អត្ថបទនេះគឺជាផ្នែកមួយនៃប្រធានបទស្រាវជ្រាវ “ការកែលម្អភាពធន់នៃសណ្តែកចំពោះភ្នាក់ងារបង្ករោគ និងសត្វល្អិត” មើលអត្ថបទទាំង ៥
ភ្នាក់ងារមូលហេតុនៃជំងឺផ្សិតរុក្ខជាតិ Necrosis Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary ប្រើយុទ្ធសាស្ត្រច្រើនកម្រិតដើម្បីឆ្លងដល់រុក្ខជាតិម្ចាស់ផ្ទះផ្សេងៗគ្នា។ ការសិក្សានេះស្នើឱ្យប្រើប្រាស់ diamine L-ornithine ដែលជាអាស៊ីតអាមីណូមិនមែនប្រូតេអ៊ីនដែលជំរុញការសំយោគអាស៊ីតអាមីណូសំខាន់ៗផ្សេងទៀត ជាយុទ្ធសាស្ត្រគ្រប់គ្រងជំនួសដើម្បីបង្កើនការឆ្លើយតបម៉ូលេគុល សរីរវិទ្យា និងជីវគីមីរបស់ Phaseolus vulgaris L. ចំពោះផ្សិតពណ៌សដែលបង្កឡើងដោយ Pseudomonas sclerotiorum។ ការពិសោធន៍នៅក្នុង vitro បានបង្ហាញថា L-ornithine បានរារាំងការលូតលាស់ mycelial របស់ S. pyrenoidosa យ៉ាងសំខាន់តាមរបៀបអាស្រ័យលើកម្រិតថ្នាំ។ លើសពីនេះ វាអាចកាត់បន្ថយភាពធ្ងន់ធ្ងរនៃផ្សិតពណ៌សយ៉ាងសំខាន់នៅក្រោមលក្ខខណ្ឌផ្ទះកញ្ចក់។ លើសពីនេះ L-ornithine បានជំរុញការលូតលាស់របស់រុក្ខជាតិដែលបានព្យាបាល ដែលបង្ហាញថាកំហាប់ដែលបានសាកល្បងនៃ L-ornithine មិនមានជាតិពុលរុក្ខជាតិចំពោះរុក្ខជាតិដែលបានព្យាបាលនោះទេ។ លើសពីនេះ L-ornithine បានបង្កើនការបញ្ចេញមតិនៃសារធាតុប្រឆាំងអុកស៊ីតកម្មមិនមែនអង់ស៊ីម (សារធាតុ phenolic និង flavonoids រលាយសរុប) និងសារធាតុប្រឆាំងអុកស៊ីតកម្មអង់ស៊ីម (catalase (CAT), peroxidase (POX), និង polyphenol oxidase (PPO)) និងបង្កើនការបញ្ចេញមតិនៃហ្សែនដែលទាក់ទងនឹងសារធាតុប្រឆាំងអុកស៊ីតកម្មចំនួនបី (PvCAT1, PvSOD, និង PvGR)។ លើសពីនេះ ការវិភាគក្នុងស៊ីលីកូបានបង្ហាញពីវត្តមាននៃប្រូតេអ៊ីន oxaloacetate acetylhydrolase (SsOAH) ដែលអាចសន្មតបាននៅក្នុងហ្សែន S. sclerotiorum ដែលមានលក្ខណៈស្រដៀងគ្នាខ្លាំងទៅនឹងប្រូតេអ៊ីន oxaloacetate acetylhydrolase (SsOAH) នៃ Aspergillus fijiensis (AfOAH) និង Penicillium sp. (PlOAH) ទាក់ទងនឹងការវិភាគមុខងារ ដែនអភិរក្ស និង topology។ គួរឱ្យចាប់អារម្មណ៍ ការបន្ថែម L-ornithine ទៅក្នុងទឹកស៊ុបដំឡូង dextrose (PDB) បានកាត់បន្ថយការបញ្ចេញមតិនៃហ្សែន SsOAH នៅក្នុងផ្សិត S. sclerotiorum យ៉ាងសំខាន់។ ស្រដៀងគ្នានេះដែរ ការប្រើប្រាស់ L-ornithine ពីខាងក្រៅបានកាត់បន្ថយការបញ្ចេញហ្សែន SsOAH យ៉ាងច្រើននៅក្នុងផ្សិត mycelia ដែលប្រមូលបានពីរុក្ខជាតិដែលបានព្យាបាល។ ជាចុងក្រោយ ការប្រើប្រាស់ L-ornithine បានកាត់បន្ថយការបញ្ចេញអាស៊ីត oxalic យ៉ាងច្រើននៅក្នុងឧបករណ៍ PDB និងស្លឹកដែលមានមេរោគ។ សរុបមក L-ornithine ដើរតួនាទីយ៉ាងសំខាន់ក្នុងការរក្សាស្ថានភាព redox ក៏ដូចជាបង្កើនការឆ្លើយតបការពាររបស់រុក្ខជាតិដែលមានមេរោគ។ លទ្ធផលនៃការសិក្សានេះអាចជួយក្នុងការអភិវឌ្ឍវិធីសាស្រ្តប្រកបដោយភាពច្នៃប្រឌិត និងមិនប៉ះពាល់ដល់បរិស្ថាន ដើម្បីគ្រប់គ្រងផ្សិតពណ៌ស និងកាត់បន្ថយផលប៉ះពាល់របស់វាទៅលើផលិតកម្មសណ្តែក និងដំណាំផ្សេងៗទៀត។
ផ្សិតពណ៌ស ដែលបណ្តាលមកពីផ្សិតរលួយកោសិកា Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary គឺជាជំងឺដ៏សាហាវមួយប្រភេទដែលកាត់បន្ថយទិន្នផល ដែលបង្កការគំរាមកំហែងយ៉ាងធ្ងន់ធ្ងរដល់ការផលិតសណ្តែកសកល (Phaseolus vulgaris L.) (Bolton et al., 2006)។ Sclerotinia sclerotiorum គឺជាផ្សិតបង្កជំងឺរុក្ខជាតិដែលឆ្លងតាមដីដែលពិបាកគ្រប់គ្រងបំផុតមួយ ជាមួយនឹងប្រភេទរុក្ខជាតិជាង 600 ប្រភេទ និងសមត្ថភាពក្នុងការរំលាយជាលិការុក្ខជាតិយ៉ាងឆាប់រហ័សតាមរបៀបមិនជាក់លាក់ (Liang and Rollins, 2018)។ ក្រោមលក្ខខណ្ឌមិនអំណោយផល វាឆ្លងកាត់ដំណាក់កាលសំខាន់នៃវដ្តជីវិតរបស់វា ដោយនៅតែអសកម្មក្នុងរយៈពេលយូរ ជារចនាសម្ព័ន្ធពណ៌ខ្មៅ រឹង ដូចគ្រាប់ពូជ ដែលហៅថា 'sclerotia' នៅក្នុងដី ឬជាការលូតលាស់ពណ៌ស ទន់ៗ នៅក្នុង mycelium ឬ ស្នូលដើមរបស់រុក្ខជាតិដែលឆ្លងមេរោគ (Schwartz et al., 2005)។ S. sclerotiorum មានសមត្ថភាពបង្កើតជា sclerotia ដែលអនុញ្ញាតឱ្យវារស់រានមានជីវិតនៅក្នុងវាលដែលមានមេរោគក្នុងរយៈពេលយូរ និងនៅតែបន្តកើតមានក្នុងអំឡុងពេលមានជំងឺ (Schwartz et al., 2005)។ Sclerotia សម្បូរទៅដោយសារធាតុចិញ្ចឹម អាចរស់នៅក្នុងដីក្នុងរយៈពេលយូរ និងបម្រើជាមេរោគចម្បងសម្រាប់ការឆ្លងមេរោគជាបន្តបន្ទាប់ (Schwartz et al., 2005)។ ក្រោមលក្ខខណ្ឌអំណោយផល sclerotia ដុះពន្លក និងបង្កើតស្ព័រនៅលើអាកាស ដែលអាចឆ្លងដល់ផ្នែកទាំងអស់ខាងលើដីនៃរុក្ខជាតិ រួមទាំងប៉ុន្តែមិនកំណត់ចំពោះ ផ្កា ដើម ឬផ្លែ (Schwartz et al., 2005)។
ផ្សិត Sclerotinia sclerotiorum ប្រើយុទ្ធសាស្ត្រពហុកម្រិតដើម្បីឆ្លងដល់រុក្ខជាតិម្ចាស់ផ្ទះរបស់វា ដែលពាក់ព័ន្ធនឹងព្រឹត្តិការណ៍សម្របសម្រួលជាបន្តបន្ទាប់ចាប់ពីដំណុះ sclerotial រហូតដល់ការវិវត្តនៃរោគសញ្ញា។ ដំបូងឡើយ S. sclerotiorum ផលិតស្ព័រព្យួរ (ហៅថា ascospores) ពីរចនាសម្ព័ន្ធដូចផ្សិតហៅថា apothecia ដែលក្លាយទៅជាខ្យល់ ហើយវិវត្តទៅជា sclerotia ដែលមិនអាចធ្វើចលនាបាននៅលើកំទេចកំទីរុក្ខជាតិដែលមានមេរោគ (Bolton et al., 2006)។ បន្ទាប់មកផ្សិតបញ្ចេញអាស៊ីត oxalic ដែលជាកត្តាបង្កជំងឺ ដើម្បីគ្រប់គ្រង pH ជញ្ជាំងកោសិការុក្ខជាតិ ជំរុញការរិចរិលអង់ស៊ីម និងការឈ្លានពានជាលិកា (Hegedus and Rimmer, 2005) និងទប់ស្កាត់ការផ្ទុះអុកស៊ីតកម្មរបស់រុក្ខជាតិម្ចាស់ផ្ទះ។ ដំណើរការធ្វើឱ្យអាស៊ីតនេះធ្វើឱ្យជញ្ជាំងកោសិការុក្ខជាតិចុះខ្សោយ ដោយផ្តល់នូវបរិយាកាសអំណោយផលសម្រាប់ប្រតិបត្តិការធម្មតា និងមានប្រសិទ្ធភាពនៃអង់ស៊ីមរិចរិលជញ្ជាំងកោសិកាផ្សិត (CWDEs) ដែលអនុញ្ញាតឱ្យភ្នាក់ងារបង្ករោគយកឈ្នះលើរបាំងរូបវន្ត និងជ្រាបចូលទៅក្នុងជាលិកាម្ចាស់ផ្ទះ (Marciano et al., 1983)។ នៅពេលដែលជ្រាបចូលបាន S. sclerotiorum បញ្ចេញ CWDE មួយចំនួន ដូចជា polygalacturonase និង cellulase ដែលជួយសម្រួលដល់ការរីករាលដាលរបស់វានៅក្នុងជាលិកាដែលឆ្លងមេរោគ និងបណ្តាលឱ្យជាលិកាងាប់។ ការវិវត្តនៃដំបៅ និងស្រទាប់ hyphal នាំឱ្យមានរោគសញ្ញាលក្ខណៈនៃផ្សិតពណ៌ស (Hegedus និង Rimmer, 2005)។ ទន្ទឹមនឹងនេះ រុក្ខជាតិម្ចាស់ផ្ទះស្គាល់លំនាំម៉ូលេគុលដែលទាក់ទងនឹងភ្នាក់ងារបង្ករោគ (PAMPs) តាមរយៈឧបករណ៍ទទួលការស្គាល់លំនាំ (PRRs) ដែលបង្កឱ្យមានព្រឹត្តិការណ៍សញ្ញាជាបន្តបន្ទាប់ ដែលនៅទីបំផុតធ្វើឱ្យសកម្មនូវការឆ្លើយតបការពារ។
បើទោះបីជាមានការខិតខំប្រឹងប្រែងគ្រប់គ្រងជំងឺអស់រយៈពេលជាច្រើនទសវត្សរ៍ក៏ដោយ ក៏ការខ្វះខាតហ្សែនធន់នឹងថ្នាំគ្រប់គ្រាន់នៅតែមាននៅក្នុងសណ្តែក ដូចជាដំណាំពាណិជ្ជកម្មដទៃទៀតដែរ ដោយសារតែភាពធន់ ការរស់រានមានជីវិត និងភាពបត់បែនរបស់ភ្នាក់ងារបង្កជំងឺ។ ដូច្នេះការគ្រប់គ្រងជំងឺគឺជាបញ្ហាប្រឈមយ៉ាងខ្លាំង ហើយតម្រូវឱ្យមានយុទ្ធសាស្ត្ររួមបញ្ចូលគ្នា និងពហុទិដ្ឋភាព ដែលរួមមានការរួមបញ្ចូលគ្នានៃការអនុវត្តវប្បធម៌ ការគ្រប់គ្រងជីវសាស្រ្ត និងថ្នាំសម្លាប់ផ្សិតគីមី (O'Sullivan et al., 2021)។ ការគ្រប់គ្រងផ្សិតពណ៌សដោយគីមីគឺមានប្រសិទ្ធភាពបំផុត ពីព្រោះថ្នាំសម្លាប់ផ្សិត នៅពេលអនុវត្តបានត្រឹមត្រូវ និងទាន់ពេលវេលា អាចគ្រប់គ្រងការរីករាលដាលនៃជំងឺបានយ៉ាងមានប្រសិទ្ធភាព កាត់បន្ថយភាពធ្ងន់ធ្ងរនៃការឆ្លងមេរោគ និងកាត់បន្ថយការខាតបង់ទិន្នផល។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ ការប្រើប្រាស់ថ្នាំសម្លាប់ផ្សិតច្រើនពេក និងការពឹងផ្អែកខ្លាំងពេកលើថ្នាំសម្លាប់ផ្សិតអាចនាំឱ្យមានការលេចចេញនូវពូជដែលធន់នឹងថ្នាំ S. sclerotiorum និងប៉ះពាល់អវិជ្ជមានដល់សារពាង្គកាយមិនមែនគោលដៅ សុខភាពដី និងគុណភាពទឹក (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024)។ ដូច្នេះ ការស្វែងរកជម្រើសដែលមិនប៉ះពាល់ដល់បរិស្ថានបានក្លាយជាអាទិភាពចម្បង។
