ពីមុនយើងបានរាយការណ៍ថា កម្រិតសេរ៉ូមនៃសារធាតុរំលាយ tryptophan ដែលមានប្រភពមកពីពោះវៀន indole-3-propionic acid (IPA) គឺទាបជាងចំពោះអ្នកជំងឺដែលមានជំងឺក្រិនថ្លើម។ នៅក្នុងការសិក្សានេះ យើងបានស៊ើបអង្កេត transcriptome និង DNA methylome នៅក្នុងថ្លើមធាត់ទាក់ទងនឹងកម្រិត IPA ក្នុងសេរ៉ូម ក៏ដូចជាតួនាទីរបស់ IPA ក្នុងការជំរុញឱ្យមានភាពអសកម្មនៃ phenotype នៃកោសិកា hepatic stellate (HSCs) នៅក្នុង vitro។
ការសិក្សានេះរួមមានអ្នកជំងឺធាត់ចំនួន 116 នាក់ដែលមិនមានជំងឺទឹកនោមផ្អែមប្រភេទទី 2 (T2DM) (អាយុ 46.8 ± 9.3 ឆ្នាំ; BMI: 42.7 ± 5.0 គីឡូក្រាម/ម៉ែត្រការ៉េ) ដែលបានទទួលការវះកាត់ bariatric នៅមជ្ឈមណ្ឌលវះកាត់ bariatric Kuopio (KOBS)។ កម្រិត IPA ក្នុងចរន្តឈាមត្រូវបានវាស់ដោយសារធាតុរាវ chromatography-mass spectrometry (LC-MS) ការវិភាគ transcriptome ថ្លើមត្រូវបានអនុវត្តដោយ sequencing RNA សរុប និងការវិភាគ methylation DNA ត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើ Infinium HumanMethylation450 BeadChip។ កោសិកា stellate ថ្លើមរបស់មនុស្ស (LX-2) ត្រូវបានប្រើសម្រាប់ការពិសោធន៍ក្នុង vitro។
កម្រិត IPA ក្នុងសេរ៉ូមមានទំនាក់ទំនងជាមួយនឹងការបញ្ចេញហ្សែនដែលពាក់ព័ន្ធនឹងផ្លូវ apoptosis, mitophagic និង lifespan នៅក្នុងថ្លើម។ ហ្សែន AKT serine/threonine kinase 1 (AKT1) គឺជាហ្សែនអន្តរកម្មដែលមានច្រើនបំផុត និងលេចធ្លោបំផុតនៅក្នុងទម្រង់ប្រតិចារិកថ្លើម និងទម្រង់មេទីឡាស្យុង DNA។ ការព្យាបាលដោយ IPA បានបង្កឱ្យមាន apoptosis ការថយចុះនៃការដកដង្ហើមមីតូខនឌ្រី និងការផ្លាស់ប្តូររូបរាងកោសិកា និងឌីណាមិកមីតូខនឌ្រី ដោយការកែប្រែការបញ្ចេញហ្សែនដែលគេស្គាល់ថាគ្រប់គ្រង fibrosis ការថយចុះ apoptosis និងការរស់រានមានជីវិតរបស់កោសិកា LX-2។
ប្រសិនបើយើងពិចារណាលើទិន្នន័យទាំងនេះរួមគ្នា ទិន្នន័យទាំងនេះគាំទ្រថា IPA មានប្រសិទ្ធភាពព្យាបាលដ៏មានសក្តានុពល និងអាចបង្កឱ្យមាន apoptosis និងផ្លាស់ប្តូរ phenotype HSC ទៅជាសភាពអសកម្ម ដោយហេតុនេះពង្រីកលទ្ធភាពនៃការទប់ស្កាត់ fibrosis ថ្លើមដោយជ្រៀតជ្រែកជាមួយនឹងការធ្វើឱ្យសកម្ម HSC និងការរំលាយអាហារមីតូខនឌ្រី។
