជំរុញដោយដំណើរការ assimilation ដោយបង្កើនជំងឺ atherosclerosis។ ជាពិសេស ការកើនឡើងនៃ PCx អាចត្រូវបានទាមទារដើម្បីរក្សាតម្រូវការកើនឡើងសម្រាប់អាស៊ីតអាស្ប៉ាទិច ដែលត្រូវបានស្នើឡើងនៅក្នុងកោសិកាដែលរីកសាយភាយជាមួយនឹងមុខងារមីតូខនឌ្រី (45)។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ ការវិភាគមេតាបូឡូមិករបស់យើងមិនបានបង្ហាញពីការផ្លាស់ប្តូរគួរឱ្យកត់សម្គាល់ណាមួយនៅក្នុងកម្រិតស្ថានភាពស្ថិរភាពនៃអាស៊ីតអាស្ប៉ាទិចនៅក្នុង Mfn2cKO PNs (រូបភាព S6A) ដែលសន្មតថាឆ្លុះបញ្ចាំងពីការប្រើប្រាស់មេតាបូលីសផ្សេងៗគ្នានៃអាស៊ីតអាស្ប៉ាទិចរវាងកោសិកាដែលរីកសាយភាយ និងណឺរ៉ូនក្រោយមីតូក។ ទោះបីជាយន្តការពិតប្រាកដនៃការកើនឡើងនៃ PCx នៅក្នុងណឺរ៉ូនដែលមិនដំណើរការនៅក្នុង vivo នៅតែត្រូវបានកំណត់លក្ខណៈក៏ដោយ យើងបានបង្ហាញថាការឆ្លើយតបមុនអាយុនេះដើរតួនាទីយ៉ាងសំខាន់ក្នុងការរក្សាស្ថានភាព redox នៃណឺរ៉ូន ដែលត្រូវបានបង្ហាញនៅក្នុងការពិសោធន៍ FLIM លើចំណិត cerebellar ។ ជាពិសេស ការការពារ PNs ពីការកើនឡើងនៃ PCx អាចនាំឱ្យមានស្ថានភាពអុកស៊ីតកម្មកាន់តែច្រើន និងបង្កើនល្បឿនការស្លាប់កោសិកា។ ការធ្វើឱ្យសកម្មនៃការរិចរិល BCAA និង carboxylation នៃ pyruvate មិនមែនជាវិធីដើម្បីកំណត់លក្ខណៈជាលិកាគ្រឿងកុំព្យូទ័រនៃមុខងារមីតូខនឌ្រី (7) នោះទេ។ ដូច្នេះ ពួកវាហាក់ដូចជាលក្ខណៈពិសេសអាទិភាពនៃណឺរ៉ូនដែលខ្វះ OXPHOS ទោះបីជាមិនមែនជាលក្ខណៈពិសេសតែមួយគត់ដែលសំខាន់សម្រាប់ការរលួយសរសៃប្រសាទក៏ដោយ។
ជំងឺខួរក្បាលតូច (Cerebellar disease) គឺជាប្រភេទជំងឺសរសៃប្រសាទដែលមានភាពខុសប្លែកគ្នា ដែលជាធម្មតាបង្ហាញឱ្យឃើញជាជំងឺ ataxia ហើយជារឿយៗបំផ្លាញ PNs (46)។ ចំនួនប្រជាជនណឺរ៉ូននេះងាយរងគ្រោះជាពិសេសចំពោះមុខងារមីតូខនឌ្រី ពីព្រោះការចុះខ្សោយជ្រើសរើសរបស់ពួកវានៅក្នុងសត្វកណ្ដុរគឺគ្រប់គ្រាន់ដើម្បីបង្កើតឡើងវិញនូវរោគសញ្ញាម៉ូទ័រជាច្រើនដែលកំណត់លក្ខណៈនៃជំងឺ spinocerebellar ataxia របស់មនុស្ស (16, 47, 48)។ យោងតាមរបាយការណ៍ គំរូកណ្ដុរ transgenic ដែលមានហ្សែន mutant ត្រូវបានផ្សារភ្ជាប់ជាមួយនឹងជំងឺ spinocerebellar ataxia របស់មនុស្ស ហើយមានមុខងារមីតូខនឌ្រី (49, 50) ដោយសង្កត់ធ្ងន់លើសារៈសំខាន់នៃការសិក្សាពីផលវិបាកនៃកង្វះ OXPHOS នៅក្នុង PNPH។ ដូច្នេះ វាសមស្របជាពិសេសក្នុងការញែក និងសិក្សាពីចំនួនប្រជាជនណឺរ៉ូនតែមួយគត់នេះប្រកបដោយប្រសិទ្ធភាព។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ ដោយសារ PNs មានភាពរសើបខ្លាំងចំពោះសម្ពាធ និងមានចំនួនតិចតួចនៃចំនួនប្រជាជនកោសិកាខួរក្បាលតូចទាំងមូល សម្រាប់ការសិក្សាជាច្រើនដែលមានមូលដ្ឋានលើ omics ការបំបែកជ្រើសរើសនៃពួកវាជាកោសិកាទាំងមូលនៅតែជាទិដ្ឋភាពដ៏លំបាកមួយ។ ទោះបីជាវាស្ទើរតែមិនអាចទៅរួចទេក្នុងការសម្រេចបាននូវការខ្វះការចម្លងរោគដាច់ខាតនៃប្រភេទកោសិកាផ្សេងទៀត (ជាពិសេសជាលិកាមនុស្សពេញវ័យ) យើងបានផ្សំជំហានបំបែកដ៏មានប្រសិទ្ធភាពជាមួយ FACS ដើម្បីទទួលបានចំនួនណឺរ៉ូនដែលអាចរស់បានគ្រប់គ្រាន់សម្រាប់ការវិភាគប្រូតេអូមិចខាងក្រោម ហើយមានការគ្របដណ្តប់ប្រូតេអ៊ីនខ្ពស់ណាស់ (ប្រូតេអ៊ីនប្រហែល 3000) បើប្រៀបធៀបទៅនឹងសំណុំទិន្នន័យដែលមានស្រាប់នៃ cerebellum ទាំងមូល (51)។ ដោយរក្សាភាពរស់រវើកនៃកោសិកាទាំងមូល វិធីសាស្ត្រដែលយើងផ្តល់ជូននៅទីនេះអនុញ្ញាតឱ្យយើងមិនត្រឹមតែពិនិត្យមើលការផ្លាស់ប្តូរនៅក្នុងផ្លូវមេតាប៉ូលីសនៅក្នុងមីតូខនឌ្រីប៉ុណ្ណោះទេ ប៉ុន្តែថែមទាំងពិនិត្យមើលការផ្លាស់ប្តូរនៅក្នុងសមភាគីស៊ីតូប្លាស្មិករបស់វា ដែលបំពេញបន្ថែមការប្រើប្រាស់ស្លាកភ្នាសមីតូខនឌ្រីដើម្បីបង្កើនប្រភេទកោសិកា។ វិធីសាស្ត្រថ្មីសម្រាប់ចំនួនមីតូខនឌ្រីនៅក្នុងជាលិកាស្មុគស្មាញ (52, 53)។ វិធីសាស្ត្រដែលយើងពិពណ៌នាមិនត្រឹមតែទាក់ទងនឹងការសិក្សាអំពីកោសិកា Purkinje ប៉ុណ្ណោះទេ ប៉ុន្តែអាចត្រូវបានអនុវត្តយ៉ាងងាយស្រួលចំពោះកោសិកាគ្រប់ប្រភេទដើម្បីដោះស្រាយការផ្លាស់ប្តូរមេតាប៉ូលីសនៅក្នុងខួរក្បាលដែលមានជំងឺ រួមទាំងគំរូផ្សេងទៀតនៃភាពមិនដំណើរការរបស់មីតូខនឌ្រី។
ជាចុងក្រោយ យើងបានកំណត់អត្តសញ្ញាណបង្អួចព្យាបាលមួយក្នុងអំឡុងពេលដំណើរការរៀបចំមេតាបូលីសឡើងវិញនេះ ដែលអាចបញ្ច្រាស់សញ្ញាសំខាន់ៗនៃភាពតានតឹងកោសិកាទាំងស្រុង និងការពារការចុះខ្សោយនៃណឺរ៉ូន។ ដូច្នេះ ការយល់ដឹងអំពីផលប៉ះពាល់មុខងារនៃការតភ្ជាប់ឡើងវិញដែលបានពិពណ៌នានៅទីនេះអាចផ្តល់នូវការយល់ដឹងជាមូលដ្ឋានអំពីការព្យាបាលដែលអាចធ្វើទៅបានសម្រាប់រក្សាភាពរស់រានមានជីវិតនៃណឺរ៉ូនក្នុងអំឡុងពេលមានបញ្ហាមុខងារមីតូខនឌ្រី។ ការស្រាវជ្រាវនាពេលអនាគតដែលមានគោលបំណងវិភាគការផ្លាស់ប្តូរនៃការរំលាយអាហារថាមពលនៅក្នុងប្រភេទកោសិកាខួរក្បាលផ្សេងទៀតគឺត្រូវការជាចាំបាច់ដើម្បីបង្ហាញយ៉ាងពេញលេញអំពីការអនុវត្តគោលការណ៍នេះចំពោះជំងឺសរសៃប្រសាទផ្សេងទៀត។
កណ្ដុរ MitoPark ត្រូវបានពិពណ៌នាពីមុន (31)។ កណ្ដុរ C57BL/6N ដែលមានហ្សែន loxP អមដោយហ្សែន Mfn2 ត្រូវបានពិពណ៌នាពីមុន (18) ហើយបានបង្កាត់ពូជជាមួយកណ្ដុរ L7-Cre (23)។ កូនចៅ heterozygous ទ្វេរដងដែលទទួលបានត្រូវបានបង្កាត់ពូជជាមួយកណ្ដុរ homozygous Mfn2loxP/Mfn2loxP ដើម្បីបង្កើតការគាំងហ្សែនជាក់លាក់ Purkinje សម្រាប់ Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre)។ នៅក្នុងសំណុំរងនៃការរួមរ័ក អាឡែល Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP (stop-mtYFP) ត្រូវបានណែនាំតាមរយៈការបង្កាត់ពូជបន្ថែម (20)។ នីតិវិធីសត្វទាំងអស់ត្រូវបានអនុវត្តស្របតាមគោលការណ៍ណែនាំរបស់អឺរ៉ុប ជាតិ និងស្ថាប័ន និងត្រូវបានអនុម័តដោយ LandesamtfürNatur នៃ Umwelt និង Verbraucherschutz, North Rhine-Westphalia ប្រទេសអាល្លឺម៉ង់។ ការងារសត្វក៏អនុវត្តតាមការណែនាំរបស់សហព័ន្ធអឺរ៉ុបនៃសមាគមវិទ្យាសាស្ត្រសត្វមន្ទីរពិសោធន៍ផងដែរ។
បន្ទាប់ពីបានចាក់ថ្នាំសណ្តំដល់ការផ្លាស់ទីលំនៅមាត់ស្បូនរបស់ស្ត្រីមានផ្ទៃពោះ អំប្រ៊ីយ៉ុងកណ្ដុរត្រូវបានញែកចេញ (E13)។ ស្រទាប់ខាងក្រៅត្រូវបានវះកាត់នៅក្នុងដំណោះស្រាយអំបិលមានតុល្យភាព Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) ដែលបានបន្ថែមជាមួយ 10 mM Hepes ហើយបានបញ្ជូន Dulbecco's Modified Eagle's Medium ដែលមាន papain (20 U/ml) និង cysteine ​​(1μg/ml)។ ភ្ញាស់ជាលិកានៅក្នុង DMEM) ហើយបំបែកវាដោយការរំលាយអង់ស៊ីម (មីលីលីត្រ) នៅសីតុណ្ហភាព 37°C រយៈពេល 20 នាទី ហើយបន្ទាប់មកកិនដោយមេកានិចនៅក្នុង DMEM ដែលបានបន្ថែមជាមួយសេរ៉ូមគោគភ៌ 10%។ កោសិកាត្រូវបានសាបព្រោះលើគម្របកញ្ចក់ដែលស្រោបដោយ polylysine ក្នុងដង់ស៊ីតេ 2×106 ក្នុងមួយចានវប្បធម៌ 6 សង់ទីម៉ែត្រ ឬក្នុងដង់ស៊ីតេ 0.5×105 កោសិកា/សង់ទីម៉ែត្រសម្រាប់ការវិភាគរូបភាព។ បន្ទាប់ពី 4 ម៉ោង មធ្យមត្រូវបានជំនួសដោយមធ្យមគ្មានសេរ៉ូម Neurobasal ដែលមានអាហារបំប៉ន B27 1% និង GlutaMax 0.5 mM។ បន្ទាប់មក ណឺរ៉ូនត្រូវបានរក្សានៅសីតុណ្ហភាព 37°C និង CO2 5% ពេញមួយការពិសោធន៍ ហើយត្រូវបានផ្តល់ចំណីម្តងក្នុងមួយសប្តាហ៍។ ដើម្បីបង្កើតការរួមបញ្ចូលគ្នាឡើងវិញនៅក្នុងវីត្រូ វ៉ិចទ័រមេរោគ AAV9 ដូចខាងក្រោមចំនួន 3μl (ចានវប្បធម៌ 24 រន្ធ) ឬ 0.5μl (ចាន 24 រន្ធ) ត្រូវបានប្រើដើម្បីព្យាបាលណឺរ៉ូននៅថ្ងៃទីពីរនៅក្នុងវីត្រូ៖ AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene លេខកាតាឡុក 105530-AAV9) និង AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene លេខកាតាឡុក 105545-AAV9)។