សារធាតុប៉ូលីអាមីន (PAs) ដូចជា putrescine, spermidine, spermine និង cadaverine អាចបម្រើជាជម្រើសដ៏ជោគជ័យប្រឆាំងនឹងភ្នាក់ងារបង្កជំងឺរុក្ខជាតិដែលឆ្លងតាមដី ដោយហេតុនេះកាត់បន្ថយទាំងស្រុង ឬដោយផ្នែកនូវការប្រើប្រាស់ថ្នាំសម្លាប់ផ្សិតគីមីដ៏គ្រោះថ្នាក់ (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024)។ នៅក្នុងរុក្ខជាតិខ្ពស់ៗ PAs ពាក់ព័ន្ធនឹងដំណើរការសរីរវិទ្យាជាច្រើន រួមទាំង ប៉ុន្តែមិនកំណត់ចំពោះ ការបែងចែកកោសិកា ភាពខុសគ្នា និងការឆ្លើយតបទៅនឹងភាពតានតឹងអសរីរាង្គ និងជីវសាស្រ្ត (Killiny and Nehela, 2020)។ ពួកវាអាចដើរតួជាសារធាតុប្រឆាំងអុកស៊ីតកម្ម ជួយស្វែងរកប្រភេទអុកស៊ីសែនដែលមានប្រតិកម្ម (ROS) រក្សាលំនឹងអុកស៊ីតកម្ម (Nehela និង Killiny, 2023) បង្កើតហ្សែនទាក់ទងនឹងការការពារ (Romero et al., 2018) គ្រប់គ្រងផ្លូវមេតាប៉ូលីសផ្សេងៗ (Nehela និង Killiny, 2023) កែប្រែអរម៉ូនរុក្ខជាតិខាងក្នុង (Nehela និង Killiny, 2019) បង្កើតភាពធន់នឹងប្រព័ន្ធ (SAR) និងគ្រប់គ្រងអន្តរកម្មរវាងរុក្ខជាតិ និងភ្នាក់ងារបង្កជំងឺ (Nehela និង Killiny, 2020; Asija et al., 2022; Czerwoniec, 2022)។ គួរកត់សម្គាល់ថាយន្តការ និងតួនាទីជាក់លាក់របស់ PAs ក្នុងការការពាររុក្ខជាតិប្រែប្រួលអាស្រ័យលើប្រភេទរុក្ខជាតិ ភ្នាក់ងារបង្កជំងឺ និងលក្ខខណ្ឌបរិស្ថាន។ PA ដែលមានច្រើនបំផុតនៅក្នុងរុក្ខជាតិត្រូវបានសំយោគជីវសាស្រ្តពីប៉ូលីអាមីន L-ornithine សំខាន់ៗ (Killiny និង Nehela, 2020)។
L-ornithine ដើរតួនាទីច្រើនយ៉ាងក្នុងការលូតលាស់ និងការអភិវឌ្ឍរបស់រុក្ខជាតិ។ ឧទាហរណ៍ ការសិក្សាពីមុនបានបង្ហាញថា នៅក្នុងស្រូវ (Oryza sativa) អ័រនីទីនអាចត្រូវបានផ្សារភ្ជាប់ជាមួយនឹងការកែច្នៃអាសូតឡើងវិញ (Liu et al., 2018) ទិន្នផលស្រូវ គុណភាព និងក្លិនក្រអូប (Lu et al., 2020) និងការឆ្លើយតបនៃភាពតានតឹងទឹក (Yang et al., 2000)។ លើសពីនេះ ការប្រើប្រាស់ L-ornithine ពីខាងក្រៅបានបង្កើនភាពធន់នឹងគ្រោះរាំងស្ងួតយ៉ាងខ្លាំងនៅក្នុងដើមប៊ីតស្ករ (Beta vulgaris) (Hussein et al., 2019) និងកាត់បន្ថយភាពតានតឹងអំបិលនៅក្នុងរុក្ខជាតិខ្ទឹមបារាំង (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu និង Çavuşoǧlu, 2021) និងគ្រាប់ស្វាយចន្ទី (Anacardium occidentale) (da Rocha et al., 2012)។ តួនាទីដ៏មានសក្តានុពលរបស់ L-ornithine ក្នុងការការពារភាពតានតឹងអសរីរាង្គអាចបណ្តាលមកពីការចូលរួមរបស់វានៅក្នុងការប្រមូលផ្តុំប្រូលីននៅក្នុងរុក្ខជាតិដែលបានព្យាបាល។ ឧទាហរណ៍ ហ្សែនដែលទាក់ទងនឹងការរំលាយអាហារប្រូលីន ដូចជាហ្សែន ornithine delta aminotransferase (delta-OAT) និងហ្សែន proline dehydrogenase (ProDH1 និង ProDH2) ពីមុនត្រូវបានរាយការណ៍ថាពាក់ព័ន្ធនឹងការការពារ Nicotiana benthamiana និង Arabidopsis thaliana ប្រឆាំងនឹងពូជ Pseudomonas syringae ដែលមិនមែនជាម្ចាស់ផ្ទះ (Senthil-Kumar និង Mysore, 2012)។ ម្យ៉ាងវិញទៀត ផ្សិត ornithine decarboxylase (ODC) គឺត្រូវបានទាមទារសម្រាប់ការលូតលាស់របស់ភ្នាក់ងារបង្ករោគ (Singh et al., 2020)។ ការកំណត់គោលដៅ ODC នៃ Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici តាមរយៈការបិទហ្សែនដែលបង្កឡើងដោយម្ចាស់ផ្ទះ (HIGS) បានបង្កើនភាពធន់របស់រុក្ខជាតិប៉េងប៉ោះចំពោះជំងឺ Fusarium wilt (Singh et al., 2020)។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ តួនាទីដ៏មានសក្តានុពលនៃការប្រើប្រាស់ ornithine ពីខាងក្រៅប្រឆាំងនឹងភាពតានតឹងជីវសាស្រ្តដូចជា phytopathogens មិនទាន់ត្រូវបានសិក្សាឱ្យបានច្បាស់លាស់នៅឡើយទេ។ អ្វីដែលសំខាន់ជាងនេះទៅទៀត ផលប៉ះពាល់នៃអ័រនីទីនទៅលើភាពធន់នឹងជំងឺ និងបាតុភូតជីវគីមី និងសរីរវិទ្យាដែលពាក់ព័ន្ធ ភាគច្រើននៅតែមិនទាន់ត្រូវបានរុករកនៅឡើយ។
ការយល់ដឹងអំពីភាពស្មុគស្មាញនៃការឆ្លងមេរោគ S. sclerotiorum លើសណ្តែកគឺមានសារៈសំខាន់សម្រាប់ការអភិវឌ្ឍយុទ្ធសាស្ត្រត្រួតពិនិត្យប្រកបដោយប្រសិទ្ធភាព។ នៅក្នុងការសិក្សានេះ យើងមានគោលបំណងកំណត់អត្តសញ្ញាណតួនាទីដែលអាចកើតមាននៃ diamine L-ornithine ជាកត្តាសំខាន់ក្នុងការបង្កើនយន្តការការពារ និងភាពធន់របស់រុក្ខជាតិសណ្តែកចំពោះការឆ្លងមេរោគ Sclerotinia sclerotiorum។ យើងសន្និដ្ឋានថា បន្ថែមពីលើការបង្កើនការឆ្លើយតបការពាររបស់រុក្ខជាតិដែលឆ្លងមេរោគ L-ornithine ក៏ដើរតួនាទីយ៉ាងសំខាន់ក្នុងការរក្សាស្ថានភាព redox ផងដែរ។ យើងស្នើថាផលប៉ះពាល់ដែលអាចកើតមាននៃ L-ornithine គឺទាក់ទងនឹងការគ្រប់គ្រងយន្តការការពារប្រឆាំងអុកស៊ីតកម្មអង់ស៊ីម និងមិនមែនអង់ស៊ីម និងការជ្រៀតជ្រែកជាមួយនឹងកត្តាបង្កជំងឺ/ភាពសាហាវរបស់ផ្សិត និងប្រូតេអ៊ីនដែលពាក់ព័ន្ធ។ មុខងារពីរយ៉ាងរបស់ L-ornithine នេះធ្វើឱ្យវាក្លាយជាបេក្ខជនដ៏ជោគជ័យសម្រាប់យុទ្ធសាស្ត្រប្រកបដោយចីរភាពដើម្បីកាត់បន្ថយផលប៉ះពាល់នៃផ្សិតពណ៌ស និងបង្កើនភាពធន់របស់ដំណាំសណ្តែកទូទៅចំពោះភ្នាក់ងារបង្កជំងឺផ្សិតដ៏មានឥទ្ធិពលនេះ។ លទ្ធផលនៃការសិក្សាបច្ចុប្បន្នអាចជួយក្នុងការអភិវឌ្ឍវិធីសាស្រ្តប្រកបដោយភាពច្នៃប្រឌិត និងមិនប៉ះពាល់ដល់បរិស្ថាន ដើម្បីគ្រប់គ្រងផ្សិតពណ៌ស និងកាត់បន្ថយផលប៉ះពាល់របស់វាទៅលើការផលិតសណ្តែក។
នៅក្នុងការសិក្សានេះ ពូជសណ្តែកធម្មតាដែលងាយនឹងកើតជំងឺ Giza 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3) ដែលជាពូជពាណិជ្ជកម្មងាយនឹងកើតជំងឺ ត្រូវបានប្រើប្រាស់ជាសម្ភារៈពិសោធន៍។ គ្រាប់ពូជដែលមានសុខភាពល្អត្រូវបានផ្តល់ដោយនាយកដ្ឋានស្រាវជ្រាវសណ្តែក វិទ្យាស្ថានស្រាវជ្រាវដំណាំវាល (FCRI) មជ្ឈមណ្ឌលស្រាវជ្រាវកសិកម្ម (ARC) ប្រទេសអេហ្ស៊ីប។ គ្រាប់ពូជចំនួនប្រាំត្រូវបានសាបព្រោះក្នុងផើងប្លាស្ទិក (អង្កត់ផ្ចិតខាងក្នុង 35 សង់ទីម៉ែត្រ ជម្រៅ 50 សង់ទីម៉ែត្រ) ដែលពោរពេញទៅដោយដីដែលមានមេរោគ S. sclerotiorum ក្រោមលក្ខខណ្ឌផ្ទះកញ្ចក់ (25 ± 2 °C សំណើមដែលទាក់ទង 75 ± 1% 8 ម៉ោងមានពន្លឺ/16 ម៉ោងងងឹត)។ នៅ 7-10 ថ្ងៃបន្ទាប់ពីសាបព្រួស (DPS) សំណាបត្រូវបានកាត់ស្តើងៗដើម្បីទុកតែសំណាបពីរប៉ុណ្ណោះដែលមានការលូតលាស់ស្មើគ្នា និងស្លឹកដែលរីកធំពេញលេញចំនួនបីនៅក្នុងឆ្នាំងនីមួយៗ។ រុក្ខជាតិដែលដាំក្នុងផើងទាំងអស់ត្រូវបានស្រោចទឹកម្តងរៀងរាល់ពីរសប្តាហ៍ម្តង និងដាក់ជីជារៀងរាល់ខែតាមអត្រាដែលបានណែនាំសម្រាប់ពូជដែលបានផ្តល់ឱ្យ។
ដើម្បីរៀបចំកំហាប់ L-ornithinediamine 500 មីលីក្រាម/លីត្រ (ត្រូវបានគេស្គាល់ផងដែរថាជា (+)-(S)-2,5-diaminopentanoic acid; Sigma-Aldrich, Darmstadt, ប្រទេសអាល្លឺម៉ង់) 50 មីលីក្រាមត្រូវបានរំលាយជាមុនសិនក្នុងទឹកចម្រោះមាប់មគ 100 មីលីលីត្រ។ បន្ទាប់មកដំណោះស្រាយស្តុកត្រូវបានពនលាយ ហើយប្រើប្រាស់ក្នុងការពិសោធន៍ជាបន្តបន្ទាប់។ ជាសង្ខេប កំហាប់ L-ornithine ចំនួនប្រាំមួយស៊េរី (12.5, 25, 50, 75, 100, និង 125 មីលីក្រាម/លីត្រ) ត្រូវបានសាកល្បងនៅក្នុងវីត្រូ។ លើសពីនេះ ទឹកចម្រោះមាប់មគត្រូវបានប្រើជាការគ្រប់គ្រងអវិជ្ជមាន (Mock) និងម្សៅសម្លាប់មេរោគពាណិជ្ជកម្ម “Rizolex-T” 50% ដែលអាចសើមបាន (toclofos-methyl 20% + thiram 30%; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, Kafr El Zayat, Gharbia Governorate, ប្រទេសអេហ្ស៊ីប) ត្រូវបានប្រើជាការគ្រប់គ្រងវិជ្ជមាន។ ថ្នាំសម្លាប់ផ្សិត​សម្រាប់​ពាណិជ្ជកម្ម “Rizolex-T” ត្រូវ​បាន​ធ្វើ​តេស្ត​នៅ​ក្នុង​វីត្រូ​ក្នុង​កំហាប់​ប្រាំ (2, 4, 6, 8 និង 10 មីលីក្រាម/លីត្រ)។
គំរូដើម និងផ្លែសណ្តែកធម្មតាដែលបង្ហាញរោគសញ្ញាធម្មតានៃផ្សិតពណ៌ស (អត្រាឆ្លង៖ ១០-៣០%) ត្រូវបានប្រមូលពីកសិដ្ឋានពាណិជ្ជកម្ម។ ទោះបីជាសម្ភារៈរុក្ខជាតិដែលឆ្លងមេរោគភាគច្រើនត្រូវបានកំណត់អត្តសញ្ញាណតាមប្រភេទ/ពូជ (ពូជពាណិជ្ជកម្មដែលងាយរងគ្រោះ Giza 3) ក៏ដោយ គំរូផ្សេងទៀត ជាពិសេសគំរូដែលទទួលបានពីទីផ្សារក្នុងស្រុក គឺជាប្រភេទដែលមិនស្គាល់។ សម្ភារៈដែលឆ្លងមេរោគដែលប្រមូលបានត្រូវបានសម្លាប់មេរោគលើផ្ទៃជាមុនសិនជាមួយនឹងដំណោះស្រាយសូដ្យូមអ៊ីប៉ូក្លរីត ០.៥% រយៈពេល ៣ នាទី បន្ទាប់មកលាងសម្អាតច្រើនដងជាមួយទឹកចម្រោះមាប់មគ ហើយជូតឱ្យស្ងួតជាមួយក្រដាសតម្រងមាប់មគដើម្បីយកទឹកលើសចេញ។ បន្ទាប់មកសរីរាង្គដែលឆ្លងមេរោគត្រូវបានកាត់ជាបំណែកតូចៗពីជាលិកាកណ្តាល (រវាងជាលិកាដែលមានសុខភាពល្អ និងជាលិកាដែលឆ្លងមេរោគ) ដាំដុះលើឧបករណ៍ផ្ទុកដំឡូង dextrose agar (PDA) ហើយភ្ញាស់នៅសីតុណ្ហភាព ២៥ ± ២ អង្សាសេ ជាមួយនឹងវដ្តពន្លឺ ១២ ម៉ោង/ងងឹត ១២ ម៉ោង រយៈពេល ៥ ថ្ងៃ ដើម្បីជំរុញការបង្កើត sclerotia។ វិធីសាស្ត្រចុង mycelial ក៏ត្រូវបានប្រើដើម្បីបន្សុទ្ធអ៊ីសូឡង់ផ្សិតពីវប្បធម៌ចម្រុះ ឬបំពុលផងដែរ។ អ៊ីសូឡង់ផ្សិតដែលបានបន្សុទ្ធត្រូវបានកំណត់អត្តសញ្ញាណដំបូងដោយផ្អែកលើលក្ខណៈរូបវិទ្យាវប្បធម៌របស់វា ហើយបន្ទាប់មកបានបញ្ជាក់ថាជា S. sclerotiorum ដោយផ្អែកលើលក្ខណៈពិសេសមីក្រូទស្សន៍។ ជាចុងក្រោយ អ៊ីសូឡង់ដែលបានបន្សុទ្ធទាំងអស់ត្រូវបានធ្វើតេស្តរកភាពបង្កជំងឺលើសណ្តែកពូជ Giza 3 ដែលងាយនឹងកើតជំងឺ ដើម្បីបំពេញតាមសម្មតិកម្មរបស់ Koch។