ភាព​រីក​រាលដាល​នៃ​ភាព​ធាត់​ជ្រុល និង​រោគសញ្ញា​មេតាបូលីស ត្រូវ​បាន​ផ្សារភ្ជាប់​ជាមួយ​នឹង​ការ​កើនឡើង​នៃ​ជំងឺ​ថ្លើម​ខ្លាញ់​ដែល​ទាក់ទង​នឹង​មេតាបូលីស (MASLD)។ ជំងឺ​នេះ​ប៉ះពាល់​ដល់ 25% ទៅ 30% នៃ​ចំនួន​ប្រជាជន​ទូទៅ [1]។ ផលវិបាក​ចម្បង​នៃ​មូលហេតុ MASLD គឺ​ជំងឺ​សរសៃ​ថ្លើម ដែល​ជា​ដំណើរការ​ថាមវន្ត​ដែល​មាន​លក្ខណៈ​ដោយ​ការ​ប្រមូលផ្តុំ​ជា​បន្តបន្ទាប់​នៃ​ម៉ាទ្រីស​ក្រៅ​កោសិកា​សរសៃ (ECM) [2]។ កោសិកា​សំខាន់ៗ​ដែល​ពាក់ព័ន្ធ​នឹង​ជំងឺ​ថ្លើម​សរសៃ​គឺ​កោសិកា​ស្តាឡាត​ថ្លើម (HSCs) ដែល​បង្ហាញ​លក្ខណៈ​បួន​យ៉ាង​ដែល​គេ​ស្គាល់៖ ស្ងប់ សកម្ម អសកម្ម និង​ចាស់ [3, 4]។ HSCs អាច​ត្រូវ​បាន​ធ្វើឱ្យ​សកម្ម និង​ឆ្លង​ពី​ទម្រង់​ស្ងប់​ទៅ​ជា​កោសិកា​ដូច​សរសៃ​រីក​លូតលាស់​ដែល​មាន​តម្រូវការ​ថាមពល​ខ្ពស់ ជាមួយនឹង​ការ​កើនឡើង​នៃ​អាកទីន​សាច់ដុំ​រលោង α (α-SMA) និង​កូឡាជែន​ប្រភេទ I (Col-I) [5, 6]។ អំឡុងពេល​បញ្ច្រាស់​ជំងឺ​សរសៃ​ថ្លើម HSCs ដែល​បាន​ធ្វើ​ឱ្យ​សកម្ម​ត្រូវ​បាន​លុប​បំបាត់​តាមរយៈ​អាប៉ុបតូស៊ីស ឬ​អសកម្ម។ ដំណើរការទាំងនេះរួមមាន ការថយចុះនៃហ្សែន fibrogenic និងការកែប្រែហ្សែន prosurvival (ដូចជាផ្លូវសញ្ញា NF-κB និង PI3K/Akt) [7, 8] ក៏ដូចជាការផ្លាស់ប្តូរនៅក្នុងឌីណាមិក និងមុខងារមីតូខនឌ្រី [9]។
កម្រិតសេរ៉ូមនៃសារធាតុរំលាយ tryptophan indole-3-propionic acid (IPA) ដែលផលិតនៅក្នុងពោះវៀន ត្រូវបានគេរកឃើញថាមានការថយចុះនៅក្នុងជំងឺមេតាបូលីសរបស់មនុស្ស រួមទាំង MASLD [10–13]។ IPA ត្រូវបានផ្សារភ្ជាប់ជាមួយនឹងការទទួលទានជាតិសរសៃអាហារ ត្រូវបានគេស្គាល់ថាមានឥទ្ធិពលប្រឆាំងអុកស៊ីតកម្ម និងប្រឆាំងនឹងការរលាក ហើយកាត់បន្ថយរោគសញ្ញារលាកថ្លើមដែលមិនមានជាតិអាល់កុល (NASH) ដែលបង្កឡើងដោយរបបអាហារនៅក្នុង vivo និង in vitro [11–14]។ ភស្តុតាងមួយចំនួនបានមកពីការសិក្សាពីមុនរបស់យើង ដែលបានបង្ហាញថាកម្រិត IPA ក្នុងសេរ៉ូមមានកម្រិតទាបជាងចំពោះអ្នកជំងឺដែលមានជំងឺថ្លើម ជាងអ្នកជំងឺធាត់ដែលមិនមានជំងឺថ្លើម