ឌីអិនអេបំពេញបន្ថែម Mfn1 និង Mfn2 កណ្ដុរ (ទទួលបានពីប្លាស្មីត Addgene #23212 និង #23213 រៀងគ្នា) ត្រូវបានសម្គាល់ដោយលំដាប់ V5 (GKPIPNPLLGLDST) នៅចុង C-terminus ហើយត្រូវបានផ្សំជាមួយ mCherry ក្នុងស៊ុមតាមរយៈលំដាប់ T2A។ Grx1-roGFP2 គឺជាអំណោយមួយពី Heidelberg TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum)។ ដោយការជំនួសកាសែត tdTomato ដោយប្រើវិធីសាស្ត្រក្លូនធម្មតា កាសែតនេះត្រូវបានក្លូនរងទៅក្នុងឆ្អឹងខ្នង pAAV-CAG-FLEX-tdTomato (លេខយោង Addgene 28306) ដើម្បីបង្កើតវ៉ិចទ័រ pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 និង pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2។ យុទ្ធសាស្ត្រស្រដៀងគ្នានេះត្រូវបានប្រើដើម្បីបង្កើតវ៉ិចទ័រត្រួតពិនិត្យ pAAV-CAG-FLEX-mCherry។ ដើម្បីបង្កើតរចនាសម្ព័ន្ធ AAV-shPCx វ៉ិចទ័រ AAV ប្លាស្មីត (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]) ត្រូវបានទាមទារ ដែលមានលំដាប់ DNA ដែលអ៊ិនកូដកណ្តុរ PCx ដែលកំណត់គោលដៅ shRNA (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′)។ ក្រោមការគ្រប់គ្រងរបស់ប្រូម៉ូទ័រ U6, mCherry ត្រូវបានប្រើក្រោមការគ្រប់គ្រងរបស់ប្រូម៉ូទ័រ CMV។ ការផលិតវ៉ិចទ័រ AAV ជំនួយត្រូវបានអនុវត្តតាមការណែនាំរបស់អ្នកផលិត (Cell Biolabs)។ សរុបមក សូមប្រើប្លាស្មីតផ្ទេរដែលផ្ទុក mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) ជាបណ្ដោះអាសន្ន ការបញ្ចូលហ្សែនកូដកោសិកា AAV ចំនួន 293-T2A-MFN1-V5), mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) ឬ Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) ក៏ដូចជាការអ៊ិនកូដប្រូតេអ៊ីន capsid AAV1 និងប្លាស្មីតវេចខ្ចប់ប្រូតេអ៊ីនបន្ថែម ដោយប្រើវិធីសាស្ត្រកាល់ស្យូមផូស្វាត។ សារធាតុរាវវីរុសឆៅត្រូវបានទទួលដោយវដ្តកក-រលាយក្នុងអាងងូតទឹកទឹកកកស្ងួត/អេតាណុល និងកោសិកាដែលរលាយក្នុងទឹកអំបិលផូស្វាត (PBS)។ វ៉ិចទ័រ AAV ត្រូវបានបន្សុទ្ធដោយការបង្វិលបញ្ច្រាសទិស iodixanol gradient ultracentrifugation ដែលមិនបន្ត (24 ម៉ោងក្នុងល្បឿន 32,000 rpm និង 4°C) ហើយត្រូវបានប្រមូលផ្តុំដោយប្រើតម្រង centrifugal Amicon ultra-15។ កម្រិតហ្សែននៃ AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9×1013 ច្បាប់ចម្លងហ្សែន (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX គឺដូចដែលបានពិពណ៌នាពីមុន (54) ដែលវាស់ដោយ PCR បរិមាណពេលវេលាជាក់ស្តែង (qPCR) -MFN1-V5 (1.9×1013 GC/ml) និង AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8.9×1012 GC/ml)។
ណឺរ៉ូនបឋមត្រូវបានកោសចេញក្នុងសារធាតុ PBS 1x ត្រជាក់ កិនជាដុំៗ ហើយបន្ទាប់មកធ្វើឱ្យដូចគ្នានៅក្នុងសារធាតុ Triton X-100 0.5% / សូដ្យូម deoxycholate/PBS lysis buffer 0.5% ដែលមានផ្ទុក phosphatase និង protease inhibitor (Roche)។ ការវាស់បរិមាណប្រូតេអ៊ីនត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើការវិភាគអាស៊ីត bicinchoninic (Thermo Fisher Scientific)។ បន្ទាប់មកប្រូតេអ៊ីនត្រូវបានបំបែកដោយអេឡិចត្រូផូរីស៊ីសជែល SDS-polyacrylamide ហើយបន្ទាប់មកត្រូវបាន blot ទៅលើភ្នាស polyvinylidene fluoride (GE Healthcare)។ រារាំងកន្លែងមិនជាក់លាក់ ហើយភ្ញាស់ជាមួយអង្គបដិប្រាណបឋម (សូមមើលតារាង S1 សម្រាប់ព័ត៌មានលម្អិត) ក្នុងទឹកដោះគោ 5% ក្នុង TBST (Tris-buffered saline with Tween) ជំហានលាងសម្អាត និងអង្គបដិប្រាណបន្ទាប់បន្សំក្នុង TBST Incubate។ ភ្ញាស់ជាមួយអង្គបដិប្រាណបឋមពេញមួយយប់នៅសីតុណ្ហភាព +4°C។ បន្ទាប់ពីលាងសម្អាតរួច លាបអង្គបដិប្រាណបន្ទាប់បន្សំរយៈពេល 2 ម៉ោងនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។ បន្ទាប់មក ដោយការភ្ញាស់ blot ដូចគ្នាជាមួយអង្គបដិប្រាណ anti-β-actin ការផ្ទុកដូចគ្នាត្រូវបានបញ្ជាក់។ ការរកឃើញដោយបំលែងទៅជា chemiluminescence និងការបង្កើន chemiluminescence (GE Healthcare)។
ណឺរ៉ូន​ដែល​ធ្លាប់​ត្រូវ​បាន​ដាំ​លើ​គម្រប​កញ្ចក់​ត្រូវ​បាន​ជួសជុល​ជាមួយ 4% paraformaldehyde (PFA)/PBS នៅ​ចំណុច​ពេលវេលា​ដែល​បាន​កំណត់​នៅ​សីតុណ្ហភាព​បន្ទប់​រយៈពេល 10 នាទី។ គម្រប​ត្រូវ​បាន​ជ្រាប​ចូល​ដំបូង​ជាមួយ 0.1% Triton X-100/PBS រយៈពេល 5 នាទី​នៅ​សីតុណ្ហភាព​បន្ទប់ ហើយ​បន្ទាប់​មក​ក្នុង​សារធាតុ​រារាំង [3% bovine serum albumin (BSA)/PBS]។ នៅ​ថ្ងៃ​ទី​ពីរ គម្រប​ត្រូវ​បាន​លាង​សម្អាត​ជាមួយ​សារធាតុ​រារាំង ហើយ​ភ្ញាស់​ជាមួយ​អង្គបដិប្រាណ​បន្ទាប់បន្សំ​ដែល​ភ្ជាប់​ជាមួយ fluorophore ដែល​សមស្រប​រយៈពេល 2 ម៉ោង​នៅ​សីតុណ្ហភាព​បន្ទប់។ ជាចុងក្រោយ គំរូ​ត្រូវ​បាន​លាង​សម្អាត​យ៉ាង​ហ្មត់ចត់​ក្នុង PBS ជាមួយ 4′,6-diamidino-2-Phenylindole (DAPI) ដែល​ត្រូវ​បាន​លាប​ពណ៌​ប្រឆាំង ហើយ​បន្ទាប់​មក​ជួសជុល​លើ​ស្លាយ​មីក្រូទស្សន៍​ជាមួយ Aqua-Poly/Mount។
កណ្ដុរ (ឈ្មោល និងញី) ត្រូវបានចាក់ថ្នាំស្ពឹកដោយការចាក់ថ្នាំ ketamine (130 mg/kg) និង xylazine (10 mg/kg) ចូលទៅក្នុងពោះ ហើយចាក់ថ្នាំបំបាត់ការឈឺចាប់ carprofen (5 mg/kg) នៅក្រោមស្បែក រួចដាក់ក្នុងឧបករណ៍ stereotactic (Kopf) ដែលបំពាក់ដោយបន្ទះក្តៅ។ បើកលលាដ៍ក្បាល ហើយប្រើឧបករណ៍ខួងធ្មេញដើម្បីស្តើងផ្នែកនៃ cerebellum ដែលត្រូវគ្នានឹងឆ្អឹង mis (ពី lambda: កន្ទុយ 1.8, lateral 1, ដែលត្រូវគ្នានឹង lobules IV និង V)។ ប្រើម្ជុលសឺរាំងកោងដើម្បីបង្កើតរន្ធតូចមួយនៅក្នុងលលាដ៍ក្បាលដោយប្រុងប្រយ័ត្ន ដើម្បីជៀសវាងការរំខានដល់សរសៃឈាមខាងក្រោម។ បន្ទាប់មក សរសៃឈាម capillary កញ្ចក់ស្តើងត្រូវបានបញ្ចូលយឺតៗទៅក្នុងរន្ធមីក្រូ (ពី -1.3 ដល់ -1 នៅផ្នែក ventral នៃ dura mater) ហើយ AAV ចំនួន 200 ទៅ 300 nl ត្រូវបានចាក់ចូលទៅក្នុងឧបករណ៍ចាក់មីក្រូ (Narishige) ជាមួយនឹងសឺរាំងដៃ (Narishige) ច្រើនដងក្នុងសម្ពាធទាបក្នុងរយៈពេល 10 ទៅ 20 នាទី។ បន្ទាប់ពីការចាក់ថ្នាំរួច សូមដាក់សរសៃឈាមតូចៗរយៈពេល ១០ នាទីទៀត ដើម្បីឱ្យមេរោគរីករាលដាលទាំងស្រុង។ បន្ទាប់ពីសរសៃឈាមតូចៗត្រូវបានដកចេញ ស្បែកត្រូវបានដេរដោយប្រុងប្រយ័ត្ន ដើម្បីកាត់បន្ថយការរលាកមុខរបួស និងអនុញ្ញាតឱ្យសត្វជាសះស្បើយ។ សត្វទាំងនោះត្រូវបានព្យាបាលដោយថ្នាំបំបាត់ការឈឺចាប់ (caspofen) រយៈពេលជាច្រើនថ្ងៃបន្ទាប់ពីការវះកាត់ ក្នុងអំឡុងពេលនោះ ស្ថានភាពរាងកាយរបស់ពួកគេត្រូវបានត្រួតពិនិត្យយ៉ាងយកចិត្តទុកដាក់ ហើយបន្ទាប់មកពួកគេត្រូវបានសម្លាប់នៅចំណុចពេលវេលាដែលបានកំណត់។ នីតិវិធីទាំងអស់ត្រូវបានអនុវត្តស្របតាមគោលការណ៍ណែនាំរបស់អឺរ៉ុប ជាតិ និងស្ថាប័ន ហើយត្រូវបានអនុម័តដោយ LandesamtfürNatur នៃ Umwelt និង Verbraucherschutz, North Rhine-Westphalia ប្រទេសអាល្លឺម៉ង់។
សត្វទាំងនោះត្រូវបានចាក់ថ្នាំសណ្តំដោយ ketamine (100 mg/kg) និង xylazine (10 mg/kg) ហើយបេះដូងត្រូវបានបញ្ចូលជាមួយ 0.1 M PBS ជាមុនសិន ហើយបន្ទាប់មកជាមួយ 4% PFA ក្នុង PBS។ ជាលិកាត្រូវបានវះកាត់ និងជួសជុលក្នុង 4% PFA/PBS ពេញមួយយប់នៅសីតុណ្ហភាព 4°C។ កាំបិតរំញ័រ (Leica Microsystems GmbH, Vienna, Austria) ត្រូវបានប្រើដើម្បីរៀបចំផ្នែក sagittal (កម្រាស់ 50 μm) ពីខួរក្បាលថេរក្នុង PBS។ លុះត្រាតែមានការបញ្ជាក់ផ្សេងពីនេះ ការជ្រលក់ពណ៌នៃផ្នែកអណ្តែតដោយសេរីត្រូវបានអនុវត្តដូចដែលបានពិពណ៌នាខាងលើ (13) នៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់ និងកូរ។ សរុបមក ដំបូង ចំណិតដែលទទួលបានត្រូវបានជ្រាបចូលជាមួយ 0.5% Triton X-100/PBS រយៈពេល 15 នាទីនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។ សម្រាប់អេពីតូបមួយចំនួន (Pcx និង Shmt2) ដោយកំដៅចំណិតនៅក្នុងសារធាតុ tris-EDTA នៅសីតុណ្ហភាព 80°C (PH 9) រយៈពេល 25 នាទីជំនួសឱ្យជំហាននេះ។ បន្ទាប់មក ផ្នែកទាំងនោះត្រូវបានភ្ញាស់ជាមួយអង្គបដិប្រាណបឋម (សូមមើលតារាង S1) ក្នុងសារធាតុរារាំង (3% BSA/PBS) នៅសីតុណ្ហភាព 4°C ពេញមួយយប់ ដោយកូរ។ នៅថ្ងៃបន្ទាប់ ផ្នែកទាំងនោះត្រូវបានលាងសម្អាតជាមួយសារធាតុរារាំង ហើយភ្ញាស់ជាមួយអង្គបដិប្រាណបន្ទាប់បន្សំដែលភ្ជាប់ជាមួយហ្វ្លុយអូរ៉ូហ្វ័ររយៈពេល 2 ម៉ោងនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។ ជាចុងក្រោយ ផ្នែកទាំងនោះត្រូវបានលាងសម្អាតយ៉ាងហ្មត់ចត់ក្នុង PBS ប្រឆាំងនឹងការជ្រលក់ពណ៌ជាមួយ DAPI ហើយបន្ទាប់មកជួសជុលជាមួយ AquaPolymount នៅលើស្លាយមីក្រូទស្សន៍។