លើសពីនេះ មេរោគ S. sclerotiorum ដែលរាតត្បាតបំផុត (មេរោគ #3) ត្រូវបានបញ្ជាក់បន្ថែមទៀតដោយផ្អែកលើការរៀបលំដាប់លំដោយប្រតិចារិកខាងក្នុង (ITS) ដូចដែលបានពិពណ៌នាដោយ White et al., 1990; Baturo-Ciesniewska et al., 2017។ ជាសង្ខេប មេរោគត្រូវបានដាំដុះក្នុងទឹកស៊ុបដំឡូងបារាំង dextrose (PDB) ហើយភ្ញាស់នៅសីតុណ្ហភាព 25 ± 2 °C រយៈពេល 5-7 ថ្ងៃ។ បន្ទាប់មក ផ្សិត mycelium ត្រូវបានប្រមូល ច្រោះតាមក្រណាត់ cheesecloth លាងសម្អាតពីរដងជាមួយទឹកស្អាត និងសម្ងួតជាមួយក្រដាសតម្រងស្អាត។ DNA ហ្សែនត្រូវបានញែកចេញដោយប្រើ Quick-DNA™ Fungal/Bacterial Miniprep Kit (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024)។ តំបន់ ITS rDNA ត្រូវបានពង្រីកដោយប្រើគូ primer ជាក់លាក់ ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; ទំហំរំពឹងទុក៖ 540 bp) (Baturo-Ciesniewska et al., 2017)។ ផលិតផល PCR ដែលបានបន្សុទ្ធត្រូវបានដាក់ជូនសម្រាប់ការធ្វើលំដាប់ (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.)។ លំដាប់ ITS rDNA ត្រូវបានធ្វើលំដាប់ទ្វេទិសដោយប្រើវិធីសាស្ត្រ Sanger sequencing។ លំដាប់សំណួរដែលបានផ្គុំត្រូវបានប្រៀបធៀបជាមួយទិន្នន័យចុងក្រោយបំផុតនៅក្នុង GenBank និងមជ្ឈមណ្ឌលជាតិសម្រាប់ព័ត៌មានជីវបច្ចេកវិទ្យា (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) ដោយប្រើកម្មវិធី BLASTn។ លំដាប់សំណួរត្រូវបានប្រៀបធៀបជាមួយពូជ/អ៊ីសូឡង់ S. sclerotiorum ចំនួន 20 ផ្សេងទៀតដែលទាញយកពីទិន្នន័យចុងក្រោយបំផុតនៅក្នុង NCBI GenBank (តារាងបន្ថែម S1) ដោយប្រើ ClustalW នៅក្នុងកញ្ចប់វិភាគហ្សែនវិវត្តន៍ម៉ូលេគុល (MEGA-11; កំណែទី 11) (Kumar et al., 2024)។ ការវិភាគវិវត្តន៍ត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើវិធីសាស្ត្រលទ្ធភាពអតិបរមា និងគំរូជំនួសនុយក្លេអូទីតដែលអាចបញ្ច្រាស់ពេលវេលាទូទៅ (Nei និង Kumar, 2000)។ ដើមឈើដែលមានលទ្ធភាពឡូការខ្ពស់បំផុតត្រូវបានបង្ហាញ។ ដើមឈើដំបូងសម្រាប់ការស្វែងរក heuristic ត្រូវបានជ្រើសរើសដោយជ្រើសរើសដើមឈើដែលមានលទ្ធភាពឡូការខ្ពស់ជាងរវាងដើមឈើភ្ជាប់ជិតខាង (NJ) (Kumar et al., 2024) និងដើមឈើ parsimony អតិបរមា (MP)។ ដើមឈើ NJ ត្រូវបានបង្កើតឡើងដោយប្រើម៉ាទ្រីសចម្ងាយគូដែលគណនាដោយប្រើគំរូបញ្ច្រាស់ពេលវេលាទូទៅ (Nei និង Kumar, 2000)។
សកម្មភាព​ប្រឆាំង​បាក់តេរី​របស់ L-ornithine និង​ថ្នាំ​សម្លាប់​បាក់តេរី “Rizolex-T” ត្រូវ​បាន​កំណត់​នៅ​ក្នុង​វីត្រូ​ដោយ​វិធីសាស្ត្រ​សាយភាយ​អាហ្គា។ វិធីសាស្ត្រ៖ យក​បរិមាណ​សមស្រប​នៃ​ដំណោះស្រាយ​ស្តុក​របស់ L-ornithine (500 មីលីក្រាម/លីត្រ) ហើយ​លាយ​វា​ឲ្យ​សព្វ​ជាមួយ​នឹង​សារធាតុចិញ្ចឹម PDA ចំនួន 10 មីលីលីត្រ ដើម្បី​រៀបចំ​ដំណោះស្រាយ​ដែល​មាន​កំហាប់​ចុងក្រោយ 12.5, 25, 50, 75, 100 និង 125 មីលីក្រាម/លីត្រ​រៀងៗ​ខ្លួន។ កំហាប់​ប្រាំ​នៃ​ថ្នាំ​សម្លាប់​ផ្សិត “Rizolex-T” (2, 4, 6, 8 និង 10 មីលីក្រាម/លីត្រ) និង​ទឹក​ចម្រោះ​មាប់មគ ត្រូវ​បាន​ប្រើ​ជា​ការ​ត្រួតពិនិត្យ។ បន្ទាប់​ពី​ឧបករណ៍​បាន​រឹង ដុំ​ផ្សិត Sclerotinia sclerotiorum ដែល​ទើប​តែ​រៀបចំ​ថ្មីៗ មាន​អង្កត់ផ្ចិត 4 មីលីម៉ែត្រ ត្រូវ​បាន​ផ្ទេរ​ទៅ​កណ្តាល​នៃ​ចាន Petri ហើយ​ដាំដុះ​នៅ​សីតុណ្ហភាព 25±2°C រហូត​ដល់​ផ្សិត​គ្រប​ដណ្ដប់​លើ​ចាន Petri ត្រួតពិនិត្យ​ទាំងមូល បន្ទាប់​មក​ការ​លូតលាស់​ផ្សិត​ត្រូវ​បាន​កត់ត្រា។ គណនាភាគរយនៃការរារាំងការលូតលាស់រ៉ាឌីកាល់របស់ S. sclerotiorum ដោយប្រើសមីការទី 1៖
ការពិសោធន៍ត្រូវបានធ្វើម្តងទៀតពីរដង ដោយមានការបង្កើតឡើងវិញជីវសាស្រ្តចំនួនប្រាំមួយសម្រាប់ក្រុមត្រួតពិនិត្យ/ពិសោធន៍នីមួយៗ និងផើងចំនួនប្រាំ (រុក្ខជាតិពីរក្នុងមួយផើង) សម្រាប់ការចម្លងជីវសាស្រ្តនីមួយៗ។ ការចម្លងជីវសាស្រ្តនីមួយៗត្រូវបានវិភាគពីរដង (ការចម្លងបច្ចេកទេសពីរ) ដើម្បីធានាបាននូវភាពត្រឹមត្រូវ ភាពជឿជាក់ និងភាពអាចផលិតឡើងវិញបាននៃលទ្ធផលពិសោធន៍។ លើសពីនេះ ការវិភាគតំរែតំរង់ប្រូប៊ីតត្រូវបានប្រើដើម្បីគណនាកំហាប់រារាំងពាក់កណ្តាលអតិបរមា (IC50) និង IC99 (Prentice, 1976)។
ដើម្បីវាយតម្លៃសក្តានុពលរបស់ L-ornithine ក្រោមលក្ខខណ្ឌផ្ទះកញ្ចក់ ការពិសោធន៍ឆ្នាំងពីរជាប់ៗគ្នាត្រូវបានធ្វើឡើង។ ជាសង្ខេប ផើងត្រូវបានបំពេញដោយដីឥដ្ឋ-ខ្សាច់ដែលបានក្រៀវ (3:1) ហើយចាក់បញ្ចូលជាមួយវប្បធម៌ S. sclerotiorum ដែលទើបនឹងរៀបចំថ្មីៗ។ ដំបូង អ៊ីសូឡង់ដែលឈ្លានពានបំផុតនៃ S. sclerotiorum (អ៊ីសូឡង់ #3) ត្រូវបានដាំដុះដោយការកាត់ sclerotium មួយជាពីរ ដាក់វាផ្កាប់មុខចុះក្រោមនៅលើ PDA ហើយភ្ញាស់នៅសីតុណ្ហភាព 25°C ក្នុងភាពងងឹតថេរ (24 ម៉ោង) រយៈពេល 4 ថ្ងៃដើម្បីជំរុញការលូតលាស់ mycelial។ បន្ទាប់មក ដោត agar អង្កត់ផ្ចិត 5 មីលីម៉ែត្រចំនួនបួនត្រូវបានយកចេញពីគែមខាងមុខ ហើយចាក់បញ្ចូលជាមួយល្បាយស្រូវសាលី និងកន្ទក់អង្ករចំនួន 100 ក្រាម (1:1, v/v) ហើយដបទាំងអស់ត្រូវបានភ្ញាស់នៅសីតុណ្ហភាព 25 ± 2°C ក្រោមវដ្តពន្លឺ 12 ម៉ោង/ងងឹត 12 ម៉ោងរយៈពេល 5 ថ្ងៃដើម្បីជំរុញការបង្កើត sclerotia។ មាតិកានៃដបទាំងអស់ត្រូវបានលាយបញ្ចូលគ្នាយ៉ាងហ្មត់ចត់ដើម្បីធានាបាននូវភាពដូចគ្នាមុនពេលបន្ថែមដី។ បន្ទាប់មក ល្បាយកន្ទក់ដែលដាំក្នុងផើងចំនួន ១០០ ក្រាម ត្រូវបានបន្ថែមទៅក្នុងផើងនីមួយៗ ដើម្បីធានាបាននូវកំហាប់ថេរនៃភ្នាក់ងារបង្ករោគ។ ផើងដែលបានចាក់វ៉ាក់សាំងត្រូវបានស្រោចទឹកដើម្បីធ្វើឱ្យផ្សិតលូតលាស់ និងដាក់ក្នុងលក្ខខណ្ឌផ្ទះកញ្ចក់រយៈពេល ៧ ថ្ងៃ។
គ្រាប់ពូជចំនួនប្រាំនៃពូជ Giza 3 ត្រូវបានសាបព្រោះក្នុងឆ្នាំងនីមួយៗ។ ចំពោះផើងដែលត្រូវបានព្យាបាលដោយ L-ornithine និងថ្នាំសម្លាប់ផ្សិត Rizolex-T គ្រាប់ពូជដែលបានក្រៀវត្រូវបានត្រាំរយៈពេលពីរម៉ោងជាមុនសិនក្នុងដំណោះស្រាយទឹកនៃសមាសធាតុទាំងពីរជាមួយនឹងកំហាប់ IC99 ចុងក្រោយប្រហែល 250 មីលីក្រាម/លីត្រ និង 50 មីលីក្រាម/លីត្ររៀងៗខ្លួន ហើយបន្ទាប់មកសម្ងួតដោយខ្យល់រយៈពេលមួយម៉ោងមុនពេលសាបព្រួស។ ម្យ៉ាងវិញទៀត គ្រាប់ពូជត្រូវបានត្រាំក្នុងទឹកចម្រោះមាប់មគជាការគ្រប់គ្រងអវិជ្ជមាន។ បន្ទាប់ពី 10 ថ្ងៃ មុនពេលស្រោចទឹកលើកដំបូង សំណាបត្រូវបានកាត់ចេញ ដោយទុកសំណាបស្អាតតែពីរប៉ុណ្ណោះក្នុងឆ្នាំងនីមួយៗ។ លើសពីនេះ ដើម្បីធានាបាននូវការឆ្លងមេរោគជាមួយ S. sclerotiorum ដើមសណ្តែកនៅដំណាក់កាលអភិវឌ្ឍន៍ដូចគ្នា (10 ថ្ងៃ) ត្រូវបានកាត់នៅទីតាំងពីរផ្សេងគ្នាដោយប្រើកាំបិតវះកាត់មាប់មគ ហើយល្បាយកន្ទក់ប្រហែល 0.5 ក្រាមត្រូវបានដាក់ចូលទៅក្នុងមុខរបួសនីមួយៗ បន្ទាប់មកដោយសំណើមខ្ពស់ដើម្បីជំរុញការឆ្លងមេរោគ និងការវិវត្តនៃជំងឺនៅក្នុងរុក្ខជាតិដែលបានចាក់វ៉ាក់សាំងទាំងអស់។ រុក្ខជាតិត្រួតពិនិត្យត្រូវបានរងរបួសស្រដៀងគ្នា ហើយល្បាយកន្ទក់មាប់មគ ដែលមិនមានជាតិអាណានិគម ក្នុងបរិមាណស្មើគ្នា (0.5 ក្រាម) ត្រូវបានដាក់ចូលទៅក្នុងមុខរបួស ហើយរក្សានៅក្រោមសំណើមខ្ពស់ ដើម្បីធ្វើត្រាប់តាមបរិស្ថានសម្រាប់ការវិវត្តនៃជំងឺ និងធានាបាននូវភាពស៊ីសង្វាក់គ្នារវាងក្រុមព្យាបាល។