នៅក្នុងការសិក្សាវះកាត់ Bariatric Kuopio (KOBS)។ លើសពីនេះ យើងបានបង្ហាញថាការព្យាបាលដោយ IPA អាចកាត់បន្ថយការបញ្ចេញហ្សែនដែលជាសញ្ញាសម្គាល់បុរាណនៃការស្អិតជាប់កោសិកា ការធ្វើចំណាកស្រុកកោសិកា និងការធ្វើឱ្យសកម្មកោសិកាដើម hematopoietic នៅក្នុងគំរូកោសិកា hepatostellate របស់មនុស្ស (LX-2) ហើយវាជាសារធាតុរំលាយការពារថ្លើមដែលមានសក្តានុពល [15]។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ វានៅតែមិនច្បាស់ថាតើ IPA បង្កឱ្យមានការថយចុះនៃជាលិកាថ្លើមដោយការធ្វើឱ្យសកម្ម apoptosis របស់ HSC និងជីវថាមពលមីតូខុនឌ្រីយ៉ាងដូចម្តេច។
នៅទីនេះ យើងបង្ហាញថា សេរ៉ូម IPA ត្រូវបានផ្សារភ្ជាប់ជាមួយនឹងការបញ្ចេញហ្សែនដែលសម្បូរទៅដោយ apoptosis, mitophagy និងផ្លូវអាយុវែងនៅក្នុងថ្លើមរបស់មនុស្សធាត់ ប៉ុន្តែមិនមែនជាអ្នកជំងឺទឹកនោមផ្អែមប្រភេទទី 2 (KOBS)។ លើសពីនេះ យើងបានរកឃើញថា IPA អាចបង្កឱ្យមានការសម្អាត និងការរិចរិលនៃកោសិកាដើម hematopoietic ដែលបានធ្វើឱ្យសកម្ម (HSCs) តាមរយៈផ្លូវអសកម្ម។ លទ្ធផលទាំងនេះបង្ហាញពីតួនាទីថ្មីមួយសម្រាប់ IPA ដែលធ្វើឱ្យវាក្លាយជាគោលដៅព្យាបាលដ៏មានសក្តានុពលដើម្បីលើកកម្ពស់ការថយចុះនៃជំងឺក្រិនថ្លើម។
ការសិក្សាពីមុននៅក្នុងក្រុមអ្នកស្រាវជ្រាវ KOBS បានបង្ហាញថា អ្នកជំងឺដែលមានជំងឺសរសៃថ្លើមមានកម្រិត IPA ក្នុងឈាមទាបជាងបើប្រៀបធៀបទៅនឹងអ្នកជំងឺដែលមិនមានជំងឺសរសៃថ្លើម [15]។ ដើម្បីមិនរាប់បញ្ចូលផលប៉ះពាល់ដែលអាចកើតមាននៃជំងឺទឹកនោមផ្អែមប្រភេទទី 2 យើងបានជ្រើសរើសអ្នកជំងឺធាត់ចំនួន 116 នាក់ដែលមិនមានជំងឺទឹកនោមផ្អែមប្រភេទទី 2 (អាយុមធ្យម ± SD: 46.8 ± 9.3 ឆ្នាំ; BMI: 42.7 ± 5.0 kg/m2) (តារាងទី 1) ពីការសិក្សា KOBS ដែលកំពុងដំណើរការជាចំនួនប្រជាជនសិក្សា [16]។ អ្នកចូលរួមទាំងអស់បានផ្តល់ការយល់ព្រមជាលាយលក្ខណ៍អក្សរ ហើយពិធីសារសិក្សាត្រូវបានអនុម័តដោយគណៈកម្មាធិការសីលធម៌នៃមន្ទីរពេទ្យ North Savo County ស្របតាមសេចក្តីប្រកាស Helsinki (54/2005, 104/2008 និង 27/2010)។