មីក្រូទស្សន៍កុងហ្វូកាល់ស្កេនឡាស៊ែរ (TCS SP8-X ឬ TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) ដែលបំពាក់ដោយឡាស៊ែរពន្លឺពណ៌ស និងឡាស៊ែរអ៊ុលត្រាវីយូឡេឌីយ៉ូត 405 ត្រូវបានប្រើដើម្បីថតរូបភាពគំរូ។ ដោយការរំភើបហ្វ្លុយអូរ៉ូហ្វ័រ និងការប្រមូលសញ្ញាជាមួយឧបករណ៍ចាប់សញ្ញាចម្រុះ (HyDs) កម្មវិធី LAS-X ត្រូវបានប្រើដើម្បីប្រមូលរូបភាពដែលដាក់ជាជង់ស្របតាមការយកគំរូ Nyquist ក្នុងរបៀបលំដាប់លំដោយ៖ សម្រាប់បន្ទះមិនមែនបរិមាណ វាគឺជាសញ្ញាថាមវន្តខ្ពស់ (ឧទាហរណ៍ នៅក្នុងកោសិកាសូម៉ាទិក និងដង់ឌ្រីត) mtYFP) ប្រើ HyD ដើម្បីរកឃើញចំនួន PNs ក្នុងរបៀប BrightR)។ ការដាក់ចន្លោះពី 0.3 ដល់ 6 ns ត្រូវបានអនុវត្តដើម្បីកាត់បន្ថយផ្ទៃខាងក្រោយ។
ការថតរូបភាពតាមពេលវេលាជាក់ស្តែងនៃកោសិកាដែលបានតម្រៀប។ បន្ទាប់ពីការតម្រៀបនៅក្នុងឧបករណ៍ផ្ទុក Neurobasal-A ដែលមានអាហារបំប៉ន B27 1% និង GlutaMax 0.5 mM កោសិកាត្រូវបានសាបព្រោះភ្លាមៗនៅលើស្លាយកញ្ចក់ស្រោបដោយ poly-l-lysine (μ-Slide8 Well, Ibidi, លេខកាតាឡុក 80826) ហើយបន្ទាប់មករក្សាវានៅសីតុណ្ហភាព 37°C និង CO2 5% រយៈពេល 1 ម៉ោងដើម្បីឱ្យកោសិកាតាំងលំនៅ។ ការថតរូបភាពតាមពេលវេលាជាក់ស្តែងត្រូវបានអនុវត្តលើមីក្រូទស្សន៍កុងហ្វូកលស្កេនឡាស៊ែរ Leica SP8 ដែលបំពាក់ដោយឡាស៊ែរពណ៌ស HyD កែវថតប្រេង 63×[1.4 numerical aperture (NA)] និងដំណាក់កាលកំដៅ។
កណ្ដុរត្រូវបានចាក់ថ្នាំសណ្តំយ៉ាងឆាប់រហ័សជាមួយនឹងកាបូនឌីអុកស៊ីត ហើយត្រូវបានកាត់ក្បាល ខួរក្បាលត្រូវបានយកចេញពីលលាដ៍ក្បាលយ៉ាងឆាប់រហ័ស ហើយកាត់ជាផ្នែករាងសាជីតាល់ក្រាស់ 200μm (សម្រាប់ការពិសោធន៍ដាក់ស្លាក 13C) ឬក្រាស់ 275μm (សម្រាប់ការពិសោធន៍ហ្វូតុងពីរ) ដែលបំពេញដោយសម្ភារៈដូចខាងក្រោម។ ការ៉េម (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, ប្រទេសអាល្លឺម៉ង់) ត្រូវបានបំពេញដោយសារធាតុដូចខាងក្រោម៖ ទឹកកកត្រជាក់ 125 mM កាបូនឆ្អែត (95% O2 និង 5% CO2) Ca2 ទាប + សារធាតុរាវខួរក្បាលសិប្បនិម្មិត (ACSF) NaCl, 2.5 mM KCl, សូដ្យូមផូស្វាតស័រ 1.25 mM, NaHCO3 25 mM, គ្លុយកូស 25 mM, CaCl2 0.5 mM និង MgCl2 3.5 mM (សម្ពាធអូស្មូទិកពី 310 ទៅ 330 mmol)។ ផ្ទេរចំណិតខួរក្បាលដែលទទួលបានទៅបន្ទប់ភ្ញាស់មុនដែលមាន Ca2 + ACSF ខ្ពស់ជាង (NaCl 125.0 mM, KCl 2.5 mM, សូដ្យូមផូស្វាតបាហ្វើរ 1.25 mM, NaHCO3 25.0 mM, d-គ្លុយកូស 25.0 mM, CaCl2 1.0 mM និង MgCl2 2.0 mM) pH 7.4 និង 310 ទៅ 320 mmol)។
ក្នុងអំឡុងពេលដំណើរការថតរូបភាព ចំណិតទាំងនោះត្រូវបានផ្លាស់ទីទៅក្នុងបន្ទប់ថតរូបភាពដែលឧទ្ទិសដល់ការថតរូបភាព ហើយការពិសោធន៍ត្រូវបានអនុវត្តក្រោមការបញ្ចូលចរន្ត ACSF ជាបន្តបន្ទាប់នៅសីតុណ្ហភាពថេរពី 32° ដល់ 33°C។ មីក្រូទស្សន៍ស្កេនឡាស៊ែរពហុហ្វូតុង (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) បំពាក់ដោយកែវថត Leica 25x (NA 0.95, ទឹក) ឡាស៊ែរ Ti:Sapphire (Chameleon Vision II, Coherent) ត្រូវបានប្រើសម្រាប់ការថតរូបភាពចំណិត។ ម៉ូឌុល FLIM (PicoHarp300, PicoQuant)។
FLIM នៃ Grx1-roGFP2។ ការផ្លាស់ប្តូរនៅក្នុងស្ថានភាព redox cytoplasmic នៃ PNs ត្រូវបានវាស់ដោយ FLIM ពីរហ្វូតុងនៅក្នុងចំណិតខួរក្បាល sagittal ដែល biosensor Grx1-roGFP2 កំណត់គោលដៅ PNs។ នៅក្នុងស្រទាប់ PN វាលទទួលត្រូវបានជ្រើសរើសប្រហែល 50 ទៅ 80 μm នៅខាងក្រោមផ្ទៃចំណិត ដើម្បីធានាថាមាន PN ដែលអាចឋិតថេរបាន (នោះគឺកង្វះរចនាសម្ព័ន្ធអង្កាំ ឬការផ្លាស់ប្តូរ morphological ណឺរ៉ូនតាមបណ្តោយ dendrites) និងឧបករណ៍ចាប់សញ្ញា roGFP2 វិជ្ជមានទ្វេ និង AAV ដែលអ៊ិនកូដ shRNA PCx ឬលំដាប់ត្រួតពិនិត្យរបស់វា (mCherry នីមួយៗបញ្ចេញរួមគ្នា)។ ប្រមូលរូបភាពជង់តែមួយជាមួយនឹងការពង្រីកឌីជីថល 2x [រលកពន្លឺរំញោច៖ 890 nm; 512 nm 512 ភីកសែល]។ ការរកឃើញ៖ HyD ខាងក្នុង ក្រុមតម្រង fluorescein isothiocyanate (FITC)] និងមធ្យមភាគរូបភាពក្នុងរយៈពេល 2 ទៅ 3 នាទីត្រូវបានប្រើដើម្បីធានាថាហ្វូតុងគ្រប់គ្រាន់ត្រូវបានប្រមូល (ហ្វូតុងសរុប 1000) សម្រាប់ការសមខ្សែកោង។ ភាពរសើបនៃការស៊ើបអង្កេត Grx1-roGFP2 និងការផ្ទៀងផ្ទាត់លក្ខខណ្ឌ FLIM ត្រូវបានអនុវត្តដោយការត្រួតពិនិត្យតម្លៃអាយុកាលរបស់ roGFP2 នៅពេលបន្ថែម 10 mM H2O2 ពីខាងក្រៅទៅក្នុង ACSF នៃការបញ្ចូលឈាម (ដើម្បីបង្កើនអុកស៊ីតកម្ម ដែលបណ្តាលឱ្យមានអាយុកាលកើនឡើង) ហើយបន្ទាប់មកបន្ថែម 2 mM dithiothreitol (កាត់បន្ថយកម្រិតនៃការកាត់បន្ថយ ដែលបណ្តាលឱ្យមានអាយុកាលថយចុះ) (រូបភាព S8, D ដល់ G)។ ប្រើកម្មវិធី FLIMfit 5.1.1 ដើម្បីវិភាគលទ្ធផលដែលទទួលបាន សមនឹងខ្សែកោងរលួយអិចស្ប៉ូណង់ស្យែលតែមួយនៃរូបភាពទាំងមូលទៅនឹង IRF ដែលវាស់បាន (មុខងារឆ្លើយតបឧបករណ៍) ហើយ χ2 គឺប្រហែល 1។ ដើម្បីគណនាអាយុកាលរបស់ PN តែមួយ របាំងជុំវិញរាងកាយសរសៃប្រសាទត្រូវបានគូរដោយដៃ ហើយអាយុកាលជាមធ្យមនៅក្នុងរបាំងនីមួយៗត្រូវបានប្រើសម្រាប់ការវាស់វែង។
ការវិភាគសក្តានុពលមីតូខនឌ្រី។ បន្ទាប់ពីផ្នែកស្រួចស្រាវត្រូវបានភ្ញាស់ជាមួយ TMRM 100 nM ដែលបានបន្ថែមដោយផ្ទាល់ទៅក្នុង ACSF ដែលបានបំពេញរយៈពេល 30 នាទី ការផ្លាស់ប្តូរសក្តានុពលមីតូខនឌ្រីនៃ PNs ត្រូវបានវាស់ដោយមីក្រូទស្សន៍ពីរហ្វូតុង។ ការថតរូបភាព TMRM ត្រូវបានអនុវត្តដោយការរំភើបឧបករណ៍ចាប់សញ្ញានៅ 920 nm និងប្រើ HyD ខាងក្នុង (tetramethylrhodamine isothiocyanate: 585/40 nm) ដើម្បីប្រមូលសញ្ញា។ ដោយប្រើរលករំញោចដូចគ្នា ប៉ុន្តែប្រើ HyD ខាងក្នុងខុសគ្នា (FITC: 525/50) ដើម្បីថតរូបភាព mtYFP។ ប្រើកម្មវិធីជំនួយ Image Calculator របស់ ImageJ ដើម្បីវាយតម្លៃសក្តានុពលមីតូខនឌ្រីនៅកម្រិតកោសិកាតែមួយ។ សរុបមក សមីការកម្មវិធីជំនួយ៖ សញ្ញា = min (mtYFP, TMRM) ត្រូវបានប្រើដើម្បីកំណត់តំបន់មីតូខនឌ្រីដែលបង្ហាញសញ្ញា TMRM នៅក្នុង Purkinje Somali នៅក្នុងរូបភាព confocal តែមួយនៃឆានែលដែលត្រូវគ្នា។ បន្ទាប់មក ផ្ទៃភីកសែលនៅក្នុងរបាំងលទ្ធផលត្រូវបានវាស់វែង ហើយបន្ទាប់មកធ្វើឱ្យមានលក្ខណៈធម្មតានៅលើរូបភាពជង់តែមួយដែលត្រូវគ្នានៃឆានែល mtYFP ដើម្បីទទួលបានប្រភាគមីតូខនឌ្រីដែលបង្ហាញពីសក្តានុពលមីតូខនឌ្រី។
រូបភាពនេះត្រូវបានកាត់ចេញដោយប្រើកម្មវិធី Huygens Pro (Scientific Volume Imaging)។ ចំពោះរូបភាពដែលបានស្កេននៃក្រឡាក្បឿង ការភ្ជាប់ក្រឡាក្បឿងតែមួយត្រូវបានធ្វើឡើងដោយប្រើក្បួនដោះស្រាយភ្ជាប់ដោយស្វ័យប្រវត្តិដែលផ្តល់ដោយកម្មវិធី LAS-X។ បន្ទាប់ពីការក្រិតតាមខ្នាតរូបភាព សូមប្រើ ImageJ និង Adobe Photoshop ដើម្បីដំណើរការរូបភាពបន្ថែមទៀត និងកែតម្រូវពន្លឺ និងភាពផ្ទុយគ្នាឱ្យស្មើគ្នា។ ប្រើ Adobe Illustrator សម្រាប់ការរៀបចំក្រាហ្វិក។
ការវិភាគការផ្តោតអារម្មណ៍ mtDNA។ ចំនួននៃដំបៅ mtDNA ត្រូវបានវាស់វែងនៅលើផ្នែក cerebellum ដែលមានស្លាកសញ្ញាប្រឆាំងនឹង DNA ដោយមីក្រូទស្សន៍ confocal ។ តំបន់គោលដៅនីមួយៗត្រូវបានបង្កើតឡើងសម្រាប់តួកោសិកា និងស្នូលនៃកោសិកានីមួយៗ ហើយតំបន់រៀងៗខ្លួនត្រូវបានគណនាដោយប្រើកម្មវិធីជំនួយ Multi Measure (កម្មវិធី ImageJ)។ ដកតំបន់ស្នូលចេញពីតំបន់តួកោសិកា ដើម្បីទទួលបានតំបន់ស៊ីតូប្លាស្មិក។ ជាចុងក្រោយ កម្មវិធីជំនួយ Analyze Particles (កម្មវិធី ImageJ) ត្រូវបានប្រើដើម្បីវាស់វែងចំណុច DNA ស៊ីតូប្លាស្មិកដែលបង្ហាញពី mtDNA នៅលើរូបភាពកម្រិតចាប់ផ្តើមដោយស្វ័យប្រវត្តិ ហើយលទ្ធផលដែលទទួលបានត្រូវបានធ្វើឱ្យមានលក្ខណៈធម្មតាទៅនឹងមធ្យមភាគ PN នៃកណ្ដុរ CTRL ។ លទ្ធផលត្រូវបានបង្ហាញជាចំនួនមធ្យមនៃនុយក្លេអូស៊ីតក្នុងមួយកោសិកា។