វិធីសាស្ត្រព្យាបាល៖ សំណាបសណ្តែកត្រូវបានស្រោចទឹកជាមួយនឹងដំណោះស្រាយទឹក L-ornithine (250 មីលីក្រាម/លីត្រ) ចំនួន 500 មីលីលីត្រ ឬថ្នាំសម្លាប់ផ្សិត Rizolex-T (50 មីលីក្រាម/លីត្រ) ដោយស្រោចទឹកក្នុងដី បន្ទាប់មកការព្យាបាលត្រូវបានធ្វើម្តងទៀតបីដងក្នុងចន្លោះពេល 10 ថ្ងៃ។ ក្រុមត្រួតពិនិត្យដែលបានព្យាបាលដោយ placebo ត្រូវបានស្រោចទឹកជាមួយនឹងទឹកចម្រោះមាប់មគចំនួន 500 មីលីលីត្រ។ ការព្យាបាលទាំងអស់ត្រូវបានអនុវត្តក្រោមលក្ខខណ្ឌផ្ទះកញ្ចក់ (25 ± 2°C សំណើមទាក់ទង 75 ± 1% និងរយៈពេលពន្លឺ 8 ម៉ោង/ងងឹត 16 ម៉ោង)។ ផើងទាំងអស់ត្រូវបានស្រោចទឹករៀងរាល់ពីរសប្តាហ៍ម្តង និងព្យាបាលជារៀងរាល់ខែជាមួយនឹងជី NPK ដែលមានតុល្យភាព (20-20-20 ជាមួយនឹងស្ពាន់ធ័រ 3.6% និងមីក្រូធាតុ TE; គ្រាប់ពូជ Zain ប្រទេសអេហ្ស៊ីប) ក្នុងកំហាប់ 3-4 ក្រាម/លីត្រ ដោយការបាញ់ថ្នាំលើស្លឹក ស្របតាមអនុសាសន៍សម្រាប់ពូជជាក់លាក់ និងការណែនាំរបស់អ្នកផលិត។ លុះត្រាតែមានការបញ្ជាក់ផ្សេងពីនេះ ស្លឹកចាស់ទុំដែលបានពង្រីកពេញលេញ (ស្លឹកទី 2 និងទី 3 ពីលើចុះក្រោម) ត្រូវបានប្រមូលពីការចម្លងជីវសាស្រ្តនីមួយៗនៅម៉ោង 72 ម៉ោងបន្ទាប់ពីការព្យាបាល (hpt) ធ្វើឱ្យដូចគ្នា ប្រមូលផ្តុំ និងរក្សាទុកនៅសីតុណ្ហភាព -80 °C សម្រាប់ការវិភាគបន្ថែម រួមទាំង ប៉ុន្តែមិនកំណត់ចំពោះ ការកំណត់ទីតាំងអ៊ីស្តូគីមីនៅនឹងកន្លែងនៃសូចនាករស្ត្រេសអុកស៊ីតកម្ម លីពីតអុកស៊ីតកម្ម សារធាតុប្រឆាំងអុកស៊ីតកម្មអង់ស៊ីម និងមិនមែនអង់ស៊ីម និងការបញ្ចេញហ្សែន។
អាំងតង់ស៊ីតេនៃការឆ្លងមេរោគផ្សិតសត្រូវបានវាយតម្លៃជារៀងរាល់សប្តាហ៍ 21 ថ្ងៃបន្ទាប់ពីចាក់វ៉ាក់សាំង (dpi) ដោយប្រើមាត្រដ្ឋាន 1–9 (តារាងបន្ថែម S2) ដោយផ្អែកលើមាត្រដ្ឋាន Petzoldt និង Dickson (1996) ដែលកែប្រែដោយ Teran et al. (2006)។ ជាសង្ខេប ដើម និងមែកឈើនៃដើមសណ្តែកត្រូវបានពិនិត្យដោយចាប់ផ្តើមពីចំណុចចាក់វ៉ាក់សាំង ដើម្បីតាមដានការវិវត្តនៃដំបៅតាមបណ្តោយចន្លោះថ្នាំង និងថ្នាំង។ ចម្ងាយនៃដំបៅពីចំណុចចាក់វ៉ាក់សាំងទៅចំណុចឆ្ងាយបំផុតតាមបណ្តោយដើម ឬមែកត្រូវបានវាស់វែង ហើយពិន្ទុ 1–9 ត្រូវបានកំណត់ដោយផ្អែកលើទីតាំងនៃដំបៅ ដែល (1) បង្ហាញថាមិនមានការឆ្លងមេរោគដែលអាចមើលឃើញនៅជិតចំណុចចាក់វ៉ាក់សាំង និង (2–9) បង្ហាញពីការកើនឡើងបន្តិចម្តងៗនៃទំហំដំបៅ និងការវិវត្តតាមបណ្តោយថ្នាំង/ចន្លោះថ្នាំង (តារាងបន្ថែម S2)។ អាំងតង់ស៊ីតេនៃការឆ្លងមេរោគផ្សិតសត្រូវបានបម្លែងទៅជាភាគរយដោយប្រើរូបមន្ត 2៖
លើសពីនេះ ផ្ទៃក្រោមខ្សែកោងវឌ្ឍនភាពនៃជំងឺ (AUDPC) ត្រូវបានគណនាដោយប្រើរូបមន្ត (Shaner និង Finney, 1977) ដែលថ្មីៗនេះត្រូវបានកែសម្រួលសម្រាប់ការរលួយពណ៌សនៃសណ្តែកធម្មតា (Chauhan et al., 2020) ដោយប្រើសមីការទី 3៖
ដែល Yi = ភាពធ្ងន់ធ្ងរនៃជំងឺនៅពេល ti, Yi+1 = ភាពធ្ងន់ធ្ងរនៃជំងឺនៅពេលបន្ទាប់ ti+1, ti = ពេលវេលានៃការវាស់វែងលើកដំបូង (ជាថ្ងៃ), ti+1 = ពេលវេលានៃការវាស់វែងបន្ទាប់ (ជាថ្ងៃ), n = ចំនួនសរុបនៃចំណុចពេលវេលា ឬចំណុចសង្កេត។ ប៉ារ៉ាម៉ែត្រកំណើនរុក្ខជាតិសណ្តែក រួមទាំងកម្ពស់រុក្ខជាតិ (សង់ទីម៉ែត្រ) ចំនួនមែកក្នុងមួយរុក្ខជាតិ និងចំនួនស្លឹកក្នុងមួយរុក្ខជាតិ ត្រូវបានកត់ត្រាជារៀងរាល់សប្តាហ៍រយៈពេល 21 ថ្ងៃនៅក្នុងច្បាប់ចម្លងជីវសាស្រ្តទាំងអស់។
នៅក្នុងការចម្លងជីវសាស្រ្តនីមួយៗ គំរូស្លឹក (ស្លឹកដែលលូតលាស់ពេញលេញទីពីរ និងទីបីពីកំពូល) ត្រូវបានប្រមូលនៅថ្ងៃទី 45 បន្ទាប់ពីការព្យាបាល (15 ថ្ងៃបន្ទាប់ពីការព្យាបាលចុងក្រោយ)។ ការចម្លងជីវសាស្រ្តនីមួយៗមានផើងចំនួនប្រាំ (រុក្ខជាតិពីរក្នុងមួយផើង)។ ប្រហែល 500 មីលីក្រាមនៃជាលិកាកំទេចត្រូវបានប្រើសម្រាប់ការស្រង់ចេញសារធាតុពណ៌រស្មីសំយោគ (ក្លរ៉ូហ្វីល ក ក្លរ៉ូហ្វីល ខ និងការ៉ូទីណូអ៊ីត) ដោយប្រើអាសេតូន 80% នៅសីតុណ្ហភាព 4°C ក្នុងទីងងឹត។ បន្ទាប់ពី 24 ម៉ោង គំរូត្រូវបានបង្វិល ហើយសារធាតុរាវខាងលើត្រូវបានប្រមូលសម្រាប់ការកំណត់មាតិកាក្លរ៉ូហ្វីល ក ក្លរ៉ូហ្វីល ខ និងការ៉ូទីណូអ៊ីតដោយពណ៌ដោយប្រើឧបករណ៍វាស់វិសាលគម UV-160A (Shimadzu Corporation, ជប៉ុន) ស្របតាមវិធីសាស្ត្រ (Lichtenthaler, 1987) ដោយវាស់ការស្រូបយកនៅរលកពន្លឺបីផ្សេងគ្នា (A470, A646 និង A663 nm)។ ជាចុងក្រោយ មាតិកានៃសារធាតុពណ៌រស្មីសំយោគត្រូវបានគណនាដោយប្រើរូបមន្តខាងក្រោម 4–6 ដែលបានពិពណ៌នាដោយ Lichtenthaler (1987)។
នៅ​រយៈពេល 72 ម៉ោង​ក្រោយ​ការ​ព្យាបាល (hpt) ស្លឹក (ស្លឹក​ដែល​បាន​លូតលាស់​ពេញលេញ​ទីពីរ និង​ទីបី​ពី​ខាងលើ) ត្រូវ​បាន​ប្រមូល​ពី​ការ​ចម្លង​ជីវសាស្រ្ត​នីមួយៗ​សម្រាប់​ការ​កំណត់​ទីតាំង​អ៊ីស្តូគីមី​នៅ​នឹង​កន្លែង​នៃ​អ៊ីដ្រូសែន​ប៉េរ៉ុកស៊ីត (H2O2) និង​អានីយ៉ុង​ស៊ុយភឺរអុកស៊ីត (O2•−)។ ការ​ចម្លង​ជីវសាស្រ្ត​នីមួយៗ​មាន​ផើង​ចំនួន​ប្រាំ (រុក្ខជាតិ​ពីរ​ក្នុង​មួយ​ផើង)។ ការ​ចម្លង​ជីវសាស្រ្ត​នីមួយៗ​ត្រូវ​បាន​វិភាគ​ជា​ពីរ​ដង (ការ​ចម្លង​បច្ចេកទេស​ពីរ) ដើម្បី​ធានា​បាន​នូវ​ភាព​ត្រឹមត្រូវ ភាព​ជឿជាក់ និង​ភាព​អាច​បង្កើត​ឡើង​វិញ​បាន​នៃ​វិធីសាស្ត្រ។ H2O2 និង O2•− ត្រូវ​បាន​កំណត់​ដោយ​ប្រើ 0.1% 3,3′-diaminobenzidine (DAB; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany) ឬ nitroblue tetrazolium (NBT; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany) រៀងៗ​ខ្លួន ដោយ​អនុវត្ត​តាម​វិធីសាស្ត្រ​ដែល​បាន​ពិពណ៌នា​ដោយ Romero-Puertas et al. (2004) និង Adam et al. (1989) ជាមួយ​នឹង​ការ​កែប្រែ​តិចតួច។ ចំពោះការកំណត់ទីតាំងហ៊ីស្តូគីមីនៃ H2O2 នៅនឹងកន្លែង ខិត្តប័ណ្ណត្រូវបានជ្រៀតចូលក្នុងសុញ្ញាកាសជាមួយ 0.1% DAB ក្នុងសារធាតុ Tris buffer 10 mM (pH 7.8) ហើយបន្ទាប់មកភ្ញាស់នៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់ក្នុងពន្លឺរយៈពេល 60 នាទី។ ខិត្តប័ណ្ណត្រូវបានធ្វើឱ្យសក្នុង TCA 0.15% (v/v) ក្នុងអេតាណុល៖ក្លរ៉ូហ្វម 4:1 (v/v) (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egypt) ហើយបន្ទាប់មកប៉ះពាល់នឹងពន្លឺរហូតដល់វាងងឹត។ ស្រដៀងគ្នានេះដែរ វ៉ាល់ត្រូវបានជ្រៀតចូលក្នុងសុញ្ញាកាសជាមួយសារធាតុប៉ូតាស្យូមផូស្វាត buffer 10 mM (pH 7.8) ដែលមានផ្ទុក 0.1 w/v % HBT សម្រាប់ការកំណត់ទីតាំងហ៊ីស្តូគីមីនៃ O2•− នៅនឹងកន្លែង។ ខិត្តប័ណ្ណត្រូវបានភ្ញាស់ក្នុងពន្លឺនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់រយៈពេល 20 នាទី បន្ទាប់មកធ្វើឱ្យសដូចខាងលើ ហើយបន្ទាប់មកបំភ្លឺរហូតដល់ចំណុចពណ៌ខៀវចាស់/ពណ៌ស្វាយលេចឡើង។ អាំងតង់ស៊ីតេនៃពណ៌ត្នោត (ជាសូចនាករ H2O2) ឬពណ៌ខៀវ-វីយូឡេ (ជាសូចនាករ O2•−) ដែលជាលទ្ធផលត្រូវបានវាយតម្លៃដោយប្រើកញ្ចប់ដំណើរការរូបភាព ImageJ កំណែហ្វីជី (http://fiji.sc; ចូលប្រើនៅថ្ងៃទី 7 ខែមីនា ឆ្នាំ 2024)។
ម៉ាឡូនឌីយ៉ាដេអ៊ីត (MDA; ជាសញ្ញាសម្គាល់នៃអុកស៊ីតកម្ម lipid peroxidation) ត្រូវបានកំណត់តាមវិធីសាស្ត្ររបស់ Du និង Bramlage (1992) ដោយមានការកែប្រែបន្តិចបន្តួច។ ស្លឹកពីច្បាប់ចម្លងជីវសាស្រ្តនីមួយៗ (ស្លឹកដែលលូតលាស់ពេញលេញទីពីរ និងទីបីពីកំពូល) ត្រូវបានប្រមូល 72 ម៉ោងបន្ទាប់ពីការព្យាបាល (hpt)។ ច្បាប់ចម្លងជីវសាស្រ្តនីមួយៗរួមមានផើងចំនួនប្រាំ (រុក្ខជាតិពីរក្នុងមួយផើង)។ ច្បាប់ចម្លងជីវសាស្រ្តនីមួយៗត្រូវបានវិភាគជាពីរច្បាប់ (ច្បាប់ចម្លងបច្ចេកទេសពីរ) ដើម្បីធានាបាននូវភាពត្រឹមត្រូវ ភាពជឿជាក់ និងភាពអាចផលិតឡើងវិញបាននៃវិធីសាស្ត្រ។ ជាសង្ខេប ជាលិកាស្លឹកកិន 0.5 ក្រាមត្រូវបានប្រើសម្រាប់ការស្រង់ចេញ MDA ជាមួយអាស៊ីត trichloroacetic 20% (TCA; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) ដែលមានផ្ទុក butylated hydroxytoluene 0.01% (BHT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)។ មាតិកា MDA នៅក្នុងសារធាតុរាវខាងលើត្រូវបានកំណត់តាមពណ៌ដោយវាស់ការស្រូបយកនៅ 532 និង 600 nm ដោយប្រើម៉ាស៊ីនវិសាលគម UV-160A (សាជីវកម្ម Shimadzu ប្រទេសជប៉ុន) ហើយបន្ទាប់មកត្រូវបានបង្ហាញជា nmol g−1 FW។
សម្រាប់ការវាយតម្លៃសារធាតុប្រឆាំងអុកស៊ីតកម្មមិនមែនអង់ស៊ីម និងអង់ស៊ីម ស្លឹក (ស្លឹកដែលលូតលាស់ពេញលេញទីពីរ និងទីបីពីកំពូល) ត្រូវបានប្រមូលពីការចម្លងជីវសាស្រ្តនីមួយៗនៅ 72 ម៉ោងបន្ទាប់ពីការព្យាបាល (hpt)។ ការចម្លងជីវសាស្រ្តនីមួយៗមានផើងចំនួនប្រាំ (រុក្ខជាតិពីរក្នុងមួយផើង)។ គំរូជីវសាស្រ្តនីមួយៗត្រូវបានវិភាគជាពីរច្បាប់ (គំរូបច្ចេកទេសពីរ)។ ស្លឹកពីរត្រូវបានកិនជាមួយអាសូតរាវ ហើយប្រើដោយផ្ទាល់សម្រាប់ការកំណត់សារធាតុប្រឆាំងអុកស៊ីតកម្មអង់ស៊ីម និងមិនមែនអង់ស៊ីម អាស៊ីតអាមីណូសរុប មាតិកាប្រូលីន ការបញ្ចេញហ្សែន និងការវាស់បរិមាណអុកស៊ីឡាត។