សំណាក​សម្រាប់​ធ្វើ​កោសល្យវិច័យ​ថ្លើម​ត្រូវ​បាន​ទទួល​អំឡុង​ពេល​វះកាត់​សម្រក​ទម្ងន់ ហើយ​ត្រូវ​បាន​វាយតម្លៃ​តាម​ជាលិកា​វិទ្យា​ដោយ​គ្រូពេទ្យ​រោគសាស្ត្រ​ដែល​មាន​បទពិសោធន៍ យោង​តាម​លក្ខណៈ​វិនិច្ឆ័យ​ដែល​បាន​ពិពណ៌នា​ពីមុន [17, 18]។ លក្ខណៈ​វិនិច្ឆ័យ​វាយតម្លៃ​ត្រូវ​បាន​សង្ខេប​នៅ​ក្នុង​តារាង​បន្ថែម S1 ហើយ​ត្រូវ​បាន​ពិពណ៌នា​ពីមុន [19]។
គំរូសេរ៉ូមពេលតមអាហារត្រូវបានវិភាគដោយប្រើវិធីសាស្ត្រវិភាគម៉ាសក្រូម៉ាតូក្រាហ្វីរាវដែលមិនកំណត់គោលដៅ (LC-MS) សម្រាប់ការវិភាគមេតាបូឡូមិក (n = 116)។ គំរូត្រូវបានវិភាគដោយប្រើប្រព័ន្ធ UHPLC-qTOF-MS (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Karlsruhe, អាល្លឺម៉ង់) ដូចដែលបានពិពណ៌នាពីមុន19។ ការកំណត់អត្តសញ្ញាណអាល់កុលអ៊ីសូប្រូពីល (IPA) គឺផ្អែកលើពេលវេលារក្សាទុក និងការប្រៀបធៀបវិសាលគម MS/MS ជាមួយនឹងស្តង់ដារសុទ្ធ។ អាំងតង់ស៊ីតេសញ្ញា IPA (តំបន់កំពូល) ត្រូវបានពិចារណានៅក្នុងការវិភាគបន្ថែមទាំងអស់ [20]។
ការ​ធ្វើ​លំដាប់ RNA ថ្លើម​ទាំងមូល​ត្រូវ​បាន​អនុវត្ត​ដោយ​ប្រើ Illumina HiSeq 2500 ហើយ​ទិន្នន័យ​ត្រូវ​បាន​ដំណើរការ​ជាមុន​ដូច​បាន​ពិពណ៌នា​ពីមុន [19, 21, 22]។ យើង​បាន​ធ្វើ​ការ​វិភាគ​កន្សោម​ឌីផេរ៉ង់ស្យែល​គោលដៅ​នៃ​ប្រតិចារិក​ដែល​ប៉ះពាល់​ដល់​មុខងារ​មីតូខនឌ្រី/ជីវហ្សែនស៊ីស្តេ​ដោយ​ប្រើ​ហ្សែន​ចំនួន 1957 ដែល​បាន​ជ្រើសរើស​ពី​មូលដ្ឋាន​ទិន្នន័យ MitoMiner 4.0 [23]។ ការ​វិភាគ​មេទីឡាស្យុង DNA ថ្លើម​ត្រូវ​បាន​អនុវត្ត​ដោយ​ប្រើ Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina, San Diego, CA, USA) ដោយ​ប្រើ​វិធីសាស្ត្រ​ដូច​ដែល​បាន​ពិពណ៌នា​ពីមុន [24, 25]។
កោសិកា​ស្តេឡាត​ថ្លើម​របស់​មនុស្ស (LX-2) ត្រូវ​បាន​ផ្តល់​ជូន​ដោយ​លោក​សាស្ត្រាចារ្យ Stefano Romeo ដោយ​សប្បុរស ហើយ​ត្រូវ​បាន​ដាំដុះ និង​រក្សា​ទុក​ក្នុង​ឧបករណ៍​ផ្ទុក DMEM/F12 (Biowest, L0093-500, 1% Pen/Strep; Lonza, DE17-602E, 2% FBS; Gibco, 10270-106)។ ដើម្បី​ជ្រើសរើស​កម្រិត​ការងារ​របស់ IPA កោសិកា LX-2 ត្រូវ​បាន​ព្យាបាល​ដោយ​កំហាប់ IPA ផ្សេងៗ​គ្នា (10 μM, 100 μM និង 1 mM; Sigma, 220027) ក្នុង​ឧបករណ៍​ផ្ទុក DMEM/F12 រយៈពេល 