ការវិភាគការបញ្ចេញប្រូតេអ៊ីន។ ប្រើកម្មវិធីជំនួយ Image Calculator របស់ ImageJ ដើម្បីវាយតម្លៃការបញ្ចេញប្រូតេអ៊ីននៅក្នុង PN នៅកម្រិតកោសិកាតែមួយ។ សរុបមក នៅក្នុងរូបភាព confocal ស្រទាប់តែមួយនៃឆានែលដែលត្រូវគ្នា តាមរយៈសមីការ៖ signal = min (mtYFP, antibody) តំបន់មីតូខនឌ្រីដែលបង្ហាញពីប្រតិកម្មភាពស៊ាំទៅនឹងអង្គបដិប្រាណជាក់លាក់មួយនៅក្នុង Purkina ត្រូវបានកំណត់អត្តសញ្ញាណ។ បន្ទាប់មកផ្ទៃភីកសែលនៅក្នុងរបាំងលទ្ធផលត្រូវបានវាស់វែង ហើយបន្ទាប់មកធ្វើឱ្យមានលក្ខណៈធម្មតានៅលើរូបភាព single-stack កម្រិតដែលត្រូវគ្នានៃឆានែល mtYFP ដើម្បីទទួលបានប្រភាគមីតូខនឌ្រីនៃប្រូតេអ៊ីនដែលបានបង្ហាញ។
ការវិភាគដង់ស៊ីតេកោសិកា Purkinje។ កម្មវិធីជំនួយ Cell Counter របស់ ImageJ ត្រូវបានប្រើដើម្បីវាយតម្លៃដង់ស៊ីតេ Purkinje ដោយចែកចំនួនកោសិកា Purkinje ដែលរាប់ដោយប្រវែងនៃរង្វង់ cerebellar ដែលកាន់កាប់ដោយកោសិកាដែលរាប់។
ការរៀបចំ និងការប្រមូលសំណាក។ ខួរក្បាលពីក្រុមត្រួតពិនិត្យ និងកណ្ដុរ Mfn2cKO ត្រូវបានស្អិតជាប់ក្នុង 2% PFA/2.5% glutaraldehyde ក្នុងសារធាតុ phosphate buffer (PB) 0.1 M ហើយបន្ទាប់មកផ្នែក coronal ត្រូវបានរៀបចំដោយប្រើ ciliates (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienna, Austria) (កម្រាស់ 50 ដល់ 60 μm)។ បន្ទាប់មកស្អិតជាប់ក្នុងសារធាតុ PB buffer ក្នុង 1% os tetraoxide និង 1.5% potassium ferrocyanide នៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់រយៈពេល 1 ម៉ោង។ ផ្នែកទាំងនោះត្រូវបានលាងសម្អាតបីដងជាមួយទឹកចម្រោះ ហើយបន្ទាប់មកប្រឡាក់ពណ៌ជាមួយអេតាណុល 70% ដែលមានផ្ទុក uranyl acetate 1% រយៈពេល 20 នាទី។ បន្ទាប់មកផ្នែកទាំងនោះត្រូវបានខ្សោះជាតិទឹកក្នុងអាល់កុលដែលបានចាត់ថ្នាក់ ហើយបង្កប់ក្នុង Durcupan ACM (Araldite casting resin M) epoxy resin (Electron Microscopy Sciences, លេខកាតាឡុក 14040) រវាងស្លាយកញ្ចក់ស្រោបដោយស៊ីលីកុន និងចុងក្រោយនៅសីតុណ្ហភាព 60°C លាយបញ្ចូលគ្នាក្នុងឡរយៈពេល 48 ម៉ោង។ តំបន់​ស្រទាប់​ខួរក្បាល​តូច​ត្រូវ​បាន​ជ្រើសរើស ហើយ​ផ្នែក​ស្តើង​បំផុត 50 nm ត្រូវ​បាន​កាត់​លើ Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienna, Austria) ហើយ​បាន​រើស​លើ​ក្រឡាចត្រង្គ​ស្ពាន់​ទំហំ 2×1 mm ដែល​ស្រោប​ដោយ​ខ្សែភាពយន្ត polystyrene។ ផ្នែក​ទាំងនោះ​ត្រូវ​បាន​ប្រឡាក់​ដោយ​ដំណោះស្រាយ uranyl acetate 4% ក្នុង​ទឹក H2O រយៈពេល 10 នាទី លាង​សម្អាត​ជាមួយ​ទឹក H2O ច្រើន​ដង បន្ទាប់​មក​លាង​សម្អាត​ជាមួយ​ទឹក Reynolds lead citrate ក្នុង​ទឹក H2O រយៈពេល 10 នាទី ហើយ​បន្ទាប់​មក​លាង​សម្អាត​ជាមួយ​ទឹក H2O ច្រើន​ដង។ មីក្រូទស្សន៍​ត្រូវ​បាន​ថត​ដោយ​មីក្រូទស្សន៍​អេឡិចត្រុង​បញ្ជូន Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) ដោយ​ប្រើ​កាមេរ៉ា​ឌីជីថល TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 (TVIPS GmbH, Gauting, USA)។ ប្រទេស​អាល្លឺម៉ង់។
ចំពោះកណ្ដុរដែលឆ្លងមេរោគ AAV ខួរក្បាលត្រូវបានបំបែក និងកាត់ជាផ្នែក sagittal ក្រាស់ 1 ម.ម ហើយ cerebellum ត្រូវបានពិនិត្យដោយប្រើមីក្រូទស្សន៍ fluorescence ដើម្បីកំណត់អត្តសញ្ញាណចិញ្ចៀនដែលឆ្លងមេរោគ AAV (នោះគឺ mCherry expressing)។ មានតែការពិសោធន៍ដែលការចាក់ AAV បណ្តាលឱ្យមានប្រសិទ្ធភាព transduction ខ្ពស់នៃស្រទាប់កោសិកា Purkinje (ពោលគឺស្ទើរតែស្រទាប់ទាំងមូល) នៅក្នុងចិញ្ចៀន cerebellar យ៉ាងហោចណាស់ពីរជាប់ៗគ្នាប៉ុណ្ណោះដែលត្រូវបានប្រើ។ រង្វិលជុំ AAV-transduced ត្រូវបាន microdissected សម្រាប់ការជួសជុលពេញមួយយប់ (PFA 4% និង glutaraldehyde 2.5% នៅក្នុងសារធាតុ cocoate buffer 0.1 M) ហើយដំណើរការបន្ថែមទៀត។ សម្រាប់ការបង្កប់ EPON ជាលិកាដែលជួសជុលត្រូវបានលាងសម្អាតជាមួយសារធាតុ sodium cocoate buffer 0.1 M (Applichem) ហើយភ្ញាស់ជាមួយ 2% OsO4 (os, Science Services; Caco) ក្នុងសារធាតុ sodium cocoate buffer 0.1 M (Applichem) រយៈពេល 4 ម៉ោង បន្ទាប់មកលាងសម្អាតរយៈពេល 2 ម៉ោង។ ធ្វើម្តងទៀត 3 ដងជាមួយសារធាតុ cocamide buffer 0.1 M។ បន្ទាប់មក ស៊េរីអេតាណុលឡើងលើត្រូវបានប្រើដើម្បីភ្ញាស់ដំណោះស្រាយអេតាណុលនីមួយៗនៅសីតុណ្ហភាព ៤អង្សាសេ រយៈពេល ១៥ នាទី ដើម្បីធ្វើឱ្យជាលិកាស្ងួត។ ជាលិកាត្រូវបានផ្ទេរទៅអុកស៊ីដប្រូពីលីន ហើយភ្ញាស់ពេញមួយយប់ក្នុង EPON (Sigma-Aldrich) នៅសីតុណ្ហភាព ៤អង្សាសេ។ ដាក់ជាលិកាក្នុង EPON ស្រស់នៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់រយៈពេល ២ ម៉ោង ហើយបន្ទាប់មកបង្កប់វានៅសីតុណ្ហភាព ៦២អង្សាសេ រយៈពេល ៧២ ម៉ោង។ ប្រើឧបករណ៍អ៊ុលត្រាមីក្រូតូម (Leica Microsystems, UC6) និងកាំបិតពេជ្រ (Diatome, Biel, ស្វីស) ដើម្បីកាត់ផ្នែកស្តើងបំផុត ៧០ nm ហើយលាបពណ៌ជាមួយ uranyl acetate ១.៥% រយៈពេល ១៥ នាទីនៅសីតុណ្ហភាព ៣៧អង្សាសេ ហើយលាបពណ៌ជាមួយដំណោះស្រាយ citrate សំណរយៈពេល ៤ នាទី។ មីក្រូក្រាហ្វអេឡិចត្រុងត្រូវបានថតដោយប្រើមីក្រូទស្សន៍អេឡិចត្រុងបញ្ជូន JEM-2100 Plus (JEOL) ដែលបំពាក់ដោយ Camera OneView 4K 16-bit (Gatan) និងកម្មវិធី DigitalMicrograph (Gatan)។ សម្រាប់ការវិភាគ មីក្រូទស្សន៍អេឡិចត្រុងត្រូវបានទទួលដោយប្រើការពង្រីកឌីជីថល 5000× ឬ 10,000×។
ការវិភាគរូបវិទ្យានៃមីតូខនឌ្រី។ សម្រាប់ការវិភាគទាំងអស់ វណ្ឌវង្កនៃមីតូខនឌ្រីនីមួយៗត្រូវបានគូសបញ្ជាក់ដោយដៃនៅក្នុងរូបភាពឌីជីថលដោយប្រើកម្មវិធី ImageJ។ ប៉ារ៉ាម៉ែត្ររូបវិទ្យាផ្សេងៗគ្នាត្រូវបានវិភាគ។ ដង់ស៊ីតេមីតូខនឌ្រីត្រូវបានបង្ហាញជាភាគរយដែលទទួលបានដោយការបែងចែកផ្ទៃមីតូខនឌ្រីសរុបនៃកោសិកានីមួយៗដោយផ្ទៃស៊ីតូប្លាស្ម (ផ្ទៃស៊ីតូប្លាស្ម = ផ្ទៃកោសិកា-ផ្ទៃស្នូលកោសិកា) × 100។ ភាពមូលនៃមីតូខនឌ្រីត្រូវបានគណនាដោយរូបមន្ត [4π∙(ផ្ទៃ/បរិវេណ 2)]។ រូបរាងអ៊ីស្តានៃមីតូខនឌ្រីត្រូវបានវិភាគ និងបែងចែកជាពីរប្រភេទ ("បំពង់" និង "ពងបែក") យោងទៅតាមរាងសំខាន់ៗរបស់វា។
ការវិភាគចំនួន និងដង់ស៊ីតេរបស់ Autophagosome/lysosome។ ប្រើកម្មវិធី ImageJ ដើម្បីគូសបញ្ជាក់ដោយដៃនូវវណ្ឌវង្កនៃ autophagosome/lysosome នីមួយៗនៅក្នុងរូបភាពឌីជីថល។ ផ្ទៃ Autophagosome/lysosome ត្រូវបានបង្ហាញជាភាគរយដែលគណនាដោយការចែកផ្ទៃរចនាសម្ព័ន្ធ autophagosome/lysosome សរុបនៃកោសិកានីមួយៗដោយផ្ទៃស៊ីតូប្លាស្ម (ផ្ទៃស៊ីតូប្លាស្ម = ផ្ទៃកោសិកា - ផ្ទៃស្នូល) × 100។ ដង់ស៊ីតេនៃ autophagosomes/lysosomes ត្រូវបានគណនាដោយការចែកចំនួនសរុបដោយចំនួនរចនាសម្ព័ន្ធ autophagosome/lysosome ក្នុងមួយកោសិកា (ទាក់ទងនឹងផ្ទៃស៊ីតូប្លាស្ម) (ផ្ទៃស៊ីតូប្លាស្ម = ផ្ទៃកោសិកា - ផ្ទៃនុយក្លេអ៊ែរ)។
ការដាក់ស្លាកសម្រាប់ការកាត់ស្រួច និងការរៀបចំសំណាក។ សម្រាប់ការពិសោធន៍ដែលតម្រូវឱ្យមានការដាក់ស្លាកជាតិស្ករ សូមផ្ទេរចំណិតខួរក្បាលស្រួចទៅបន្ទប់ភ្ញាស់មុន ដែលមានកាបូនឆ្អែត (95% O2 និង 5% CO2) កាល់ស្យូម Ca2 + ACSF ខ្ពស់ (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM សូដ្យូមផូស្វាតសារធាតុរាវ, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-គ្លុយកូស, 1.0 mM CaCl2 និង 2.0 mM MgCl2 កែតម្រូវទៅ pH 7.4 និង 310 ទៅ 320 mOsm) ដែលក្នុងនោះជាតិស្ករគឺ 13 C 6- ការជំនួសជាតិស្ករ (Eurisotop លេខកាតាឡុក CLM-1396)។ ចំពោះការពិសោធន៍ដែលតម្រូវឱ្យមានការដាក់ស្លាក pyruvate សូមផ្ទេរចំណិតខួរក្បាលស្រួចស្រាវទៅ Ca2 + ACSF ខ្ពស់ជាង (NaCl 125.0 mM, KCl 2.5 mM, សូដ្យូមផូស្វាត buffer 1.25 mM, NaHCO3 25.0 mM, d-គ្លុយកូស 25.0 mM, CaCl2 1.0 mM និងបន្ថែម MgCl2 2.0 mM កែសម្រួលទៅ pH 7.4 និង 310 ទៅ 320mOsm) ហើយបន្ថែម 1mM 1-[1-13C]pyruvate (Eurisotop លេខកាតាឡុក CLM-1082)។ ភ្ញាស់ផ្នែកនានារយៈពេល 90 នាទីនៅសីតុណ្ហភាព 37°C។ នៅចុងបញ្ចប់នៃការពិសោធន៍ ផ្នែកទាំងនោះត្រូវបានលាងសម្អាតយ៉ាងលឿនជាមួយនឹងដំណោះស្រាយទឹក (pH 7.4) ដែលមានផ្ទុកអាម៉ូញ៉ូមកាបូណាត 75 mM ហើយបន្ទាប់មកត្រូវបានធ្វើឱ្យដូចគ្នាក្នុងសមាមាត្រ 40:40:20 (v:v:v) acetonitrile (ACN): methanol: ទឹក។ បន្ទាប់ពីផ្នែកទាំងនោះត្រូវបានភ្ញាស់លើទឹកកករយៈពេល 30 នាទី គំរូត្រូវបានបង្វិលក្នុងកម្លាំង 21,000 ក្រាម រយៈពេល 10 នាទី នៅសីតុណ្ហភាព 4°C ហើយសារធាតុរាវថ្លាត្រូវបានសម្ងួតក្នុងម៉ាស៊ីនប្រមូលផ្តុំ SpeedVac។ គ្រាប់សារធាតុរំលាយស្ងួតដែលជាលទ្ធផលត្រូវបានរក្សាទុកនៅសីតុណ្ហភាព -80°C រហូតដល់ការវិភាគ។