សារធាតុហ្វេណុលរលាយសរុបត្រូវបានកំណត់ដោយប្រើសារធាតុ Folin-Ciocalteu (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ជាមួយនឹងការកែប្រែបន្តិចបន្តួចនៃវិធីសាស្ត្រដែលបានពិពណ៌នាដោយ Kahkonen et al. (1999)។ ជាសង្ខេប ជាលិកាស្លឹកដែលរលាយរួចប្រហែល 0.1 ក្រាមត្រូវបានស្រង់ចេញជាមួយមេតាណុល 80% ចំនួន 20 មីលីលីត្រ ក្នុងទីងងឹតរយៈពេល 24 ម៉ោង ហើយសារធាតុរាវខាងលើត្រូវបានប្រមូលបន្ទាប់ពីការបង្វិល។ សារធាតុចម្រាញ់គំរូចំនួន 0.1 មីលីលីត្រត្រូវបានលាយជាមួយសារធាតុ Folin-Ciocalteu ចំនួន 0.5 មីលីលីត្រ (10%) អង្រួនរយៈពេល 30 វិនាទី ហើយទុកក្នុងទីងងឹតរយៈពេល 5 នាទី។ បន្ទាប់មក ដំណោះស្រាយសូដ្យូមកាបូណាត 20% ចំនួន 0.5 មីលីលីត្រ (Na2CO3; ក្រុមហ៊ុនឱសថ និងសម្ភារៈវេជ្ជសាស្ត្រ Al-Gomhoria ទីក្រុងគែរ ប្រទេសអេហ្ស៊ីប) ត្រូវបានបន្ថែមទៅក្នុងបំពង់នីមួយៗ លាយបញ្ចូលគ្នាយ៉ាងហ្មត់ចត់ និងភ្ញាស់នៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់ក្នុងទីងងឹតរយៈពេល 1 ម៉ោង។ បន្ទាប់ពីការភ្ញាស់ ការស្រូបយកនៃល្បាយប្រតិកម្មត្រូវបានវាស់នៅ 765 nm ដោយប្រើម៉ាស៊ីនវាស់វិសាលគម UV-160A (Shimadzu Corporation, ជប៉ុន)។ កំហាប់នៃហ្វេណុលរលាយសរុបនៅក្នុងសារធាតុដកស្រង់គំរូត្រូវបានកំណត់ដោយប្រើខ្សែកោងក្រិតតាមខ្នាតអាស៊ីតហ្គាលីក (Fisher Scientific, Hampton, NH, សហរដ្ឋអាមេរិក) ហើយត្រូវបានបង្ហាញជាមីលីក្រាមនៃអាស៊ីតហ្គាលីកសមមូលក្នុងមួយក្រាមនៃទម្ងន់ស្រស់ (mg GAE g-1 ទម្ងន់ស្រស់)។
មាតិកា flavonoid រលាយសរុបត្រូវបានកំណត់តាមវិធីសាស្ត្ររបស់ Djeridane et al. (2006) ដោយមានការកែប្រែបន្តិចបន្តួច។ ជាសង្ខេប សារធាតុចម្រាញ់មេតាណុលខាងលើចំនួន 0.3 មីលីលីត្រ ត្រូវបានលាយជាមួយនឹងដំណោះស្រាយអាលុយមីញ៉ូមក្លរួ 5% ចំនួន 0.3 មីលីលីត្រ (AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) កូរឱ្យសព្វ រួចដាក់ឱ្យភ្ញាស់នៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់រយៈពេល 5 នាទី បន្ទាប់មកបន្ថែមដំណោះស្រាយប៉ូតាស្យូមអាសេតាត 10% ចំនួន 0.3 មីលីលីត្រ (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egypt) លាយបញ្ចូលគ្នាយ៉ាងហ្មត់ចត់ រួចដាក់ឱ្យភ្ញាស់នៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់រយៈពេល 30 នាទីក្នុងទីងងឹត។ បន្ទាប់ពីការភ្ញាស់ ការស្រូបយកនៃល្បាយប្រតិកម្មត្រូវបានវាស់នៅ 430 nm ដោយប្រើម៉ាស៊ីនវាស់វិសាលគម UV-160A (Shimadzu Corporation, Japan)។ កំហាប់ flavonoid រលាយសរុបនៅក្នុងសារធាតុចម្រាញ់គំរូត្រូវបានកំណត់ដោយប្រើខ្សែកោងក្រិតតាមខ្នាត rutin (TCI America, Portland, OR, USA) ហើយបន្ទាប់មកត្រូវបានបង្ហាញជាមីលីក្រាមនៃសមមូល rutin ក្នុងមួយក្រាមនៃទម្ងន់ស្រស់ (mg RE g-1 ទម្ងន់ស្រស់)។
មាតិកាអាស៊ីតអាមីណូសេរីសរុបនៃស្លឹកសណ្តែកត្រូវបានកំណត់ដោយប្រើសារធាតុប្រតិកម្មនីនហ៊ីដ្រីនដែលបានកែប្រែ (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) ដោយផ្អែកលើវិធីសាស្ត្រដែលបានស្នើឡើងដោយ Yokoyama និង Hiramatsu (2003) និងកែប្រែដោយ Sun et al. (2006)។ ជាសង្ខេប ជាលិកាដី 0.1 ក្រាមត្រូវបានស្រង់ចេញជាមួយនឹងសារធាតុ pH 5.4 ហើយសារធាតុរាវខាងលើ 200 μL ត្រូវបានប្រតិកម្មជាមួយនីនហ៊ីដ្រីន 200 μL (2%) និងពីរីឌីន 200 μL (10%; Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, USA) ភ្ញាស់ក្នុងទឹកពុះរយៈពេល 30 នាទី បន្ទាប់មកធ្វើឱ្យត្រជាក់ និងវាស់នៅ 580 nm ដោយប្រើម៉ាស៊ីនវាស់វិសាលគម UV-160A (Shimadzu Corporation, Japan)។ ម្យ៉ាងវិញទៀត ប្រូលីនត្រូវបានកំណត់ដោយវិធីសាស្ត្រ Bates (Bates et al., 1973)។ ប្រូលីនត្រូវបានស្រង់ចេញជាមួយអាស៊ីតស៊ុលហ្វូសាលីស៊ីលីក 3% (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) ហើយបន្ទាប់ពីការបង្វិល សារធាតុរាវខាងលើ 0.5 មីលីលីត្រត្រូវបានលាយជាមួយអាស៊ីតអាសេទិកទឹកកក 1 មីលីលីត្រ (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) និងសារធាតុប្រតិកម្មនីនហ៊ីដ្រីន ភ្ញាស់នៅសីតុណ្ហភាព 90°C រយៈពេល 45 នាទី ធ្វើឱ្យត្រជាក់ និងវាស់នៅ 520 nm ដោយប្រើម៉ាស៊ីនវាស់វិសាលគមដូចគ្នានឹងខាងលើ។ អាស៊ីតអាមីណូសេរីសរុប និងប្រូលីននៅក្នុងសារធាតុចម្រាញ់ពីស្លឹកត្រូវបានកំណត់ដោយប្រើខ្សែកោងក្រិតតាមខ្នាតគ្លីស៊ីន និងប្រូលីន (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) រៀងៗខ្លួន ហើយត្រូវបានបង្ហាញជាមីលីក្រាម/ក្រាមទម្ងន់ស្រស់។
ដើម្បីកំណត់សកម្មភាពអង់ស៊ីមនៃអង់ស៊ីមប្រឆាំងអុកស៊ីតកម្ម ជាលិកា homogenized ប្រហែល 500 មីលីក្រាម ត្រូវបានស្រង់ចេញជាមួយនឹងសារធាតុ Tris buffer កំហាប់ 50 mM ចំនួន 3 មីលីលីត្រ (pH 7.8) ដែលមានផ្ទុក 1 mM EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) និង polyvinylpyrrolidone 7.5% (PVP; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ដែលត្រូវបានបង្វិលក្នុងល្បឿន 10,000 × g រយៈពេល 20 នាទីក្រោមទូរទឹកកក (4 °C) ហើយសារធាតុរាវ supernatant (សារធាតុចម្រាញ់ពីអង់ស៊ីមឆៅ) ត្រូវបានប្រមូល (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023)។ បន្ទាប់មក កាតាឡាស (CAT) ត្រូវបានប្រតិកម្មជាមួយនឹងសារធាតុសូដ្យូមផូស្វាត 0.1 M ចំនួន 2 មីលីលីត្រ (pH 6.5; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) និងដំណោះស្រាយ H2O2 កំហាប់ 269 mM ចំនួន 100 μl ដើម្បីកំណត់សកម្មភាពអង់ស៊ីមរបស់វា យោងតាមវិធីសាស្ត្រ Aebi (1984) ជាមួយនឹងការកែប្រែបន្តិចបន្តួច (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023)។ សកម្មភាពអង់ស៊ីមប៉េរ៉ុកស៊ីដាសដែលពឹងផ្អែកលើ Guaiacol (POX) ត្រូវបានកំណត់ដោយប្រើវិធីសាស្ត្រ Harrach et al. (2009)។ (2008) ជាមួយនឹងការកែប្រែតិចតួច (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) និងសកម្មភាពអង់ស៊ីមរបស់ polyphenol oxidase (PPO) ត្រូវបានកំណត់បន្ទាប់ពីមានប្រតិកម្មជាមួយសារធាតុសូដ្យូមផូស្វាត 100 mM ចំនួន 2.2 មីលីលីត្រ (pH 6.0) ហ្គាយ៉ាកូល 100 μl (សារធាតុគីមី TCI ទីក្រុង Portland រដ្ឋ OR សហរដ្ឋអាមេរិក) និង H2O2 12 mM ចំនួន 100 μl។ វិធីសាស្ត្រនេះត្រូវបានកែប្រែបន្តិចបន្តួចពី (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023)។ ការវិភាគត្រូវបានអនុវត្តបន្ទាប់ពីមានប្រតិកម្មជាមួយដំណោះស្រាយ catechol ចំនួន 3 មីលីលីត្រ (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA សហរដ្ឋអាមេរិក) (0.01 M) ដែលទើបរៀបចំថ្មីៗក្នុងសារធាតុផូស្វាត 0.1 M (pH 6.0)។ សកម្មភាព CAT ត្រូវបានវាស់វែងដោយតាមដានការរលួយនៃ H2O2 នៅ 240 nm (A240) សកម្មភាព POX ត្រូវបានវាស់វែងដោយតាមដានការកើនឡើងនៃការស្រូបយកនៅ 436 nm (A436) និងសកម្មភាព PPO ត្រូវបានវាស់វែងដោយកត់ត្រាការប្រែប្រួលនៃការស្រូបយកនៅ 495 nm (A495) រៀងរាល់ 30 វិនាទីរយៈពេល 3 នាទីដោយប្រើម៉ាស៊ីនវាស់វិសាលគម UV-160A (Shimadzu ប្រទេសជប៉ុន)។