24 ម៉ោង។ លើស​ពី​នេះ ដើម្បី​ស៊ើប​អង្កេត​សមត្ថភាព​របស់ IPA ក្នុង​ការ​ធ្វើ​ឲ្យ HSCs អសកម្ម កោសិកា LX-2 ត្រូវ​បាន​ព្យាបាល​រួម​ជាមួយ TGF-β1 កំហាប់ 5 ng/ml (ប្រព័ន្ធ R&D, 240-B-002/CF) និង IPA 1 mM ក្នុង​ឧបករណ៍​ផ្ទុក​ដែល​មិន​មាន​សេរ៉ូម​រយៈពេល 24 ម៉ោង។ សម្រាប់ការគ្រប់គ្រងយានយន្តដែលត្រូវគ្នា 4 nM HCL ដែលមាន BSA 0.1% ត្រូវបានប្រើសម្រាប់ការព្យាបាល TGF-β1 និង 0.05% DMSO ត្រូវបានប្រើសម្រាប់ការព្យាបាល IPA ហើយទាំងពីរត្រូវបានប្រើរួមគ្នាសម្រាប់ការព្យាបាលរួមបញ្ចូលគ្នា។
អត្រាមរណភាពកោសិកា (Apoptosis) ត្រូវបានវាយតម្លៃដោយប្រើឧបករណ៍រកឃើញអត្រាមរណភាពកោសិកា (Apoptosis) របស់ FITC Annexin V ជាមួយ 7-AAD (Biolegend, San Diego, CA, USA, Cat# 640922) ស្របតាមការណែនាំរបស់អ្នកផលិត។ ជាសង្ខេប LX-2 (កោសិកា 1 × 105/អណ្តូង) ត្រូវបានដាំដុះពេញមួយយប់ក្នុងចាន 12 អណ្តូង ហើយបន្ទាប់មកត្រូវបានព្យាបាលដោយកម្រិតថ្នាំ IPA ឬ IPA និង TGF-β1 ច្រើនដង។ នៅថ្ងៃបន្ទាប់ កោសិកាអណ្តែត និងកោសិកាស្អិតត្រូវបានប្រមូល trypsinized លាងសម្អាតជាមួយ PBS រំលាយឡើងវិញនៅក្នុងសារធាតុចង Annexin V និងភ្ញាស់ជាមួយ FITC-Annexin V និង 7-AAD រយៈពេល 15 នាទី។
មីតូខុនឌ្រីនៅក្នុងកោសិការស់ត្រូវបានជ្រលក់ពណ៌សម្រាប់សកម្មភាពអុកស៊ីតកម្មដោយប្រើ Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA)។ ចំពោះការវិភាគ MTR កោសិកា LX-2 ត្រូវបានភ្ញាស់ក្នុងដង់ស៊ីតេស្មើគ្នាជាមួយ IPA និង TGF-β1។ បន្ទាប់ពី 24 ម៉ោង កោសិការស់ត្រូវបាន trypsinized លាងសម្អាតជាមួយ PBS ហើយបន្ទាប់មកភ្ញាស់ជាមួយ 100 μM MTR នៅក្នុងឧបករណ៍ផ្សព្វផ្សាយដែលគ្មានសេរ៉ូមនៅសីតុណ្ហភាព 37 °C រយៈពេល 20 នាទីដូចដែលបានពិពណ៌នាពីមុន [26]។ ចំពោះការវិភាគរូបវិទ្យាកោសិការស់ ទំហំកោសិកា និងភាពស្មុគស្មាញនៃស៊ីតូប្លាស្មិកត្រូវបានវិភាគដោយប្រើប៉ារ៉ាម៉ែត្រ scatter ទៅមុខ (FSC) និង scatter ចំហៀង (SSC) រៀងៗខ្លួន។
ទិន្នន័យទាំងអស់ (ព្រឹត្តិការណ៍ចំនួន 30,000) ត្រូវបានទទួលដោយប្រើ NovoCyte Quanteon (Agilent) ហើយត្រូវបានវិភាគដោយប្រើកម្មវិធី NovoExpress® 1.4.1 ឬ FlowJo V.10។