ការវិភាគក្រូម៉ាតូក្រាហ្វី-ម៉ាសស្ពិចត្រូម៉ែត្រីរាវនៃអាស៊ីតអាមីណូដែលមានស្លាក C ចំនួន 13។ សម្រាប់ការវិភាគក្រូម៉ាតូក្រាហ្វី-ម៉ាសស្ពិចត្រូម៉ែត្រីរាវ (LC-MS) គ្រាប់មេតាបូលីតត្រូវបានរំលាយឡើងវិញក្នុងទឹកថ្នាក់ LC-MS ចំនួន 75μl (Honeywell)។ បន្ទាប់ពីការបង្វិលនៅ 21,000 g រយៈពេល 5 នាទីនៅសីតុណ្ហភាព 4°C សារធាតុរាវ supernatant ដែលបានបញ្ជាក់ចំនួន 20 μl ត្រូវបានប្រើសម្រាប់ការវិភាគលំហូរអាស៊ីតអាមីណូ ខណៈពេលដែលសារធាតុចម្រាញ់ដែលនៅសល់ត្រូវបានប្រើភ្លាមៗសម្រាប់ការវិភាគអ៊ីយ៉ុង (សូមមើលខាងក្រោម)។ ការវិភាគអាស៊ីតអាមីណូត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើពិធីការដេរីវ៉ាទីស benzoyl chloride ដែលបានពិពណ៌នាពីមុន (55, 56)។ នៅក្នុងជំហានដំបូង 10μl នៃសូដ្យូមកាបូណាត 100 mM (Sigma-Aldrich) ត្រូវបានបន្ថែមទៅក្នុងសារធាតុចម្រាញ់មេតាបូលីត 20μl ហើយបន្ទាប់មក 10μl នៃ benzoyl chloride 2% (Sigma-Aldrich) ត្រូវបានបន្ថែមទៅក្នុង ACN ថ្នាក់ LC។ គំរូនេះត្រូវបានបង្វិលមួយសន្ទុះ ហើយបន្ទាប់មកបង្វិលក្នុងល្បឿន 21,000 ក្រាម រយៈពេល 5 នាទី នៅសីតុណ្ហភាព 20°C។ ផ្ទេរសារធាតុរាវខាងលើដែលបានសម្អាតរួចទៅក្នុងដបយកគំរូស្វ័យប្រវត្តិ 2 មីលីលីត្រ ដែលមានកញ្ចក់រាងកោណបញ្ចូល (បរិមាណ 200 μl)។ គំរូត្រូវបានវិភាគដោយប្រើប្រព័ន្ធ LC ដំណើរការខ្ពស់ខ្លាំង Acquity iClass (Waters) ដែលភ្ជាប់ទៅនឹងម៉ាស៊ីនវាស់ម៉ាសស្ពិចត្រូម៉ែត្រដែលមានភាពជាក់លាក់ខ្ពស់ Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) (Thermo Fisher Scientific)។ សម្រាប់ការវិភាគ 2μl នៃគំរូដេរីវេត្រូវបានចាក់ចូលទៅក្នុងជួរឈរ T3 ស៊ីលីកាកម្លាំងខ្ពស់ 100×1.0 mm (Waters) ដែលមានភាគល្អិត 1.8μm។ អត្រាលំហូរគឺ 100μl/នាទី ហើយប្រព័ន្ធសតិបណ្ដោះអាសន្នមានសតិបណ្ដោះអាសន្ន A (ទម្រង់អាម៉ូញ៉ូម 10 mM និងអាស៊ីតហ្វមីក 0.15% ក្នុងទឹក) និងសតិបណ្ដោះអាសន្ន B (ACN)។ ជម្រាលមានដូចខាងក្រោម៖ 0%B នៅ 0 នាទី; 0%B។ ០ ទៅ ១៥% B នៅ ០ ទៅ ០.១ នាទី; ១៥ ទៅ ១៧% B នៅ ០.១ ទៅ ០.៥ នាទី; B នៅ ១៧ ទៅ ៥៥% នៅ ០.៥ ទៅ ១៤ នាទី; B នៅ ៥៥ ទៅ ៧០% នៅ ១៤ ទៅ ១៤.៥ នាទី; នៅ ១៤.៥ ទៅ ៧០ ទៅ ១០០% B នៅ ១៨ នាទី; ១០០% B នៅ ១៨ ទៅ ១៩ នាទី; ១០០ ទៅ ០% B នៅ ១៩ ទៅ ១៩.១ នាទី; ០% B នៅ ១៩.១ ដល់ ២៨ នាទី (៥៥, ៥៦)។ ស្ពិចត្រូម៉ែត្រម៉ាស់ QE-HF ដំណើរការក្នុងរបៀបអ៊ីយ៉ូដនីយកម្មវិជ្ជមាន ជាមួយនឹងជួរម៉ាស់ m/z (សមាមាត្រម៉ាស់/បន្ទុក) ពី 50 ដល់ 750។ គុណភាពបង្ហាញដែលបានអនុវត្តគឺ 60,000 ហើយគោលដៅអ៊ីយ៉ុងត្រួតពិនិត្យការកើនឡើង (AGC) ដែលទទួលបានគឺ 3×106 ហើយពេលវេលាអ៊ីយ៉ុងអតិបរមាគឺ 100 មីលីវិនាទី។ ប្រភពអ៊ីយ៉ូដនីយកម្មអេឡិចត្រូស្ព្រាយ (ESI) ដែលត្រូវបានកំដៅដំណើរការនៅវ៉ុលបាញ់ 3.5 kV សីតុណ្ហភាពសរសៃឈាម 250°C លំហូរខ្យល់ក្នុងស្រោម 60 AU (ឯកតាតាមអំពើចិត្ត) និងលំហូរខ្យល់ជំនួយ 20 AU។ 250°C។ កែវ S ត្រូវបានកំណត់ទៅ 60 AU។
ការវិភាគអានីយ៉ុងក្រូម៉ាតូក្រាហ្វី-MS នៃអាស៊ីតសរីរាង្គដែលមានស្លាក 13C។ ទឹកភ្លៀងមេតាបូលីតដែលនៅសល់ (55μl) ត្រូវបានវិភាគដោយប្រើប្រព័ន្ធក្រូម៉ាតូក្រាហ្វីអ៊ីយ៉ុង Dionex (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) ដែលភ្ជាប់ទៅនឹងម៉ាស៊ីនវាស់ម៉ាស QE-HF (Thermo Fisher Scientific)។ សរុបមក សារធាតុចម្រាញ់មេតាបូលីត 5μl ត្រូវបានចាក់ចូលទៅក្នុងជួរឈរ Dionex IonPac AS11-HC ដែលបំពាក់ដោយ HPLC (2 mm×250 mm, ទំហំភាគល្អិត 4μm, Thermo Fisher Scientific) ក្នុងរបៀបរុញចូលដោយផ្នែកជាមួយនឹងសមាមាត្របំពេញ 1។) ជួរឈរការពារ Dionex IonPac AG11-HC (2 mm x 50 mm, 4μm, Thermo Fisher Scientific)។ សីតុណ្ហភាពជួរឈរត្រូវបានរក្សានៅ 30°C ហើយឧបករណ៍យកសំណាកស្វ័យប្រវត្តិត្រូវបានកំណត់ទៅ 6°C។ ប្រើប្រអប់ប៉ូតាស្យូមអ៊ីដ្រូស៊ីតដែលភ្ជាប់មកជាមួយទឹកដែលគ្មានអ៊ីយ៉ុងដើម្បីបង្កើតជម្រាលប៉ូតាស្យូមអ៊ីដ្រូស៊ីតតាមរយៈម៉ាស៊ីនបង្កើតសារធាតុរំលាយ។ ការបំបែកសារធាតុរំលាយអាហារក្នុងអត្រាលំហូរ 380μl/នាទី ដោយអនុវត្តជម្រាលដូចខាងក្រោម៖ ០ ទៅ ៣ នាទី, 10 mM KOH; ៣ ទៅ ១២ នាទី, 10 ទៅ 50 mM KOH; ១២ ទៅ ១៩ នាទី, 50 ទៅ 100 mM KOH; ១៩ ទៅ ២១ នាទី, 100 mM KOH; ២១ ទៅ ២១.៥ នាទី, 100 ទៅ 10 mM KOH។ ជួរឈរត្រូវបានធ្វើឱ្យមានតុល្យភាពឡើងវិញក្រោម 10 mM KOH រយៈពេល 8.5 នាទី។
សារធាតុរំលាយដែលត្រូវបានបញ្ចេញត្រូវបានផ្សំជាមួយនឹងស្ទ្រីមបន្ថែមអ៊ីសូប្រូផាណុល 150μl/នាទី បន្ទាប់ពីជួរឈរ ហើយបន្ទាប់មកត្រូវបានដឹកនាំទៅកាន់ម៉ាស៊ីនវាស់ម៉ាសដែលមានគុណភាពបង្ហាញខ្ពស់ ដែលដំណើរការក្នុងរបៀបអ៊ីយ៉ូដអវិជ្ជមាន។ MS កំពុងត្រួតពិនិត្យជួរម៉ាសចាប់ពី m/z 50 ដល់ 750 ជាមួយនឹងគុណភាពបង្ហាញ 60,000។ AGC ត្រូវបានកំណត់ទៅ 1×106 ហើយពេលវេលាអ៊ីយ៉ុងអតិបរមាត្រូវបានរក្សាទុកនៅ 100 ms។ ប្រភព ESI ដែលត្រូវបានកំដៅត្រូវបានដំណើរការនៅវ៉ុលបាញ់ 3.5 kV។ ការកំណត់ផ្សេងទៀតនៃប្រភពអ៊ីយ៉ុងមានដូចខាងក្រោម៖ សីតុណ្ហភាពសរសៃឈាម 275°C; លំហូរឧស្ម័នស្រោប 60 AU; លំហូរឧស្ម័នជំនួយ 20 AU នៅ 300°C និងការកំណត់កែវ S ទៅ 60 AU។
ការវិភាគទិន្នន័យនៃសារធាតុរំលាយដែលមានស្លាក 13C។ ប្រើកម្មវិធី TraceFinder (កំណែ 4.2, Thermo Fisher Scientific) សម្រាប់ការវិភាគទិន្នន័យនៃសមាមាត្រអ៊ីសូតូប។ អត្តសញ្ញាណនៃសមាសធាតុនីមួយៗត្រូវបានផ្ទៀងផ្ទាត់ដោយសមាសធាតុយោងដែលអាចទុកចិត្តបាន និងវិភាគដោយឯករាជ្យ។ ដើម្បីអនុវត្តការវិភាគបង្កើនអ៊ីសូតូប ផ្ទៃនៃក្រូម៉ាតូក្រាមអ៊ីយ៉ុងដែលបានស្រង់ចេញ (XIC) នៃអ៊ីសូតូប 13C នីមួយៗ (Mn) ត្រូវបានស្រង់ចេញពី [M + H] + ដែល n ជាចំនួនកាបូននៃសមាសធាតុគោលដៅ ដែលប្រើដើម្បីវិភាគអាស៊ីតអាមីណូ ឬ [MH] + ត្រូវបានប្រើដើម្បីវិភាគអានីយ៉ុង។ ភាពត្រឹមត្រូវនៃម៉ាស់របស់ XIC គឺតិចជាងប្រាំផ្នែកក្នុងមួយលាន ហើយភាពត្រឹមត្រូវនៃ RT គឺ 0.05 នាទី។ ការវិភាគបង្កើនត្រូវបានអនុវត្តដោយការគណនាសមាមាត្រនៃអ៊ីសូតូបនីមួយៗដែលបានរកឃើញទៅនឹងផលបូកនៃអ៊ីសូតូបទាំងអស់នៃសមាសធាតុដែលត្រូវគ្នា។ សមាមាត្រទាំងនេះត្រូវបានផ្តល់ជាតម្លៃភាគរយសម្រាប់អ៊ីសូតូបនីមួយៗ ហើយលទ្ធផលត្រូវបានបង្ហាញជាការបង្កើនភាគរយម៉ូល (MPE) ដូចដែលបានពិពណ៌នាពីមុន (42)។
គ្រាប់ណឺរ៉ូនកកត្រូវបានធ្វើដូចគ្នានៅក្នុងមេតាណុល 80% ត្រជាក់ (v/v) បង្វិល ហើយភ្ញាស់នៅសីតុណ្ហភាព -20°C រយៈពេល 30 នាទី។ បង្វិលគំរូម្តងទៀត ហើយកូរនៅសីតុណ្ហភាព +4°C រយៈពេល 30 នាទី។ គំរូត្រូវបានបង្វិលក្នុងកម្លាំង 21,000 ក្រាម រយៈពេល 5 នាទីនៅសីតុណ្ហភាព 4°C ហើយបន្ទាប់មកសារធាតុរាវខាងលើត្រូវបានប្រមូល និងសម្ងួតដោយប្រើម៉ាស៊ីនប្រមូលផ្តុំ SpeedVac នៅសីតុណ្ហភាព 25°C សម្រាប់ការវិភាគជាបន្តបន្ទាប់។ ដូចដែលបានពិពណ៌នាខាងលើ ការវិភាគ LC-MS ត្រូវបានអនុវត្តលើអាស៊ីតអាមីណូនៃកោសិកាដែលបានតម្រៀប។ ដោយប្រើ TraceFinder (កំណែ 4.2, Thermo Fisher Scientific) ការវិភាគទិន្នន័យត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើម៉ាស់ម៉ូណូអ៊ីសូតូបនៃសមាសធាតុនីមួយៗ។ ការធ្វើឱ្យមានលក្ខណៈធម្មតានៃទិន្នន័យមេតាបូលីតត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើកញ្ចប់កម្មវិធី preprocessCore (57)។