វិធីសាស្ត្រ RT-PCR ពេលវេលាជាក់ស្តែងត្រូវបានប្រើដើម្បីរកឃើញកម្រិតប្រតិចារិកនៃហ្សែនដែលទាក់ទងនឹងសារធាតុប្រឆាំងអុកស៊ីតកម្មចំនួនបី រួមមាន peroxisomal catalase (PvCAT1; GenBank Accession No. KF033307.1), superoxide dismutase (PvSOD; GenBank Accession No. XM_068639556.1) និង glutathione reductase (PvGR; GenBank Accession No. KY195009.1) នៅក្នុងស្លឹកសណ្តែក (ស្លឹកទីពីរ និងទីបីដែលបានអភិវឌ្ឍពេញលេញពីកំពូល) 72 ម៉ោងបន្ទាប់ពីការព្យាបាលចុងក្រោយ។ ជាសង្ខេប RNA ត្រូវបានញែកចេញដោយប្រើ Simply P Total RNA Extraction Kit (Cat. No. BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, ប្រទេសចិន) ស្របតាមពិធីការរបស់អ្នកផលិត។ បន្ទាប់មក cDNA ត្រូវបានសំយោគដោយប្រើ TOP script™ cDNA Synthesis Kit ស្របតាមការណែនាំរបស់អ្នកផលិត។ លំដាប់ primer នៃហ្សែនទាំងបីខាងលើត្រូវបានរាយក្នុងតារាងបន្ថែម S3។ PvActin-3 (លេខចូលប្រើប្រាស់ GenBank៖ XM_068616709.1) ត្រូវបានប្រើជាហ្សែនថែរក្សាផ្ទះ ហើយការបញ្ចេញហ្សែនដែលទាក់ទងត្រូវបានគណនាដោយប្រើវិធីសាស្ត្រ 2-ΔΔCT (Livak និង Schmittgen, 2001)។ ស្ថេរភាពអាកទីនក្រោមភាពតានតឹងជីវសាស្រ្ត (អន្តរកម្មមិនឆបគ្នារវាងសណ្តែកធម្មតា និងផ្សិតអង់ត្រាក់ណូស Colletotrichum lindemuthianum) និងភាពតានតឹងអសរីរាង្គ (គ្រោះរាំងស្ងួត ជាតិប្រៃ សីតុណ្ហភាពទាប) ត្រូវបានបង្ហាញ (Borges et al., 2012)។
ដំបូងឡើយ យើងបានអនុវត្តការវិភាគក្នុងស៊ីលីកូទូទាំងហ្សែននៃប្រូតេអ៊ីន oxaloacetate acetylhydrolase (OAH) នៅក្នុង S. sclerotiorum ដោយប្រើឧបករណ៍ BLAST ប្រូតេអ៊ីន-ប្រូតេអ៊ីន (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005)។ ជាសង្ខេប យើងបានប្រើ OAH ពី Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; taxide: 1191702; លេខចូល GenBank XP_040799428.1; អាស៊ីតអាមីណូ 342) និង Penicillium lagena (PlOAH; taxide: 94218; លេខចូល GenBank XP_056833920.1; អាស៊ីតអាមីណូ 316) ជាលំដាប់សំណួរដើម្បីគូសផែនទីប្រូតេអ៊ីនដូចគ្នានៅក្នុង S. sclerotiorum (taxide: 5180)។ BLASTp ត្រូវបានអនុវត្តប្រឆាំងនឹងទិន្នន័យហ្សែន S. sclerotiorum ដែលអាចរកបានថ្មីបំផុតនៅក្នុង GenBank នៅលើគេហទំព័រមជ្ឈមណ្ឌលជាតិសម្រាប់ព័ត៌មានជីវបច្ចេកវិទ្យា (NCBI) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/។
លើសពីនេះ ហ្សែន OAH ដែលបានព្យាករណ៍ពី S. sclerotiorum (SsOAH) និងការវិភាគវិវត្តន៍ និងដើមឈើពង្សាវតារនៃ AfOAH ពី A. fijiensis CBS 313.89 និង PlOAH ពី P. lagena ត្រូវបានសន្និដ្ឋានដោយប្រើវិធីសាស្ត្រលទ្ធភាពអតិបរមានៅក្នុង MEGA11 (Tamura et al., 2021) និងគំរូផ្អែកលើម៉ាទ្រីស JTT (Jones et al., 1992)។ ដើមឈើពង្សាវតារត្រូវបានផ្សំជាមួយនឹងការវិភាគតម្រឹមច្រើននៃលំដាប់ប្រូតេអ៊ីននៃហ្សែន OAH ដែលបានព្យាករណ៍ទាំងអស់ (SsOAH) ពី S. sclerotiorum និងលំដាប់សំណួរដោយប្រើឧបករណ៍តម្រឹមផ្អែកលើការរឹតបន្តឹង (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Papadopoulos និង Agarwala, 2007)។ លើសពីនេះ លំដាប់អាស៊ីតអាមីណូដែលត្រូវគ្នាល្អបំផុតនៃ SsOAH ពី S. sclerotiorum ត្រូវបានតម្រឹមជាមួយនឹងលំដាប់សំណួរ (AfOAH និង PlOAH) (Larkin et al., 2007) ដោយប្រើ ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw) ហើយតំបន់អភិរក្សក្នុងការតម្រឹមត្រូវបានមើលឃើញដោយប្រើឧបករណ៍ ESPript (កំណែ 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php)។
លើសពីនេះ ដែនតំណាងមុខងារដែលបានព្យាករណ៍ និងទីតាំងអភិរក្សនៃ S. sclerotiorum SsOAH ត្រូវបានចាត់ថ្នាក់ជាក្រុមផ្សេងៗគ្នាដោយប្រើឧបករណ៍ InterPro (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum et al., 2021)។ ជាចុងក្រោយ ការធ្វើគំរូរចនាសម្ព័ន្ធបីវិមាត្រ (3D) នៃ S. sclerotiorum SsOAH ដែលបានព្យាករណ៍ត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើម៉ាស៊ីនទទួលស្គាល់ភាពស្រដៀងគ្នានៃប្រូតេអ៊ីន (ម៉ាស៊ីនមេ Phyre2 កំណែ 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley et al., 2015) និងត្រូវបានផ្ទៀងផ្ទាត់ដោយប្រើម៉ាស៊ីនមេ SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014)។ រចនាសម្ព័ន្ធបីវិមាត្រដែលបានព្យាករណ៍ (ទម្រង់ PDB) ត្រូវបានមើលឃើញដោយអន្តរកម្មដោយប្រើកញ្ចប់ UCSF-Chimera (កំណែ 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/) (Pettersen et al., 2004)។
វិធីសាស្ត្រ PCR បញ្ចេញពន្លឺបរិមាណពេលវេលាជាក់ស្តែងត្រូវបានប្រើដើម្បីកំណត់កម្រិតនៃការចម្លងនៃ oxaloacetate acetylhydrolase (SsOAH; លេខចូល GenBank៖ XM_001590428.1) នៅក្នុងផ្សិត Sclerotinia sclerotiorum។ ជាសង្ខេប S. sclerotiorum ត្រូវបានចាក់ចូលទៅក្នុងដបដែលមាន PDB ហើយដាក់ក្នុងម៉ាស៊ីនភ្ញាស់ (ម៉ូដែល៖ I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) នៅសីតុណ្ហភាព 25 ± 2°C រយៈពេល 24 ម៉ោង ក្នុងល្បឿន 150 rpm និងក្នុងភាពងងឹតថេរ (24 ម៉ោង) ដើម្បីជំរុញការលូតលាស់ផ្សិត។ បន្ទាប់ពីនោះ កោសិកាត្រូវបានព្យាបាលដោយ L-ornithine និងថ្នាំសម្លាប់ផ្សិត Rizolex-T នៅកំហាប់ IC50 ចុងក្រោយ (ប្រហែល 40 និង 3.2 mg/L រៀងគ្នា) ហើយបន្ទាប់មកដាំដុះរយៈពេល 24 ម៉ោងទៀតក្រោមលក្ខខណ្ឌដូចគ្នា។ បន្ទាប់ពីការភ្ញាស់រួច វប្បធម៌ត្រូវបានបង្វិលក្នុងល្បឿន 2500 rpm រយៈពេល 5 នាទី ហើយសារធាតុរាវខាងលើ (ផ្សិត mycelium) ត្រូវបានប្រមូលសម្រាប់ការវិភាគការបញ្ចេញហ្សែន។ ស្រដៀងគ្នានេះដែរ ផ្សិត mycelium ត្រូវបានប្រមូលនៅម៉ោង 0, 24, 48, 72, 96 និង 120 ម៉ោងបន្ទាប់ពីការឆ្លងមេរោគពីរុក្ខជាតិដែលឆ្លងមេរោគ ដែលបានបង្កើតជាផ្សិតពណ៌ស និងផ្សិតសំឡីនៅលើផ្ទៃនៃជាលិកាដែលឆ្លងមេរោគ។ RNA ត្រូវបានស្រង់ចេញពីផ្សិត mycelium ហើយបន្ទាប់មក cDNA ត្រូវបានសំយោគដូចដែលបានពិពណ៌នាខាងលើ។ លំដាប់ primer សម្រាប់ SsOAH ត្រូវបានរាយក្នុងតារាងបន្ថែម S3។ SsActin (លេខចូលប្រើប្រាស់ GenBank៖ XM_001589919.1) ត្រូវបានប្រើជាហ្សែនថែរក្សា ហើយការបញ្ចេញហ្សែនដែលទាក់ទងត្រូវបានគណនាដោយប្រើវិធីសាស្ត្រ 2-ΔΔCT (Livak និង Schmittgen, 2001)។
អាស៊ីតអុកស៊ីលីកត្រូវបានកំណត់នៅក្នុងទឹកស៊ុបដំឡូងបារាំងដិចស្ត្រូស (PDB) និងគំរូរុក្ខជាតិដែលមានផ្ទុកមេរោគផ្សិត Sclerotinia sclerotiorum ស្របតាមវិធីសាស្ត្ររបស់ Xu និង Zhang (2000) ដោយមានការកែប្រែបន្តិចបន្តួច។ ជាសង្ខេប មេរោគ S. sclerotiorum ត្រូវបានចាក់ចូលទៅក្នុងដបដែលមានផ្ទុក PDB ហើយបន្ទាប់មកដាំដុះនៅក្នុងម៉ាស៊ីនភ្ញាស់ដោយញ័រ (ម៉ូដែល I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) ក្នុងល្បឿន 150 rpm ក្នុងសីតុណ្ហភាព 25 ± 2°C រយៈពេល 3-5 ថ្ងៃក្នុងភាពងងឹតថេរ (24 ម៉ោង) ដើម្បីជំរុញការលូតលាស់របស់មីសេលីល។ បន្ទាប់ពីការភ្ញាស់ វប្បធម៌ផ្សិតត្រូវបានច្រោះជាមុនសិនតាមរយៈក្រដាសតម្រង Whatman #1 ហើយបន្ទាប់មកត្រូវបានបង្វិលក្នុងល្បឿន 2500 rpm រយៈពេល 5 នាទីដើម្បីយកមីសេលីញ៉ូមដែលនៅសេសសល់ចេញ។ សារធាតុរាវខាងលើត្រូវបានប្រមូល និងរក្សាទុកនៅសីតុណ្ហភាព 4°C សម្រាប់ការកំណត់បរិមាណបន្ថែមនៃអូសាឡាត។ សម្រាប់ការរៀបចំគំរូរុក្ខជាតិ បំណែកជាលិការុក្ខជាតិប្រហែល 0.1 ក្រាមត្រូវបានស្រង់ចេញបីដងជាមួយទឹកចម្រោះ (2 មីលីលីត្រក្នុងមួយដង)។ បន្ទាប់មក សំណាកត្រូវបានបង្វិលក្នុងល្បឿន 2500 rpm រយៈពេល 5 នាទី ហើយសារធាតុរាវខាងលើត្រូវបានត្រងស្ងួតតាមរយៈក្រដាសតម្រង Whatman លេខ 1 ហើយប្រមូលសម្រាប់ការវិភាគបន្ថែម។
ចំពោះការវិភាគបរិមាណអាស៊ីតអុកសាលីក ល្បាយប្រតិកម្មត្រូវបានរៀបចំនៅក្នុងបំពង់កញ្ចក់ដែលមានគម្របតាមលំដាប់ដូចខាងក្រោម៖ 0.2 មីលីលីត្រនៃគំរូ (ឬទឹកចម្រោះវប្បធម៌ PDB ឬដំណោះស្រាយស្តង់ដារអាស៊ីតអុកសាលីក) 0.11 មីលីលីត្រនៃ bromophenol blue (BPB, 1 mM; Fisher Chemical, Pittsburgh, PA, USA) 0.198 មីលីលីត្រនៃអាស៊ីតស៊ុលហ្វួរិក 1 M (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egypt) និង 0.176 មីលីលីត្រនៃ 100 mM ប៉ូតាស្យូមឌីក្រូម៉ាត (K2Cr2O7; TCI chemicals, Portland, OR, USA) ហើយបន្ទាប់មកដំណោះស្រាយត្រូវបានពនលាយដល់ 4.8 មីលីលីត្រជាមួយទឹកចម្រោះ លាយបញ្ចូលគ្នាយ៉ាងខ្លាំងក្លា ហើយដាក់ភ្លាមៗក្នុងអាងងូតទឹកសីតុណ្ហភាព 60 °C។ បន្ទាប់ពី 10 នាទី ប្រតិកម្មត្រូវបានបញ្ឈប់ដោយបន្ថែម 0.5 មីលីលីត្រនៃដំណោះស្រាយសូដ្យូមអ៊ីដ្រូស៊ីត (NaOH; 0.75 M)។ ការស្រូបយក (A600) នៃល្បាយប្រតិកម្មត្រូវបានវាស់នៅ 600 nm ដោយប្រើម៉ាស៊ីនវិភាគវិសាលគម UV-160 (សាជីវកម្ម Shimadzu ប្រទេសជប៉ុន)។ PDB និងទឹកចម្រោះត្រូវបានប្រើជាការគ្រប់គ្រងសម្រាប់ការវាស់បរិមាណនៃទឹកចម្រោះវប្បធម៌ និងសំណាករុក្ខជាតិរៀងៗខ្លួន។ កំហាប់អាស៊ីតអុកស៊ីលីកនៅក្នុងទឹកចម្រោះវប្បធម៌ ដែលបង្ហាញជាមីក្រូក្រាមនៃអាស៊ីតអុកស៊ីលីកក្នុងមួយមីលីលីត្រនៃឧបករណ៍ផ្ទុក PDB (μg.mL−1) និងនៅក្នុងសារធាតុចម្រាញ់ពីស្លឹក ដែលបង្ហាញជាមីក្រូក្រាមនៃអាស៊ីតអុកស៊ីលីកក្នុងមួយក្រាមនៃទម្ងន់ស្រស់ (μg.g−1 FW) ត្រូវបានកំណត់ដោយប្រើខ្សែកោងក្រិតតាមខ្នាតអាស៊ីតអុកស៊ីលីក (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA)។