អត្រាប្រើប្រាស់អុកស៊ីសែន (OCR) និងអត្រាជាតិអាស៊ីតក្រៅកោសិកា (ECAR) ត្រូវបានវាស់វែងក្នុងពេលវេលាជាក់ស្តែងដោយប្រើឧបករណ៍វិភាគលំហូរក្រៅកោសិកា Seahorse (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) ដែលបំពាក់ដោយ Seahorse XF Cell Mito Stress ស្របតាមការណែនាំរបស់អ្នកផលិត។ ជាសង្ខេប កោសិកា LX-2 ចំនួន 2 × 104/អណ្តូងត្រូវបានសាបព្រោះលើចានវប្បធម៌កោសិកា XF96។ បន្ទាប់ពីការភ្ញាស់ពេញមួយយប់ កោសិកាត្រូវបានព្យាបាលដោយអ៊ីសូប្រូផាណុល (IPA) និង TGF-β1 (វិធីសាស្ត្របន្ថែម 1)។ ការវិភាគទិន្នន័យត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើកម្មវិធី Seahorse XF Wave ដែលរួមបញ្ចូលម៉ាស៊ីនបង្កើតរបាយការណ៍តេស្តបាតុភូតថាមពលកោសិកា Seahorse XF។ ពីនេះ សន្ទស្សន៍សុខភាពជីវថាមពល (BHI) ត្រូវបានគណនា [27]។
RNA សរុបត្រូវបានចម្លងទៅជា cDNA។ សម្រាប់វិធីសាស្ត្រជាក់លាក់ សូមមើលឯកសារយោង [15]។ កម្រិត mRNA នៃប្រូតេអ៊ីនអាស៊ីតរីបូសូមរបស់មនុស្ស 60S P0 (RPLP0) និង cyclophilin A1 (PPIA) ត្រូវបានប្រើជាការគ្រប់គ្រងហ្សែនជាធរមាន។ ប្រព័ន្ធ PCR ពេលវេលាជាក់ស្តែង QuantStudio 6 pro (Thermo Fisher, Landsmeer, ប្រទេសហូឡង់) ត្រូវបានប្រើជាមួយ TaqMan™ Fast Advanced Master Mix Kit (Applied Biosystems) ឬ Sensifast SYBR Lo-ROX Kit (Bioline, BIO 94050) ហើយការបត់ការបញ្ចេញហ្សែនដែលទាក់ទងត្រូវបានគណនាដោយប្រើប៉ារ៉ាម៉ែត្រវដ្តតម្លៃ Ct ប្រៀបធៀប (ΔΔCt) និងវិធីសាស្ត្រ ∆∆Ct។ ព័ត៌មានលម្អិតនៃប្រាយម័រត្រូវបានផ្តល់ជូននៅក្នុងតារាងបន្ថែម S2 និង S3។
ឌីអិនអេនុយក្លេអ៊ែរ (ncDNA) និងឌីអិនអេមីតូខនឌ្រី (mtDNA) ត្រូវបានស្រង់ចេញដោយប្រើឧបករណ៍វាស់ឈាម និងជាលិកា DNeasy (Qiagen) ដូចដែលបានពិពណ៌នាពីមុន [28]។ បរិមាណដែលទាក់ទងនៃ mtDNA ត្រូវបានគណនាដោយការគណនាសមាមាត្រនៃតំបន់ mtDNA គោលដៅនីមួយៗទៅនឹងមធ្យមភាគធរណីមាត្រនៃតំបន់ឌីអិនអេនុយក្លេអ៊ែរទាំងបី (mtDNA/ncDNA) ដូចដែលបានរៀបរាប់លម្អិតនៅក្នុងវិធីសាស្ត្របន្ថែម 2។ ព័ត៌មានលម្អិតនៃប្រាយម័រសម្រាប់ mtDNA និង ncDNA ត្រូវបានផ្តល់ជូននៅក្នុងតារាងបន្ថែម S4។