ការរៀបចំចំណិត។ កណ្ដុរត្រូវបានចាក់ថ្នាំស្ពឹកយ៉ាងរហ័សជាមួយនឹងកាបូនឌីអុកស៊ីត ហើយត្រូវបានកាត់ក្បាល ខួរក្បាលត្រូវបានយកចេញពីលលាដ៍ក្បាលយ៉ាងរហ័ស ហើយកាំបិតរំញ័រដែលពោរពេញដោយទឹកកក (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, ប្រទេសអាល្លឺម៉ង់) ត្រូវបានប្រើដើម្បីកាត់វាជាផ្នែក sagittal ទំហំ 300 ទៅ 375 μm។ ឧស្ម័នកាបូនត្រជាក់ (95% O2 និង 5% CO2) Ca2 + ACSF ទាប (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM សូដ្យូមផូស្វាតសារធាតុរាវ 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-គ្លុយកូស, 1.0 mM CaCl2 និង 6.0 mM MgCl2។ លៃតម្រូវ pH 7.4 និង 310 ទៅ 330 mOsm)។ ផ្ទេរចំណិតខួរក្បាលដែលទទួលបានទៅបន្ទប់ដែលមាន Ca2 + ACSF ខ្ពស់ជាង (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM សូដ្យូមផូស្វាតសារធាតុរាវ, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-គ្លុយកូស, 4.0 mM CaCl2 និង mM 3.5 MgCl2) pH 7.4 និង 310 ទៅ 320 mOsm)។ រក្សាទុកចំណិតរយៈពេល 20 ទៅ 30 នាទី ដើម្បីឱ្យពួកវាអាចត្រូវបានស្ដារឡើងវិញមុនពេលកត់ត្រា។
ការថតសំឡេង។ ឆាកមីក្រូទស្សន៍ដែលបំពាក់ដោយបន្ទប់ថតសំឡេងថេរ និងកែវថតគោលបំណងជ្រមុជទឹក 20x (Scientifica) ត្រូវបានប្រើសម្រាប់ការថតសំឡេងទាំងអស់។ កោសិកា Purkinje ដែលអាចសន្មតបានត្រូវបានកំណត់អត្តសញ្ញាណដោយ (i) ទំហំរាងកាយ (ii) ទីតាំងកាយវិភាគសាស្ត្រនៃខួរក្បាលតូច និង (iii) ការបញ្ចេញមតិនៃហ្សែនរាយការណ៍ fluorescent mtYFP ។ បំពង់បំណះដែលមានភាពធន់នៃចុងពី 5 ទៅ 11 megohms ត្រូវបានទាញចេញដោយបំពង់ capillary កញ្ចក់ borosilicate (GB150-10, 0.86 mm × 1.5 mm × 100 mm, Science Products, Hofheim, អាល្លឺម៉ង់) និងបំពង់បំណះផ្ដេក Instruments (P-1000, Sutter), Novato, CA)។ ការថតសំឡេងទាំងអស់ត្រូវបានអនុវត្តដោយ ELC-03XS npi patch clamp amplifier (npi electronic GmbH, Tam, អាល្លឺម៉ង់) ដែលត្រូវបានគ្រប់គ្រងដោយកម្មវិធី Signal (កំណែ 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, ចក្រភពអង់គ្លេស)។ ការពិសោធន៍ត្រូវបានកត់ត្រាក្នុងអត្រាគំរូ 12.5 kHz។ សញ្ញាត្រូវបានត្រងដោយតម្រង Bessel ឆ្លងកាត់ខ្លីពីរដែលមានប្រេកង់កាត់ផ្តាច់ 1.3 និង 10 kHz រៀងៗខ្លួន។ សមត្ថភាពនៃភ្នាស និងបំពង់កែវត្រូវបានផ្តល់សំណងដោយសៀគ្វីផ្តល់សំណងដោយប្រើឧបករណ៍ពង្រីកសំឡេង។ ការពិសោធន៍ទាំងអស់ត្រូវបានអនុវត្តក្រោមការគ្រប់គ្រងរបស់កាមេរ៉ា Orca-Flash 4.0 (Hamamatsu, Gerden, អាល្លឺម៉ង់) ដែលត្រូវបានគ្រប់គ្រងដោយកម្មវិធី Hokawo (កំណែ 2.8, Hamamatsu, Gerden, អាល្លឺម៉ង់)។
ការកំណត់រចនាសម្ព័ន្ធ និងការវិភាគកោសិកាទាំងមូលជាប្រចាំ។ មុនពេលកត់ត្រាភ្លាមៗ សូមបំពេញបំពង់បឺតជាមួយនឹងដំណោះស្រាយខាងក្នុងដែលមានសារធាតុដូចខាងក្រោម៖ 4.0 mM KCl, 2.0 mM NaCl, 0.2 mM EGTA, 135.0 mM ប៉ូតាស្យូមគ្លូកូណាត, 10.0 mM Hepes, 4.0 mM ATP (Mg), 0.5 mM Guanosine triphosphate (GTP) (Na) និង 10.0 mM creatinine phosphate ត្រូវបានកែតម្រូវទៅ pH 7.25 ហើយសម្ពាធអូស្មូទិកគឺ 290 mOsm (sucrose)។ ភ្លាមៗបន្ទាប់ពីប្រើកម្លាំង 0 pA ដើម្បីបំបែកភ្នាស សក្តានុពលភ្នាសសម្រាកត្រូវបានវាស់។ ភាពធន់នៃធាតុចូលត្រូវបានវាស់ដោយការអនុវត្តចរន្តអ៊ីពែរប៉ូឡារីសនៃ -40, -30, -20, និង -10 pA។ វាស់ទំហំនៃការឆ្លើយតបវ៉ុល ហើយប្រើច្បាប់អូមដើម្បីគណនាភាពធន់នៃធាតុចូល។ សកម្មភាពដោយឯកឯងត្រូវបានកត់ត្រានៅក្នុងឧបករណ៍ក្តាប់វ៉ុលរយៈពេល 5 នាទី ហើយ sPSC ត្រូវបានកំណត់អត្តសញ្ញាណ និងវាស់វែងនៅក្នុង Igor Pro (កំណែ 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, សហរដ្ឋអាមេរិក) ដោយប្រើស្គ្រីបសម្គាល់ពាក់កណ្តាលស្វ័យប្រវត្តិ។ ខ្សែកោង IV និងចរន្តស្ថានភាពស្ថិរភាពត្រូវបានវាស់ដោយការក្តាប់ថ្មនៅសក្តានុពលផ្សេងៗគ្នា (ចាប់ផ្តើមពី -110 mV) និងបង្កើនវ៉ុលក្នុងជំហាន 5 mV។ ការផលិត AP ត្រូវបានសាកល្បងដោយអនុវត្តចរន្តឌីប៉ូឡារីស។ ក្តាប់ក្រឡានៅ -70 mV ខណៈពេលកំពុងអនុវត្តជីពចរចរន្តឌីប៉ូឡារីស។ កែតម្រូវទំហំជំហាននៃឯកតាថតនីមួយៗដោយឡែកពីគ្នា (10 ដល់ 60 pA)។ គណនាប្រេកង់ AP អតិបរមាដោយរាប់ដោយដៃនូវការកើនឡើងនៃជីពចរដែលបណ្តាលឱ្យមានប្រេកង់ AP ខ្ពស់បំផុត។ កម្រិត AP ត្រូវបានវិភាគដោយប្រើដេរីវេទីពីរនៃជីពចរឌីប៉ូឡារីសដែលដំបូងឡើយបង្កឱ្យមាន AP មួយ ឬច្រើន។
ការកំណត់រចនាសម្ព័ន្ធ និងការវិភាគបំណះដែលមានរន្ធ។ អនុវត្តការកត់ត្រាបំណះដែលមានរន្ធដោយប្រើពិធីការស្តង់ដារ។ ប្រើបំពង់បឺតដែលគ្មាន ATP និង GTP ដែលមិនមានគ្រឿងផ្សំដូចខាងក្រោម៖ 128 mM gluconate K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0.1 mM EGTA និង 2 mM MgCl2 ហើយកែសម្រួលទៅ pH 7.2 (ដោយប្រើ KOH)។ ATP និង GTP ត្រូវបានលុបចេញពីដំណោះស្រាយក្នុងកោសិកា ដើម្បីការពារភាពជ្រាបចូលដែលមិនអាចគ្រប់គ្រងបាននៃភ្នាសកោសិកា។ បំពង់បឺតត្រូវបានបំពេញដោយដំណោះស្រាយខាងក្នុងដែលមានផ្ទុក amphotericin (ប្រហែល 200 ទៅ 250μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) ដើម្បីទទួលបានកំណត់ត្រាបំណះដែលមានរន្ធ។ Amphotericin ត្រូវបានរំលាយក្នុង dimethyl sulfoxide (កំហាប់ចុងក្រោយ៖ 0.1 ទៅ 0.3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich)។ កំហាប់នៃ DMSO ដែលបានប្រើមិនមានឥទ្ធិពលគួរឱ្យកត់សម្គាល់លើណឺរ៉ូនដែលបានសិក្សានោះទេ។ ក្នុងអំឡុងពេលដំណើរការដាល់ ភាពធន់នៃឆានែល (Ra) ត្រូវបានត្រួតពិនិត្យជាបន្តបន្ទាប់ ហើយការពិសោធន៍ត្រូវបានចាប់ផ្តើមបន្ទាប់ពីទំហំនៃ Ra និង AP មានស្ថេរភាព (20-40 នាទី)។ សកម្មភាពដោយឯកឯងត្រូវបានវាស់នៅក្នុងឧបករណ៍គៀបវ៉ុល និង/ឬចរន្តរយៈពេល 2 ទៅ 5 នាទី។ ការវិភាគទិន្នន័យត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើ Igor Pro (កំណែ 7.05.2, WaveMetrics, USA), Excel (កំណែ 2010, Microsoft Corporation, Redmond, USA) និង GraphPad Prism (កំណែ 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA)។ សហរដ្ឋអាមេរិក)។ ដើម្បីកំណត់អត្តសញ្ញាណ AP ដោយឯកឯង កម្មវិធីជំនួយ NeuroMatic v3.0c របស់ IgorPro ត្រូវបានប្រើប្រាស់។ កំណត់អត្តសញ្ញាណ AP ដោយស្វ័យប្រវត្តិដោយប្រើកម្រិតដែលបានផ្តល់ឱ្យ ដែលត្រូវបានកែតម្រូវជាលក្ខណៈបុគ្គលសម្រាប់កំណត់ត្រានីមួយៗ។ ដោយប្រើចន្លោះពេលកើនឡើង សូមកំណត់ប្រេកង់កើនឡើងជាមួយនឹងប្រេកង់កើនឡើងភ្លាមៗអតិបរមា និងប្រេកង់កើនឡើងជាមធ្យម។
ការញែក PN។ តាមរយៈការសម្របខ្លួនទៅនឹងពិធីការដែលបានបោះពុម្ពផ្សាយពីមុន PNs ត្រូវបានបន្សុទ្ធចេញពីខួរក្បាលតូចកណ្ដុរនៅដំណាក់កាលជាក់លាក់មួយ (58)។ សរុបមក ខួរក្បាលតូចត្រូវបានវះកាត់ និងកិនក្នុងឧបករណ៍បំបែកត្រជាក់ [ដោយគ្មាន HBSS Ca2+ និង Mg2+ បន្ថែមដោយគ្លុយកូស 20 mM ប៉េនីស៊ីលីន (50 U/ml) និងស្ទ្រីបតូម៉ៃស៊ីន (0.05 mg/ml)] ហើយបន្ទាប់មករំលាយឧបករណ៍នៅក្នុង papain [HBSS បន្ថែមដោយ 1-cysteine·HCl (1 mg/ml) ប៉ាប៉ាន (16 U/ml) និង deoxyribonuclease I (DNase I; 0.1 mg/ml)] ព្យាបាលរយៈពេល 30 នាទីនៅសីតុណ្ហភាព 30°C។ ដំបូងលាងសម្អាតជាលិកាក្នុងឧបករណ៍ផ្ទុក HBSS ដែលមានទឹករំអិលស៊ុត (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) និង DNase (0.1 mg/ml) នៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់ ដើម្បីការពារការរំលាយដោយអង់ស៊ីម ហើយបន្ទាប់មកក្នុងឧបករណ៍ផ្ទុក HBSS ដែលមានជាតិស្ករ 20 mM កិនថ្នមៗក្នុង HBSS, penicillin (50 U/ml), streptomycin (0.05 mg/ml) និង DNase (0.1 mg/ml) ដើម្បីបញ្ចេញកោសិកាតែមួយ។ សារធាតុចម្រោះកោសិកាលទ្ធផលត្រូវបានច្រោះតាមរយៈតម្រងកោសិកាទំហំ 70μm បន្ទាប់មកកោសិកាត្រូវបានកិនជាដុំៗដោយការបង្វិល (1110 rpm, 5 នាទី, 4°C) ហើយរលាយឡើងវិញក្នុងឧបករណ៍តម្រៀប [HBSS បន្ថែមជាមួយជាតិស្ករ 20 mM, 20% នៃគោក្របី) សេរ៉ូម, penicillin (50 U/ml) និង streptomycin (0.05 mg/ml)]; វាយតម្លៃលទ្ធភាពរស់រានរបស់កោសិកាជាមួយ propidium iodide ហើយកែតម្រូវដង់ស៊ីតេកោសិកាទៅ 1 × 106 ទៅ 2 × 106 កោសិកា/ml។ មុនពេលធ្វើការវិភាគលំហូរស៊ីតូម៉ែត្រី សារធាតុផ្សំត្រូវបានត្រងតាមរយៈតម្រងកោសិកាទំហំ 50 μm។