ពេញមួយការសិក្សា ការពិសោធន៍ទាំងអស់ត្រូវបានរចនាឡើងក្នុងការរចនាចៃដន្យទាំងស្រុង (CRD) ជាមួយនឹងការចម្លងជីវសាស្រ្តចំនួនប្រាំមួយក្នុងមួយការព្យាបាល និងផើងចំនួនប្រាំក្នុងមួយការចម្លងជីវសាស្រ្ត (រុក្ខជាតិពីរក្នុងមួយផើង) លុះត្រាតែមានការបញ្ជាក់ផ្សេងពីនេះ។ ការចម្លងជីវសាស្រ្តត្រូវបានវិភាគជាពីរច្បាប់ (ការចម្លងបច្ចេកទេសពីរ)។ ការចម្លងបច្ចេកទេសត្រូវបានប្រើដើម្បីពិនិត្យមើលភាពអាចបង្កើតឡើងវិញបាននៃការពិសោធន៍ដូចគ្នា ប៉ុន្តែមិនត្រូវបានប្រើក្នុងការវិភាគស្ថិតិដើម្បីជៀសវាងការចម្លងមិនពិតនោះទេ។ ទិន្នន័យត្រូវបានវិភាគតាមស្ថិតិដោយប្រើការវិភាគភាពខុសគ្នា (ANOVA) បន្ទាប់មកដោយការធ្វើតេស្ត Tukey-Kramer ភាពខុសគ្នាដ៏សំខាន់ដោយស្មោះត្រង់ (HSD) (p ≤ 0.05)។ សម្រាប់ការពិសោធន៍ក្នុងវីត្រូ តម្លៃ IC50 និង IC99 ត្រូវបានគណនាដោយប្រើគំរូប្រូប៊ីត ហើយចន្លោះជឿជាក់ 95% ត្រូវបានគណនា។
អ៊ីសូឡង់សរុបចំនួនបួនត្រូវបានប្រមូលពីចម្ការសណ្តែកសៀងផ្សេងៗគ្នានៅក្នុងខេត្ត El Ghabiya ប្រទេសអេហ្ស៊ីប។ នៅលើឧបករណ៍ផ្ទុក PDA អ៊ីសូឡង់ទាំងអស់បានផលិតមីសេលីញ៉ូមពណ៌សក្រែម ដែលប្រែជាពណ៌សដូចសំឡីយ៉ាងឆាប់រហ័ស (រូបភាពទី 1A) ហើយបន្ទាប់មកមានពណ៌បន៍ត្នោតខ្ចី ឬពណ៌ត្នោតនៅដំណាក់កាល sclerotium។ Sclerotia ជាធម្មតាមានដង់ស៊ីតេខ្ពស់ ខ្មៅ ស្វ៊ែរ ឬមានរាងមិនទៀងទាត់ មានប្រវែងពី 5.2 ទៅ 7.7 មីលីម៉ែត្រ និងមានអង្កត់ផ្ចិតពី 3.4 ទៅ 5.3 មីលីម៉ែត្រ (រូបភាពទី 1B)។ ទោះបីជាអ៊ីសូឡង់ចំនួនបួនបានបង្កើតលំនាំគែមនៃ sclerotia នៅគែមនៃឧបករណ៍ផ្ទុកវប្បធម៌បន្ទាប់ពីការភ្ញាស់រយៈពេល 10-12 ថ្ងៃនៅសីតុណ្ហភាព 25 ± 2°C (រូបភាពទី 1A) ក៏ដោយ ចំនួន sclerotia ក្នុងមួយចានគឺខុសគ្នាគួរឱ្យកត់សម្គាល់ក្នុងចំណោមពួកវា (P < 0.001) ដោយអ៊ីសូឡង់ទី 3 មានចំនួន sclerotia ខ្ពស់បំផុត (32.33 ± 1.53 sclerotia ក្នុងមួយចាន; រូបភាពទី 1C)។ ស្រដៀងគ្នានេះដែរ អ៊ីសូឡង់លេខ 3 បានផលិតអាស៊ីតអុកស៊ីលីកច្រើនជាងនៅក្នុង PDB ជាងអ៊ីសូឡង់ផ្សេងទៀត (3.33 ± 0.49 μg.mL−1; រូបភាពទី 1D)។ អ៊ីសូឡង់លេខ 3 បានបង្ហាញពីលក្ខណៈរូបវិទ្យា និងមីក្រូទស្សន៍ធម្មតានៃផ្សិតបង្កជំងឺរុក្ខជាតិ Sclerotinia sclerotiorum។ ឧទាហរណ៍ នៅលើ PDA អាណានិគមនៃអ៊ីសូឡង់លេខ 3 លូតលាស់យ៉ាងឆាប់រហ័ស មានពណ៌សក្រែម (រូបភាពទី 1A) ពណ៌បន៍ត្នោតខ្ចី ឬពណ៌លឿងត្នោតស្រាល ហើយត្រូវការពេល 6-7 ថ្ងៃនៅសីតុណ្ហភាព 25 ± 2°C ដើម្បីគ្របដណ្តប់លើផ្ទៃចានដែលមានអង្កត់ផ្ចិត 9 សង់ទីម៉ែត្រទាំងស្រុង។ ដោយផ្អែកលើលក្ខណៈរូបវិទ្យា និងមីក្រូទស្សន៍ខាងលើ អ៊ីសូឡង់លេខ 3 ត្រូវបានកំណត់ថាជា Sclerotinia sclerotiorum។
រូបភាពទី 1. លក្ខណៈ និងភាពបង្កជំងឺនៃបាក់តេរី S. sclerotiorum ពីដំណាំសណ្តែកធម្មតា។ (ក) ការលូតលាស់មីសែលនៃបាក់តេរី S. sclerotiorum ចំនួនបួននៅលើឧបករណ៍ផ្ទុក PDA, (ខ) sclerotia នៃបាក់តេរី S. sclerotiorum ចំនួនបួន, (គ) ចំនួន sclerotia (ក្នុងមួយចាន), (ឃ) ការបញ្ចេញអាស៊ីតអុកស៊ីលិកនៅលើឧបករណ៍ផ្ទុក PDB (μg.mL−1), និង (ង) ភាពធ្ងន់ធ្ងរនៃជំងឺ (%) នៃបាក់តេរី S. sclerotiorum ចំនួនបួននៅលើដំណាំសណ្តែកពាណិជ្ជកម្ម Giza 3 ដែលងាយរងគ្រោះក្រោមលក្ខខណ្ឌផ្ទះកញ្ចក់។ តម្លៃតំណាងឱ្យមធ្យម ± SD នៃការចម្លងជីវសាស្រ្តចំនួនប្រាំ (n = 5)។ អក្សរផ្សេងៗគ្នាបង្ហាញពីភាពខុសគ្នាគួរឱ្យកត់សម្គាល់ខាងស្ថិតិរវាងការព្យាបាល (p < 0.05)។ (F–H) រោគសញ្ញាផ្សិតពណ៌សធម្មតាបានលេចឡើងនៅលើដើមខាងលើដី និងដើម siliques រៀងគ្នា 10 ថ្ងៃបន្ទាប់ពីចាក់វ៉ាក់សាំងជាមួយបាក់តេរី #3 (dpi)។ (I) ការវិភាគវិវត្តន៍នៃតំបន់ចន្លោះចម្លងខាងក្នុង (ITS) នៃអ៊ីសូឡង់ S. sclerotiorum #3 ត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើវិធីសាស្ត្រទំនងអតិបរមា ហើយបានប្រៀបធៀបជាមួយអ៊ីសូឡង់/ពូជយោងចំនួន 20 ដែលទទួលបានពីមូលដ្ឋានទិន្នន័យមជ្ឈមណ្ឌលជាតិសម្រាប់ព័ត៌មានជីវបច្ចេកវិទ្យា (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)។ លេខខាងលើបន្ទាត់ចង្កោមបង្ហាញពីការគ្របដណ្តប់តំបន់ (%) ហើយលេខខាងក្រោមបន្ទាត់ចង្កោមបង្ហាញពីប្រវែងមែក។
លើសពីនេះ ដើម្បីបញ្ជាក់ពីភាពបង្កជំងឺ មេរោគ S. sclerotiorum ចំនួនបួនដែលទទួលបានត្រូវបានប្រើដើម្បីចាក់វ៉ាក់សាំងលើដំណាំសណ្តែក Giza 3 ដែលងាយនឹងឆ្លងជំងឺ ក្រោមលក្ខខណ្ឌផ្ទះកញ្ចក់ ដែលស្របនឹងសម្មតិកម្មរបស់ Koch (រូបភាពទី 1E)។ ទោះបីជាមេរោគផ្សិតដែលទទួលបានទាំងអស់គឺជាមេរោគបង្កជំងឺ ហើយអាចឆ្លងដល់សណ្តែកបៃតង (cv. Giza 3) ដែលបណ្តាលឱ្យមានរោគសញ្ញាផ្សិតពណ៌សធម្មតាលើផ្នែកទាំងអស់ខាងលើដី (រូបភាពទី 1F) ជាពិសេសលើដើម (រូបភាពទី 1G) និងផ្លែ (រូបភាពទី 1H) នៅ 10 ថ្ងៃបន្ទាប់ពីចាក់វ៉ាក់សាំង (dpi) មេរោគទី 3 គឺជាមេរោគដែលឈ្លានពានបំផុតនៅក្នុងការពិសោធន៍ឯករាជ្យពីរ។ មេរោគទី 3 មានភាពធ្ងន់ធ្ងរនៃជំងឺខ្ពស់បំផុត (%) លើដើមសណ្តែក (24.0 ± 4.0, 58.0 ± 2.0 និង 76.7 ± 3.1 នៅ 7, 14 និង 21 ថ្ងៃបន្ទាប់ពីឆ្លងជំងឺរៀងៗខ្លួន; រូបភាពទី 1F)។
ការកំណត់អត្តសញ្ញាណនៃអ៊ីសូឡង់ S. sclerotiorum #3 ដែលរាតត្បាតបំផុត ត្រូវបានបញ្ជាក់បន្ថែមទៀតដោយផ្អែកលើលំដាប់លំដោយប្រតិចារិកខាងក្នុង (ITS) (រូបភាពទី 1I)។ ការវិភាគពង្សាវតាររវាងអ៊ីសូឡង់ #3 និងអ៊ីសូឡង់/ពូជយោងចំនួន 20 បានបង្ហាញពីភាពស្រដៀងគ្នាខ្ពស់ (>99%) រវាងពួកវា។ គួរកត់សម្គាល់ថា អ៊ីសូឡង់ S. sclerotiorum #3 (533 bp) មានភាពស្រដៀងគ្នាខ្ពស់ទៅនឹងអ៊ីសូឡង់ S. sclerotiorum របស់អាមេរិក LPM36 ដែលញែកចេញពីគ្រាប់សណ្តែកស្ងួត (លេខចូល GenBank MK896659.1; 540 bp) និងអ៊ីសូឡង់ S. sclerotiorum របស់ចិន YKY211 (លេខចូល GenBank OR206374.1; 548 bp) ដែលបណ្តាលឱ្យរលួយដើមស្វាយ (Matthiola incana) ដែលទាំងអស់នេះត្រូវបានដាក់ជាក្រុមដាច់ដោយឡែកនៅផ្នែកខាងលើនៃ dendrogram (រូបភាពទី 1I)។ លំដាប់ថ្មីនេះត្រូវបានរក្សាទុកនៅក្នុងមូលដ្ឋានទិន្នន័យ NCBI ហើយដាក់ឈ្មោះថា "Sclerotinia sclerotiorum – isolate YN-25" (លេខចូលប្រើប្រាស់ GenBank PV202792)។ យើងអាចមើលឃើញថា isolate 3 គឺជា isolate ដែលឈ្លានពានបំផុត។ ដូច្នេះ isolate នេះត្រូវបានជ្រើសរើសសម្រាប់ការសិក្សានៅក្នុងការពិសោធន៍ជាបន្តបន្ទាប់ទាំងអស់។
សកម្មភាព​ប្រឆាំង​បាក់តេរី​របស់ diamine L-ornithine (Sigma-Aldrich, Darmstadt, អាល្លឺម៉ង់) នៅ​កំហាប់​ផ្សេងៗ​គ្នា (12.5, 25, 50, 75, 100 និង 125 mg/L) ប្រឆាំង​នឹង S. sclerotiorum isolate 3 ត្រូវ​បាន​ស៊ើបអង្កេត​នៅ​ក្នុង​វីត្រូ។ គួរ​កត់​សម្គាល់​ថា L-ornithine បាន​បញ្ចេញ​ឥទ្ធិពល​ប្រឆាំង​បាក់តេរី និង​រារាំង​ការ​លូតលាស់​រ៉ាឌីកាល់​របស់ S. sclerotiorum hyphae បន្តិច​ម្តងៗ​តាម​របៀប​អាស្រ័យ​លើ​កម្រិត​ថ្នាំ (រូបភាពទី 2A, B)។ នៅ​កំហាប់​ខ្ពស់​បំផុត​ដែល​បាន​ធ្វើ​តេស្ត (125 mg/L) L-ornithine បាន​បង្ហាញ​អត្រា​រារាំង​ការ​លូតលាស់​នៃ​ផ្សិត​ខ្ពស់​បំផុត (99.62 ± 0.27%; រូបភាពទី 2B) ដែល​ស្មើនឹង​ថ្នាំ​សម្លាប់​ផ្សិត Rizolex-T ដែល​ជា​ផលិតផល​ពាណិជ្ជកម្ម (អត្រា​ទប់ស្កាត់ 99.45 ± 0.39%; រូបភាពទី 2C) នៅ​កំហាប់​ខ្ពស់​បំផុត​ដែល​បាន​ធ្វើ​តេស្ត (10 mg/L) ដែល​បង្ហាញ​ពី​ប្រសិទ្ធភាព​ស្រដៀង​គ្នា។