កោសិការស់ត្រូវបានប្រឡាក់ពណ៌ជាមួយ Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) ដើម្បីមើលឃើញបណ្តាញមីតូខនឌ្រីអន្តរកោសិកា និងក្នុងកោសិកា។ កោសិកា LX-2 (1 × 104 កោសិកា/អណ្តូង) ត្រូវបានដាំដុះនៅលើស្លាយកញ្ចក់នៅក្នុងចានវប្បធម៌បាតកញ្ចក់ដែលត្រូវគ្នា (Ibidi GmbH, Martinsried, អាល្លឺម៉ង់)។ បន្ទាប់ពី 24 ម៉ោង កោសិកា LX-2 រស់ត្រូវបានភ្ញាស់ជាមួយ 100 μM MTR រយៈពេល 20 នាទីនៅសីតុណ្ហភាព 37°C ហើយស្នូលកោសិកាត្រូវបានប្រឡាក់ពណ៌ជាមួយ DAPI (1 μg/ml, Sigma-Aldrich) ដូចដែលបានពិពណ៌នាពីមុន [29]។ បណ្តាញមីតូខនឌ្រីត្រូវបានមើលឃើញដោយប្រើមីក្រូទស្សន៍បញ្ច្រាស Zeiss Axio Observer (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, អាល្លឺម៉ង់) ដែលបំពាក់ដោយម៉ូឌុលខនហ្វូក Zeiss LSM 800 នៅសីតុណ្ហភាព 37°C ក្នុងបរិយាកាសសំណើមជាមួយ 5% CO2 ដោយប្រើកែវយឹត 63×NA 1.3។ យើងទទួលបានរូបភាពស៊េរី Z ចំនួនដប់សម្រាប់ប្រភេទគំរូនីមួយៗ។ ស៊េរី Z នីមួយៗមាន 30 ផ្នែក ដែលផ្នែកនីមួយៗមានកម្រាស់ 9.86 μm។ សម្រាប់គំរូនីមួយៗ រូបភាពនៃវាលទិដ្ឋភាពផ្សេងៗគ្នាចំនួនដប់ត្រូវបានទទួលដោយប្រើកម្មវិធី ZEN 2009 (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, អាល្លឺម៉ង់) ហើយការវិភាគរូបវិទ្យាមីតូខុនឌ្រីត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើកម្មវិធី ImageJ (v1.54d) [30, 31] ស្របតាមប៉ារ៉ាម៉ែត្រដែលបានរៀបរាប់លម្អិតនៅក្នុងវិធីសាស្ត្របន្ថែម 3។
កោសិកាត្រូវបានជួសជុលជាមួយ glutaraldehyde 2% ក្នុងសារធាតុ phosphate buffer 0.1 M បន្ទាប់មកដោយការជួសជុលជាមួយនឹងដំណោះស្រាយ osmium tetroxide 1% (Sigma Aldrich, MO, USA) ស្ងួតបន្តិចម្តងៗជាមួយ acetone (Merck, Darmstadt, Germany) ហើយចុងក្រោយបានបង្កប់នៅក្នុងជ័រ epoxy ។ ផ្នែកស្តើងបំផុតត្រូវបានរៀបចំ និងប្រឡាក់ពណ៌ជាមួយ uranyl acetate 1% (Merck, Darmstadt, Germany) និង lead citrate 1% (Merck, Darmstadt, Germany)។ រូបភាព Ultrastructural ត្រូវបានទទួលដោយប្រើមីក្រូទស្សន៍អេឡិចត្រុងបញ្ជូន JEM 2100F EXII (JEOL Ltd, Tokyo, Japan) នៅវ៉ុលបង្កើនល្បឿន 80 kV ។