ឧបករណ៍វាស់លំហូរកោសិកា។ ការតម្រៀបកោសិកាត្រូវបានអនុវត្តនៅសីតុណ្ហភាព 4°C ដោយប្រើម៉ាស៊ីន FACSAria III (BD Biosciences) និងកម្មវិធី FACSDiva (BD Biosciences, កំណែ 8.0.1)។ ការព្យួរកោសិកាត្រូវបានតម្រៀបដោយប្រើក្បាលបាញ់ 100 μm ក្រោមសម្ពាធ 20 psi ក្នុងអត្រា ~2800 ព្រឹត្តិការណ៍/វិនាទី។ ដោយសារលក្ខណៈវិនិច្ឆ័យច្រកទ្វារបែបប្រពៃណី (ទំហំកោសិកា ការរើសអើងទ្វេភាគី និងលក្ខណៈនៃការខ្ចាត់ខ្ចាយ) មិនអាចធានាបាននូវភាពឯកោត្រឹមត្រូវនៃ PN ពីប្រភេទកោសិកាផ្សេងទៀត យុទ្ធសាស្ត្រច្រកទ្វារត្រូវបានកំណត់ដោយផ្អែកលើការប្រៀបធៀបដោយផ្ទាល់នៃអាំងតង់ស៊ីតេ YFP និងអូតូហ្វ្លុយអូរីសសិននៅក្នុង mitoYFP+ ​​និងកណ្តុរ mitoYFP − ត្រួតពិនិត្យ។ YFP ត្រូវបានរំភើបដោយការបំភ្លឺគំរូជាមួយនឹងខ្សែឡាស៊ែរ 488 nm ហើយសញ្ញាត្រូវបានរកឃើញដោយប្រើតម្រងឆ្លងកាត់ក្រុម 530/30 nm។ នៅក្នុងកណ្តុរ mitoYFP+ ​​កម្លាំងដែលទាក់ទងនៃហ្សែនអ្នករាយការណ៍ Rosa26-mitoYFP ក៏ត្រូវបានប្រើដើម្បីសម្គាល់បំណែករាងកាយណឺរ៉ូន និងបំណែកអ័ក្សផងដែរ។ 7-AAD ត្រូវបានរំភើបដោយឡាស៊ែរពណ៌លឿង 561 nm ហើយត្រូវបានរកឃើញដោយតម្រង bandpass 675/20 nm ដើម្បីដកកោសិកាងាប់ចេញ។ ដើម្បីញែក astrocytes ក្នុងពេលតែមួយ ស្រទាប់កោសិកាត្រូវបានប្រឡាក់ដោយ ACSA-2-APC បន្ទាប់មកគំរូត្រូវបានបញ្ចេញកាំរស្មីដោយខ្សែឡាស៊ែរ 640 nm ហើយតម្រង bandpass 660/20 nm ត្រូវបានប្រើដើម្បីរកឃើញសញ្ញា។
កោសិកាដែលប្រមូលបានត្រូវបានកិនជាដុំៗដោយការបង្វិលកណ្តាល (1110 rpm, 5 នាទី, 4°C) ហើយរក្សាទុកនៅសីតុណ្ហភាព -80°C រហូតដល់ការប្រើប្រាស់។ កណ្ដុរ Mfn2cKO និងកូនកណ្ដុររបស់វាត្រូវបានចាត់ថ្នាក់នៅថ្ងៃតែមួយដើម្បីកាត់បន្ថយភាពប្រែប្រួលនៃនីតិវិធី។ ការបង្ហាញ និងការវិភាគទិន្នន័យ FACS ត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើកម្មវិធី FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, USA)។
ដូចដែលបានរៀបរាប់ខាងលើ (59) វិធីសាស្ត្រ PCR ពេលវេលាជាក់ស្តែងត្រូវបានប្រើដើម្បីញែក DNA ពីណឺរ៉ូនដែលបានតម្រៀបសម្រាប់ការវាស់បរិមាណ mtDNA ជាបន្តបន្ទាប់។ ភាពរសើបលីនេអ៊ែរ និងភាពប្រែប្រួលនៃកម្រិតត្រូវបានសាកល្បងដំបូងដោយការដំណើរការ qPCR លើចំនួនកោសិកាផ្សេងៗគ្នា។ សរុបមក ប្រមូល PN ចំនួន 300 នៅក្នុងសារធាតុ lysis buffer ដែលមាន 50 mM tris-HCl (pH 8.5), 1 mM EDTA, 0.5% Tween 20 និង proteinase K (200 ng/ml) ហើយភ្ញាស់នៅសីតុណ្ហភាព 55°C រយៈពេល 120 នាទី។ កោសិកាត្រូវបានភ្ញាស់បន្ថែមទៀតនៅសីតុណ្ហភាព 95°C រយៈពេល 10 នាទី ដើម្បីធានាបាននូវការធ្វើឱ្យសកម្មពេញលេញនៃ proteinase K។ ដោយប្រើឧបករណ៍ចាប់សញ្ញា TaqMan (Thermo Fisher) ជាក់លាក់ចំពោះ mt-Nd1 mtDNA ត្រូវបានវាស់ដោយ PCR ពាក់កណ្តាលបរិមាណនៅក្នុងប្រព័ន្ធ PCR ពេលវេលាជាក់ស្តែង 7900HT (Thermo Fisher Scientific)។ ហ្សែនវិទ្យាសាស្ត្រ លេខកាតាឡុក Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific លេខកាតាឡុក AIVI3E8) និង 18S (Thermo Fisher Scientific លេខកាតាឡុក Hs99999901_s1)។
ការរៀបចំគំរូប្រូតេអូម។ ដោយការកំដៅដំណោះស្រាយនៅសីតុណ្ហភាព 95°C រយៈពេល 10 នាទី ហើយបង្កើតជាសំឡេង នៅក្នុងសារធាតុរំលាយ [6 M guanidine chloride, 10 mM tris(2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride, 10 mM chloroacetamide និង 100 mM tris-Lyse frozen neuron pellets ក្នុង HCl]។ លើ Bioruptor (Diagenode) រយៈពេល 10 នាទី (30 វិនាទីជីពចរ / 30 វិនាទីផ្អាក)។ គំរូត្រូវបានពនលាយ 1:10 ក្នុង 20 mM tris-HCl (pH 8.0) លាយជាមួយ 300 ng trypsin gold (Promega) ហើយភ្ញាស់ពេញមួយយប់នៅសីតុណ្ហភាព 37°C ដើម្បីសម្រេចបានការរំលាយពេញលេញ។ នៅថ្ងៃទីពីរ គំរូត្រូវបានបង្វិលក្នុងល្បឿន 20,000 g រយៈពេល 20 នាទី។ សារធាតុរាវខាងលើត្រូវបានពនលាយជាមួយអាស៊ីត formic 0.1% ហើយដំណោះស្រាយត្រូវបានបន្សាបជាតិប្រៃជាមួយ StageTips ដែលផលិតដោយខ្លួនឯង។ គំរូនេះត្រូវបានសម្ងួតនៅក្នុងឧបករណ៍ SpeedVac (ឧបករណ៍ប្រមូលផ្តុំ Eppendorf បូក 5305) នៅសីតុណ្ហភាព 45°C ហើយបន្ទាប់មក peptide ត្រូវបានផ្អាកក្នុងអាស៊ីត formic 0.1%។ គំរូទាំងអស់ត្រូវបានរៀបចំក្នុងពេលដំណាលគ្នាដោយមនុស្សដូចគ្នា។ ដើម្បីវិភាគគំរូ astrocyte peptides ដែលត្រូវបានបន្សាបជាតិប្រៃ 4 μg ត្រូវបានដាក់ស្លាកជាមួយស្លាក tandem mass (TMT10plex លេខកាតាឡុក 90110 Thermo Fisher Scientific) ជាមួយនឹងសមាមាត្រ peptide ទៅនឹងសារធាតុប្រតិកម្ម TMT 1:20។ សម្រាប់ការបិទស្លាក TMT សារធាតុប្រតិកម្ម TMT 0.8 mg ត្រូវបានផ្អាកឡើងវិញនៅក្នុង ACN anhydrous 70 μl ហើយ peptide ស្ងួតត្រូវបានបង្កើតឡើងឡើងវិញទៅជា 9 μl នៃ 0.1 M TEAB (triethylammonium bicarbonate) ដែលក្នុងនោះ 7 μl នៃសារធាតុប្រតិកម្ម TMT នៅក្នុង ACN ត្រូវបានបន្ថែម។ កំហាប់គឺ 43.75%។ បន្ទាប់ពីការភ្ញាស់ 60 នាទី ប្រតិកម្មត្រូវបានពន្លត់ដោយ hydroxylamine 5% 2 μl។ ប៉ិបទីតដែលមានស្លាកត្រូវបានប្រមូល សម្ងួត រំលាយឡើងវិញក្នុងអាស៊ីតហ្វមីក (FA) 0.1% ចំនួន 200μl ចែកជាពីរ ហើយបន្ទាប់មកយកអំបិលចេញដោយប្រើ StageTips ដែលផលិតដោយខ្លួនឯង។ ដោយប្រើក្រូម៉ាតូក្រាហ្វីរាវដំណើរការខ្ពស់ UltiMate 3000 (ក្រូម៉ាតូក្រាហ្វីរាវដំណើរការខ្ពស់ UltiMate 3000) ពាក់កណ្តាលមួយក្នុងចំណោមពីរត្រូវបានបំបែកនៅលើជួរឈរក្រូម៉ាតូក្រាហ្វី Acquity ទំហំ 1mm x 150mm ដែលពោរពេញទៅដោយភាគល្អិត C18 130Å1.7μm (Waters លេខកាតាឡុក SKU: 186006935)។ Thermo Fisher Scientific)។ ញែកប៉ិបទីតក្នុងអត្រាលំហូរ 30μl/នាទី បំបែកពីសតិបណ្ដោះអាសន្ន B 1% ទៅ 50% រយៈពេល 85 នាទីជាមួយនឹងជម្រាលជាជំហានៗ 96 នាទី ពីសតិបណ្ដោះអាសន្ន B 50% ទៅ 95% រយៈពេល 3 នាទី បន្ទាប់មក 8 នាទីសម្រាប់សតិបណ្ដោះអាសន្ន B 95%; សារធាតុ​រក្សា​សំណើម A មាន 5% ACN និង 10 mM អាម៉ូញ៉ូមប៊ីកាបូណាត (ABC) ហើយសារធាតុ​រក្សា​សំណើម B មាន 80% ACN និង 10 mM ABC។ ប្រមូល​ប្រភាគ​រៀងរាល់ 3 នាទី​ម្តង ហើយ​ផ្សំ​វា​ជា​ពីរ​ក្រុម (1 + 17, 2 + 18 ។ល។) ហើយ​សម្ងួត​វា​ក្នុង​ម៉ាស៊ីន​បង្វិល​ដោយ​ប្រើ​ម៉ាស៊ីន​បូម​ខ្យល់។
ការវិភាគ LC-MS/MS។ សម្រាប់​វិសាលគម​ម៉ាស់ ប៉ិបទីត (លេខ r119.aq) ត្រូវបានបំបែកនៅលើជួរឈរវិភាគ PicoFrit ទំហំ 25 សង់ទីម៉ែត្រ 75 μm អង្កត់ផ្ចិតខាងក្នុង (កែវថតថ្មី លេខផ្នែក PF7508250) បំពាក់ដោយឧបករណ៍ផ្ទុក ReproSil-Pur 120 C18-AQ ទំហំ 1.9 μm (លោកវេជ្ជបណ្ឌិត Maisch, mat) ប្រើ EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, អាល្លឺម៉ង់)។ ជួរឈរត្រូវបានរក្សានៅសីតុណ្ហភាព 50°C។ សារធាតុ​រក្សា​សំណើម A និង B មានអាស៊ីតហ្វមិក 0.1% ក្នុងទឹក និងអាស៊ីតហ្វមិក 0.1% ក្នុង ACN 80% រៀងគ្នា។ ប៉ិបទីតត្រូវបានបំបែកពីសារធាតុ​រក្សា​សំណើម B ដែលមានកំហាប់ 6% ទៅ 31% រយៈពេល 65 នាទី និងពីសារធាតុ​រក្សា​សំណើម B ដែលមានកំហាប់ 31% ទៅ 50% រយៈពេល 5 នាទី ជាមួយនឹងជម្រាល 200 nl/នាទី។ ប៉ិបទីតដែលត្រូវបានចម្រាញ់ត្រូវបានវិភាគនៅលើវិសាលគមម៉ាស់ Orbitrap Fusion (Thermo Fisher Scientific)។ ការវាស់វែងសារធាតុបឋម peptide m/z ត្រូវបានអនុវត្តជាមួយនឹងគុណភាពបង្ហាញ 120,000 ក្នុងចន្លោះពី 350 ទៅ 1500 m/z។ ដោយប្រើថាមពលប៉ះទង្គិចធម្មតា 27% សារធាតុបឋមខ្លាំងបំផុតដែលមានស្ថានភាពសាកពី 2 ទៅ 6 ត្រូវបានជ្រើសរើសសម្រាប់ការបំបែកអន្ទាក់ C ថាមពលខ្ពស់ (HCD)។ ពេលវេលាវដ្តត្រូវបានកំណត់ទៅ 1 វិនាទី។ តម្លៃ m/z នៃបំណែក peptide ត្រូវបានវាស់នៅក្នុងអន្ទាក់អ៊ីយ៉ុងដោយប្រើគោលដៅ AGC តូចបំផុត 5×104 និងពេលវេលាចាក់អតិបរមា 86 ms។ បន្ទាប់ពីការបំបែក សារធាតុបឋមត្រូវបានដាក់ក្នុងបញ្ជីដកចេញថាមវន្តរយៈពេល 45 វិនាទី។ ប៉ិបទីតដែលមានស្លាក TMT ត្រូវបានបំបែកនៅលើជួរឈរ Acclaim PepMap ទំហំ 50 សង់ទីម៉ែត្រ 75 μm (Thermo Fisher Scientific លេខកាតាឡុក 164942) ហើយវិសាលគមនៃការធ្វើចំណាកស្រុកត្រូវបានវិភាគលើវិសាលគមម៉ាស់ Orbitrap Lumos Tribrid (Thermo Fisher Scientific) ដែលបំពាក់ដោយឧបករណ៍អ៊ីយ៉ុងរលកទម្រង់អសមមាត្រវាលខ្ពស់ (FAIMS) (Thermo Fisher Scientific) ដំណើរការនៅវ៉ុលសំណងពីរគឺ −50 និង −70 V។ MS3 ដែលបានជ្រើសរើសដោយផ្អែកលើបុព្វបទធ្វើសមកាលកម្មត្រូវបានប្រើសម្រាប់ការវាស់សញ្ញាអ៊ីយ៉ុងរបាយការណ៍ TMT។ ការបំបែកប៉ិបទីតត្រូវបានអនុវត្តនៅលើ EASY-nLC 1200 ដោយប្រើការរំលាយជម្រាលលីនេអ៊ែរ 90% ជាមួយនឹងកំហាប់សតិបណ្ដោះអាសន្នពី 6% ទៅ 31%; សតិបណ្ដោះអាសន្ន A គឺ 0.1% FA និងសតិបណ្ដោះអាសន្ន B គឺ 0.1% FA និង 80% ACN។ ជួរឈរវិភាគត្រូវបានដំណើរការនៅសីតុណ្ហភាព 50°C។ ប្រើ FreeStyle (កំណែ 1.6, Thermo Fisher Scientific) ដើម្បីបំបែកឯកសារដើមតាមវ៉ុលសំណង FAIMS។
ការកំណត់អត្តសញ្ញាណ និងការវាស់បរិមាណប្រូតេអ៊ីន។ ដោយប្រើម៉ាស៊ីនស្វែងរក Andromeda ដែលរួមបញ្ចូលគ្នា ទិន្នន័យដើមត្រូវបានវិភាគដោយប្រើ MaxQuant កំណែ 1.5.2.8 (https://maxquant.org/)។ បន្ថែមពីលើលំដាប់ Cre recombinase និង YFP ដែលទទួលបានពី Aequorea victoria វិសាលគមបំណែក peptide ត្រូវបានស្វែងរកសម្រាប់លំដាប់ canonical និងលំដាប់ isoform នៃ proteome ឯកសារយោងកណ្ដុរ (Proteome ID UP000000589 ទាញយកពី UniProt ក្នុងខែឧសភា ឆ្នាំ 2017)។ អុកស៊ីតកម្ម Methionine និង acetylation ប្រូតេអ៊ីន N-terminal ត្រូវបានកំណត់ជាការកែប្រែអថេរ; methylation cysteine ​​​​carbamoyl ត្រូវបានកំណត់ជាការកែប្រែថេរ។ ប៉ារ៉ាម៉ែត្ររំលាយអាហារត្រូវបានកំណត់ទៅ "specificity" និង "trypsin/P"។ ចំនួនអប្បបរមានៃ peptides និង peptides razor ដែលប្រើសម្រាប់ការកំណត់អត្តសញ្ញាណប្រូតេអ៊ីនគឺ 1; ចំនួនអប្បបរមានៃ peptides តែមួយគត់គឺ 0។ ក្រោមលក្ខខណ្ឌនៃការផ្គូផ្គងផែនទី peptide អត្រាកំណត់អត្តសញ្ញាណប្រូតេអ៊ីនគឺ 0.01។ ជម្រើស "Second Peptide" ត្រូវបានបើក។ ប្រើជម្រើស "ផ្គូផ្គងរវាងការដំណើរការ" ដើម្បីផ្ទេរការកំណត់អត្តសញ្ញាណដោយជោគជ័យរវាងឯកសារដើមផ្សេងៗគ្នា។ ប្រើចំនួនសមាមាត្រអប្បបរមា LFQ 1 សម្រាប់ការវាស់បរិមាណដោយគ្មានស្លាក (LFQ) (60)។ អាំងតង់ស៊ីតេ LFQ ត្រូវបានត្រងសម្រាប់តម្លៃដែលមានសុពលភាពយ៉ាងហោចណាស់ពីរនៅក្នុងក្រុមហ្សែនយ៉ាងហោចណាស់មួយនៅចំណុចពេលវេលានីមួយៗ ហើយត្រូវបានពង្រីកពីការចែកចាយធម្មតាដែលមានទទឹង 0.3 ហើយផ្លាស់ទីចុះក្រោម 1.8។ ប្រើវេទិកាកុំព្យូទ័រ Perseus (https://maxquant.net/perseus/) និង R (https://r-project.org/) ដើម្បីវិភាគលទ្ធផល LFQ។ ការធ្វើតេស្ត t មធ្យមទ្វេផ្លូវពីកញ្ចប់កម្មវិធី limma ត្រូវបានប្រើសម្រាប់ការវិភាគកន្សោមឌីផេរ៉ង់ស្យែល (61)។ ការវិភាគទិន្នន័យរុករកត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើ ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally និង pheatmap។ ទិន្នន័យប្រូតេអូមិកដែលមានមូលដ្ឋានលើ TMT ត្រូវបានវិភាគដោយប្រើ MaxQuant កំណែ 1.6.10.43។ ស្វែងរកទិន្នន័យប្រូតេអូមិចឆៅពីមូលដ្ឋានទិន្នន័យប្រូតេអូមិចរបស់មនុស្សរបស់ UniProt ដែលត្រូវបានទាញយកនៅក្នុងខែកញ្ញា ឆ្នាំ 2018។ ការវិភាគនេះរួមបញ្ចូលទាំងកត្តាកែតម្រូវភាពបរិសុទ្ធអ៊ីសូតូបដែលផ្តល់ដោយក្រុមហ៊ុនផលិត។ ប្រើ limma ក្នុង R សម្រាប់ការវិភាគការបញ្ចេញមតិឌីផេរ៉ង់ស្យែល។ ទិន្នន័យដើម លទ្ធផលស្វែងរកមូលដ្ឋានទិន្នន័យ និងលំហូរការងារវិភាគទិន្នន័យ និងលទ្ធផលទាំងអស់ត្រូវបានរក្សាទុកនៅក្នុងសម្ព័ន្ធភាព ProteomeXchange តាមរយៈឃ្លាំងដៃគូ PRIDE ជាមួយនឹងឧបករណ៍កំណត់អត្តសញ្ញាណសំណុំទិន្នន័យ PXD019690។
ចំណារពន្យល់មុខងារបង្កើនប្រសិទ្ធភាពការវិភាគ។ ឧបករណ៍ Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) ត្រូវបានប្រើដើម្បីកំណត់ភាពសម្បូរបែបនៃពាក្យចំណារពន្យល់មុខងារនៃសំណុំទិន្នន័យនៅ 8 សប្តាហ៍ (រូបភាពទី 1)។ សរុបមក បញ្ជីប្រូតេអ៊ីនបរិមាណដែលទទួលបានពីការវិភាគទិន្នន័យ LC-MS/MS (tandem mass spectrometry) ត្រូវបានប្រើជាមួយនឹងលក្ខណៈវិនិច្ឆ័យតម្រងដូចខាងក្រោម៖ Mus musculus ត្រូវបានជ្រើសរើសជាប្រភេទសត្វ និងផ្ទៃខាងក្រោយ ហើយប្រភេទបង្ហាញតម្លៃ P ដែលកែតម្រូវដោយ Benjamini សម្រាប់ការបង្កើនប្រសិទ្ធភាព 0.05 ឬទាបជាងនេះត្រូវបានចាត់ទុកថាសំខាន់។ សម្រាប់ក្រាហ្វនេះ ប្រភេទលើសកំពូលទាំងប្រាំនៅក្នុងចង្កោមនីមួយៗដោយផ្អែកលើតម្លៃ P ដែលបានកែតម្រូវត្រូវបានបង្ហាញ។ ដោយប្រើការធ្វើតេស្ត t ច្រើន ដោយប្រើកម្មវិធីជំរុញលីនេអ៊ែរពីរដំណាក់កាលនៃ Benjamini, Krieger និង Yekutieli (Q = 5%) ការវិភាគការបញ្ចេញមតិប្រូតេអ៊ីនតាមពេលវេលាត្រូវបានអនុវត្តលើបេក្ខជនសំខាន់ៗដែលត្រូវបានកំណត់នៅក្នុងប្រភេទនីមួយៗ ហើយជួរនីមួយៗត្រូវបានវិភាគដោយឡែកពីគ្នា។ មិនចាំបាច់ទទួលយក SD ដែលស៊ីសង្វាក់គ្នាទេ។
ដើម្បីប្រៀបធៀបលទ្ធផលនៃការសិក្សានេះជាមួយមូលដ្ឋានទិន្នន័យដែលបានបោះពុម្ពផ្សាយ និងបង្កើតដ្យាក្រាម Venn នៅក្នុងរូបភាពទី 1 យើងបានបញ្ចូលបញ្ជីប្រូតេអ៊ីនបរិមាណជាមួយនឹងចំណារពន្យល់ MitoCarta 2.0 (24)។ ប្រើឧបករណ៍អនឡាញ Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) ដើម្បីបង្កើតដ្យាក្រាម។
សម្រាប់ព័ត៌មានលម្អិតអំពីនីតិវិធីស្ថិតិដែលប្រើសម្រាប់ការវិភាគប្រូតេអូមិច សូមមើលផ្នែកដែលត្រូវគ្នានៃសម្ភារៈ និងវិធីសាស្ត្រ។ សម្រាប់ការពិសោធន៍ផ្សេងទៀតទាំងអស់ ព័ត៌មានលម្អិតអាចរកបាននៅក្នុងរឿងព្រេងដែលត្រូវគ្នា។ លុះត្រាតែមានការបញ្ជាក់ផ្សេងពីនេះ ទិន្នន័យទាំងអស់ត្រូវបានបង្ហាញជាមធ្យម ± SEM ហើយការវិភាគស្ថិតិទាំងអស់ត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើកម្មវិធី GraphPad Prism 8.1.2។
សម្រាប់​ឯកសារ​បន្ថែម​សម្រាប់​អត្ថបទ​នេះ សូម​មើល http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
នេះ​ជា​អត្ថបទ​សម្រាប់​ចូល​មើល​ដោយ​សេរី ដែល​ចែកចាយ​ក្រោម​លក្ខខណ្ឌ​នៃ​អាជ្ញាប័ណ្ណ Creative Commons Attribution-Non-Commercial ដែល​អនុញ្ញាត​ឱ្យ​ប្រើប្រាស់ ចែកចាយ និង​ផលិត​ឡើង​វិញ​ក្នុង​មធ្យោបាយ​ណាមួយ ដរាបណា​ការ​ប្រើប្រាស់​ចុងក្រោយ​មិនមែន​សម្រាប់​ផលប្រយោជន៍​ពាណិជ្ជកម្ម ហើយ​គោលការណ៍​គឺថា​ស្នាដៃ​ដើម​គឺ​ត្រឹមត្រូវ។ ជា​ឯកសារយោង។
ចំណាំ៖ យើងគ្រាន់តែស្នើសុំឱ្យអ្នកផ្តល់អាសយដ្ឋានអ៊ីមែលរបស់អ្នក ដើម្បីឱ្យមនុស្សដែលអ្នកណែនាំទៅកាន់ទំព័រដឹងថាអ្នកចង់ឱ្យពួកគេឃើញអ៊ីមែល ហើយវាមិនមែនជាសារឥតបានការទេ។ យើងនឹងមិនចាប់យកអាសយដ្ឋានអ៊ីមែលណាមួយឡើយ។
សំណួរនេះត្រូវបានប្រើដើម្បីសាកល្បងថាតើអ្នកជាអ្នកទស្សនា និងការពារការដាក់ស្នើសារឥតបានការដោយស្វ័យប្រវត្តិឬអត់។
ដោយ E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. ឡាសុន
ការវិភាគប្រូតេអូមិចនៃណឺរ៉ូនដែលមិនដំណើរការបានបង្ហាញថាកម្មវិធីមេតាបូលីសត្រូវបានធ្វើឱ្យសកម្មដើម្បីទប់ទល់នឹងការរលួយសរសៃប្រសាទ។
ដោយ E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. ឡាសុន
ការវិភាគប្រូតេអូមិចនៃណឺរ៉ូនដែលមិនដំណើរការបានបង្ហាញថាកម្មវិធីមេតាបូលីសត្រូវបានធ្វើឱ្យសកម្មដើម្បីទប់ទល់នឹងការរលួយសរសៃប្រសាទ។
© 2020 សមាគមអាមេរិចសម្រាប់ការជឿនលឿននៃវិទ្យាសាស្ត្រ។ រក្សាសិទ្ធិគ្រប់យ៉ាង។ AAAS គឺជាដៃគូរបស់ HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef និង CountER ។ ScienceAdvances ISSN 2375-2548 ។