រូបភាពទី 2. សកម្មភាពប្រឆាំងបាក់តេរីក្នុងវីត្រូរបស់ L-ornithine ប្រឆាំងនឹង Sclerotinia sclerotiorum។ (ក) ការប្រៀបធៀបសកម្មភាពប្រឆាំងបាក់តេរីនៃកំហាប់ផ្សេងៗគ្នានៃ L-ornithine ប្រឆាំងនឹង S. sclerotiorum ជាមួយនឹងថ្នាំសម្លាប់ផ្សិតពាណិជ្ជកម្ម Rizolex-T (10 មីលីក្រាម/លីត្រ)។ (ខ, គ) អត្រារារាំង (%) នៃការលូតលាស់ផ្សិត S. sclerotiorum បន្ទាប់ពីការព្យាបាលជាមួយនឹងកំហាប់ផ្សេងៗគ្នានៃ L-ornithine (12.5, 25, 50, 75, 100 និង 125 មីលីក្រាម/លីត្រ) ឬ Rizolex-T (2, 4, 6, 8 និង 10 មីលីក្រាម/លីត្រ) រៀងៗខ្លួន។ តម្លៃតំណាងឱ្យមធ្យម ± SD នៃការចម្លងជីវសាស្រ្តចំនួនប្រាំ (n = 5)។ អក្សរផ្សេងៗគ្នាបង្ហាញពីភាពខុសគ្នាខាងស្ថិតិរវាងការព្យាបាល (p < 0.05)។ (ឃ, ង) ការវិភាគតំរែតំរង់គំរូ Probit នៃ L-ornithine និងថ្នាំសម្លាប់ផ្សិតពាណិជ្ជកម្ម Rizolex-T រៀងៗខ្លួន។ ខ្សែបន្ទាត់តំរែតំរង់គំរូប្រូប៊ីតត្រូវបានបង្ហាញជាខ្សែបន្ទាត់ពណ៌ខៀវរឹង ហើយចន្លោះជឿជាក់ (95%) ត្រូវបានបង្ហាញជាខ្សែបន្ទាត់ពណ៌ក្រហមចំនុចៗ។
លើសពីនេះ ការវិភាគតំរែតំរង់ប្រូប៊ីតត្រូវបានអនុវត្ត ហើយគ្រោងដែលត្រូវគ្នាត្រូវបានបង្ហាញក្នុងតារាងទី 1 និងរូបភាពទី 2D,E។ សរុបមក តម្លៃជម្រាលដែលអាចទទួលយកបាន (y = 2.92x − 4.67) និងស្ថិតិសំខាន់ៗដែលពាក់ព័ន្ធ (Cox & Snell R2 = 0.3709, Nagelkerke R2 = 0.4998 និង p < 0.0001; រូបភាពទី 2D) នៃ L-ornithine បានបង្ហាញពីសកម្មភាពប្រឆាំងនឹងផ្សិតដែលប្រសើរឡើងប្រឆាំងនឹង S. sclerotiorum បើប្រៀបធៀបទៅនឹងថ្នាំសម្លាប់ផ្សិត Rizolex-T (y = 1.96x − 0.99, Cox & Snell R2 = 0.1242, Nagelkerke R2 = 0.1708 និង p < 0.0001) (តារាងទី 1)។
តារាងទី 1. តម្លៃនៃកំហាប់រារាំងពាក់កណ្តាលអតិបរមា (IC50) និង IC99 (មីលីក្រាម/លីត្រ) នៃ L-ornithine និងថ្នាំសម្លាប់ផ្សិតពាណិជ្ជកម្ម "Rizolex-T" ប្រឆាំងនឹង S. sclerotiorum។
ជារួម L-ornithine (250 mg/L) បានកាត់បន្ថយការវិវត្ត និងភាពធ្ងន់ធ្ងរនៃផ្សិតពណ៌សលើដើមសណ្តែកធម្មតាដែលបានព្យាបាលយ៉ាងសំខាន់ បើប្រៀបធៀបទៅនឹងដើមសណ្តែកដែលឆ្លងមេរោគ S. sclerotiorum ដែលមិនបានព្យាបាល (ក្រុមត្រួតពិនិត្យ; រូបភាពទី 3A)។ ជាសង្ខេប ទោះបីជាភាពធ្ងន់ធ្ងរនៃជំងឺនៃដើមសណ្តែកដែលឆ្លងមេរោគដែលមិនបានព្យាបាលបានកើនឡើងជាលំដាប់ (52.67 ± 1.53, 83.21 ± 2.61 និង 92.33 ± 3.06%) ក៏ដោយ L-ornithine បានកាត់បន្ថយភាពធ្ងន់ធ្ងរនៃជំងឺ (%) យ៉ាងសំខាន់ពេញមួយការពិសោធន៍ (8.97 ± 0.15, 18.00 ± 1.00 និង 26.36 ± 3.07) នៅថ្ងៃទី 7, 14 និង 21 ថ្ងៃបន្ទាប់ពីការព្យាបាល (dpt) រៀងៗខ្លួន (រូបភាពទី 3A)។ ស្រដៀងគ្នានេះដែរ នៅពេលដែលដើមសណ្តែកដែលឆ្លងមេរោគ S. sclerotiorum ត្រូវបានព្យាបាលដោយ L-ornithine 250 mg/L តំបន់ក្រោមខ្សែកោងវឌ្ឍនភាពនៃជំងឺ (AUDPC) បានថយចុះពី 1274.33 ± 33.13 នៅក្នុងការគ្រប់គ្រងដែលមិនបានព្យាបាល មកត្រឹម 281.03 ± 7.95 ដែលទាបជាងបន្តិចនៃការគ្រប់គ្រងវិជ្ជមាន 50 mg/L ថ្នាំសម្លាប់ផ្សិត Rizolex-T (183.61 ± 7.71; រូបភាពទី 3B)។ និន្នាការដូចគ្នានេះត្រូវបានគេសង្កេតឃើញនៅក្នុងការពិសោធន៍ទីពីរ។
រូបភាពទី 3. ឥទ្ធិពលនៃការប្រើប្រាស់ L-ornithine ពីខាងក្រៅទៅលើការវិវត្តនៃជំងឺរលួយសនៃសណ្តែកធម្មតាដែលបណ្តាលមកពី Sclerotinia sclerotiorum ក្រោមលក្ខខណ្ឌផ្ទះកញ្ចក់។ (ក) ខ្សែកោងវឌ្ឍនភាពនៃជំងឺនៃផ្សិតសនៃសណ្តែកធម្មតាបន្ទាប់ពីការព្យាបាលដោយ L-ornithine 250 មីលីក្រាម/លីត្រ។ (ខ) ផ្ទៃក្រោមខ្សែកោងវឌ្ឍនភាពជំងឺ (AUDPC) នៃផ្សិតសនៃសណ្តែកធម្មតាបន្ទាប់ពីការព្យាបាលដោយ L-ornithine។ តម្លៃតំណាងឱ្យមធ្យម ± SD នៃការចម្លងជីវសាស្រ្តចំនួនប្រាំ (n = 5)។ អក្សរផ្សេងៗគ្នាបង្ហាញពីភាពខុសគ្នាគួរឱ្យកត់សម្គាល់ខាងស្ថិតិរវាងការព្យាបាល (p < 0.05)។
ការប្រើប្រាស់ L-ornithine កម្រិត 250 mg/L ពីខាងក្រៅ បានបង្កើនកម្ពស់រុក្ខជាតិបន្តិចម្តងៗ (រូបភាពទី 4A) ចំនួនមែកក្នុងមួយរុក្ខជាតិ (រូបភាពទី 4B) និងចំនួនស្លឹកក្នុងមួយរុក្ខជាតិ (រូបភាពទី 4C) បន្ទាប់ពីរយៈពេល 42 ថ្ងៃ។ ខណៈពេលដែលថ្នាំសម្លាប់ផ្សិត Rizolex-T (50 mg/L) ដែលមានមូលដ្ឋានលើពាណិជ្ជកម្ម មានឥទ្ធិពលបំផុតលើប៉ារ៉ាម៉ែត្រអាហារូបត្ថម្ភទាំងអស់ដែលបានសិក្សា ការប្រើប្រាស់ L-ornithine កម្រិត 250 mg/L ពីខាងក្រៅ មានឥទ្ធិពលធំបំផុតទីពីរ បើប្រៀបធៀបទៅនឹងក្រុមត្រួតពិនិត្យដែលមិនបានព្យាបាល (រូបភាពទី 4A–C)។ ម្យ៉ាងវិញទៀត ការព្យាបាលដោយ L-ornithine មិនមានឥទ្ធិពលគួរឱ្យកត់សម្គាល់លើមាតិកានៃសារធាតុពណ៌រស្មីសំយោគ chlorophyll a (រូបភាពទី 4D) និង chlorophyll b (រូបភាពទី 4E) ទេ ប៉ុន្តែបានបង្កើនមាតិកា carotenoid សរុបបន្តិច (0.56 ± 0.03 mg/g fr wt) បើប្រៀបធៀបទៅនឹងក្រុមត្រួតពិនិត្យអវិជ្ជមាន (0.44 ± 0.02 mg/g fr wt) និងក្រុមត្រួតពិនិត្យវិជ្ជមាន (0.46 ± 0.02 mg/g fr wt; រូបភាពទី 4F)។ ជារួម លទ្ធផលទាំងនេះបង្ហាញថា L-ornithine មិនមានជាតិពុលរុក្ខជាតិចំពោះសណ្តែកដែលត្រូវបានព្យាបាលទេ ហើយថែមទាំងអាចជំរុញការលូតលាស់របស់វាទៀតផង។
រូបភាពទី៤. ឥទ្ធិពលនៃការប្រើប្រាស់ L-ornithine ពីខាងក្រៅទៅលើលក្ខណៈលូតលាស់ និងសារធាតុពណ៌រស្មីសំយោគនៃស្លឹកសណ្តែកដែលឆ្លងមេរោគ Sclerotinia sclerotiorum ក្រោមលក្ខខណ្ឌផ្ទះកញ្ចក់។ (ក) កម្ពស់រុក្ខជាតិ (សង់ទីម៉ែត្រ), (ខ) ចំនួនមែកក្នុងមួយរុក្ខជាតិ, (គ) ចំនួនស្លឹកក្នុងមួយរុក្ខជាតិ, (ឃ) មាតិកាក្លរ៉ូហ្វីល a (មីលីក្រាម ក្រាម-១ ពេញទម្ងន់), (ង) មាតិកាក្លរ៉ូហ្វីល b (មីលីក្រាម ក្រាម-១ ពេញទម្ងន់), (ច) មាតិកាការ៉ូទីណូអ៊ីតសរុប (មីលីក្រាម ក្រាម-១ ពេញទម្ងន់)។ តម្លៃគឺជាមធ្យម ± SD នៃការចម្លងជីវសាស្រ្តចំនួនប្រាំ (n = 5)។ អក្សរផ្សេងៗគ្នាបង្ហាញពីភាពខុសគ្នាគួរឱ្យកត់សម្គាល់ខាងស្ថិតិរវាងការព្យាបាល (p < 0.05)។
ការកំណត់ទីតាំង​អ៊ីស្តូគីមី​នៅនឹងកន្លែង​នៃប្រភេទអុកស៊ីសែនដែលមានប្រតិកម្ម (ROS; បង្ហាញជាអ៊ីដ្រូសែនប៉េរ៉ុកស៊ីត [H2O2]) និងរ៉ាឌីកាល់សេរី (បង្ហាញជាអានីយ៉ុងស៊ុយភឺរអុកស៊ីត [O2•−]) បានបង្ហាញថា ការប្រើប្រាស់ L-ornithine (250 mg/L) ពីខាងក្រៅ បានកាត់បន្ថយការប្រមូលផ្តុំ H2O2 (96.05 ± 5.33 nmol.g−1 FW; រូបភាពទី 5A) និង O2•− (32.69 ± 8.56 nmol.g−1 FW; រូបភាពទី 5B) យ៉ាងខ្លាំង បើប្រៀបធៀបទៅនឹងការប្រមូលផ្តុំនៃរុក្ខជាតិដែលឆ្លងមេរោគដែលមិនបានព្យាបាល (173.31 ± 12.06 និង 149.35 ± 7.94 nmol.g−1 FW រៀងគ្នា) និងរុក្ខជាតិដែលត្រូវបានព្យាបាលដោយថ្នាំសម្លាប់ផ្សិត Rizolex-T កម្រិត 50 mg/L (170.12 ± 9.50 និង 157.00 ± 7.81 nmol.g−1 fr wt រៀងគ្នា) នៅ 72 ម៉ោង។ កម្រិតខ្ពស់នៃ H2O2 និង O2•− បានប្រមូលផ្តុំនៅក្រោម hpt (រូបភាពទី 5A, B)។ ស្រដៀងគ្នានេះដែរ ការវិភាគ malondialdehyde (MDA) ដែលមានមូលដ្ឋានលើ TCA បានបង្ហាញថា ដើមសណ្តែកដែលឆ្លងមេរោគ S. sclerotiorum បានប្រមូលផ្តុំកម្រិតខ្ពស់នៃ MDA (113.48 ± 10.02 nmol.g fr wt) នៅក្នុងស្លឹករបស់វា (រូបភាពទី 5C)។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ ការប្រើប្រាស់ L-ornithine ពីខាងក្រៅបានកាត់បន្ថយការកត់សុី lipid យ៉ាងច្រើន ដូចដែលបានបង្ហាញដោយការថយចុះនៃមាតិកា MDA នៅក្នុងរុក្ខជាតិដែលបានព្យាបាល (33.08 ± 4.00 nmol.g fr wt)។
រូបភាពទី 5. ឥទ្ធិពលនៃការប្រើប្រាស់ L-ornithine ពីខាងក្រៅលើសញ្ញាសម្គាល់សំខាន់ៗនៃភាពតានតឹងអុកស៊ីតកម្ម និងយន្តការការពារប្រឆាំងអុកស៊ីតកម្មមិនមែនអង់ស៊ីមនៅក្នុងស្លឹកសណ្តែកដែលឆ្លងមេរោគ S. sclerotiorum នៅ 72 ម៉ោងបន្ទាប់ពីការឆ្លងមេរោគក្រោមលក្ខខណ្ឌផ្ទះកញ្ចក់។ (ក) អ៊ីដ្រូសែនប៉េរ៉ុកស៊ីត (H2O2; nmol g−1 FW) នៅ 72 hpt, (ខ) អ៊ីយ៉ុងស៊ុយពែរអុកស៊ីត (O2•−; nmol g−1 FW) នៅ 72 hpt, (គ) ម៉ាឡុនឌីអាល់ដេអ៊ីត (MDA; nmol g−1 FW) នៅ 72 hpt, (ឃ) ហ្វេណុលរលាយសរុប (មីលីក្រាម GAE g−1 FW) នៅ 72 hpt, (ង) ហ្វ្លាវ៉ូណូអ៊ីតរលាយសរុប (មីលីក្រាម RE g−1 FW) នៅ 72 hpt, (ហ្វ) អាស៊ីតអាមីណូសេរីសរុប (មីលីក្រាម g−1 FW) នៅ 72 hpt, និង (គ) មាតិកាប្រូលីន (មីលីក្រាម g−1 FW) នៅ 72 hpt។ តម្លៃតំណាងឱ្យមធ្យម ± គម្លាតស្តង់ដារ (មធ្យម ± SD) នៃចម្លងជីវសាស្រ្តចំនួន 5 (n = 5)។ អក្សរផ្សេងៗគ្នាបង្ហាញពីភាពខុសគ្នាគួរឱ្យកត់សម្គាល់ខាងស្ថិតិរវាងការព្យាបាល (p < 0.05)។