រូបរាង​នៃ​កោសិកា LX-2 ដែល​បាន​ព្យាបាល​ដោយ IPA រយៈពេល 24 ម៉ោង ត្រូវ​បាន​វិភាគ​ដោយ​មីក្រូទស្សន៍​កម្រិត​ពន្លឺ​ដំណាក់កាល​ដែល​មាន​ការ​ពង្រីក 50x ដោយ​ប្រើ​មីក្រូទស្សន៍​ពន្លឺ​បញ្ច្រាស Zeiss (Zeiss Axio Vert.A1 និង AxioCam MRm, Jena, ប្រទេស​អាល្លឺម៉ង់)។
ទិន្នន័យគ្លីនិកត្រូវបានបង្ហាញជាមធ្យម ± គម្លាតស្តង់ដារ ឬមេឌីយ៉ាន (ជួរអន្តរក្វាទីល៖ IQR)។ ការវិភាគតែមួយផ្លូវនៃភាពខុសគ្នា (អថេរបន្ត) ឬការធ្វើតេស្ត χ² (អថេរប្រភេទ) ត្រូវបានប្រើដើម្បីប្រៀបធៀបភាពខុសគ្នារវាងក្រុមសិក្សាទាំងបី។ អត្រាវិជ្ជមានមិនពិត (FDR) ត្រូវបានប្រើដើម្បីកែតម្រូវសម្រាប់ការធ្វើតេស្តច្រើន ហើយហ្សែនដែលមាន FDR < 0.05 ត្រូវបានចាត់ទុកថាមានសារៈសំខាន់ខាងស្ថិតិ។ ការវិភាគសហសម្ព័ន្ធ Spearman ត្រូវបានប្រើដើម្បីភ្ជាប់មេទីឡាស្យុង DNA CpG ជាមួយនឹងអាំងតង់ស៊ីតេសញ្ញា IPA ជាមួយនឹងតម្លៃ p ​​បន្ទាប់បន្សំ (p < 0.05) ដែលបានរាយការណ៍។
ការវិភាគផ្លូវត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើឧបករណ៍វិភាគសំណុំហ្សែនដែលមានមូលដ្ឋានលើគេហទំព័រ (WebGestalt) សម្រាប់ប្រតិចារិកចំនួន 268 (នាមករណ៍ p < 0.01) ប្រតិចារិកដែលទាក់ទងនឹងមីតូខនឌ្រីចំនួន 119 (នាមករណ៍ p < 0.05) និង CpG ចំនួន 4350 ក្នុងចំណោមប្រតិចារិកថ្លើមចំនួន 3093 ដែលទាក់ទងនឹងកម្រិត IPA ក្នុងសេរ៉ូម។ ឧបករណ៍ Venny DB (កំណែ 2.1.0) ដែលអាចរកបានដោយសេរីត្រូវបានប្រើដើម្បីស្វែងរកហ្សែនដែលត្រួតស៊ីគ្នា ហើយ StringDB (កំណែ 11.5) ត្រូវបានប្រើដើម្បីមើលឃើញអន្តរកម្មប្រូតេអ៊ីន-ប្រូតេអ៊ីន។
សម្រាប់ការពិសោធន៍ LX-2 គំរូត្រូវបានធ្វើតេស្តសម្រាប់ភាពធម្មតាដោយប្រើតេស្ត D'Agostino-Pearson។ ទិន្នន័យត្រូវបានទទួលពីយ៉ាងហោចណាស់ការចម្លងជីវសាស្រ្តចំនួនបី ហើយត្រូវបានទទួលរងនូវការវិភាគ ANOVA មួយផ្លូវជាមួយនឹងការធ្វើតេស្ត Bonferroni post hoc។ តម្លៃ p តិចជាង 0.05 ត្រូវបានចាត់ទុកថាមានសារៈសំខាន់ខាងស្ថិតិ។ ទិន្នន័យត្រូវបានបង្ហាញជាមធ្យម ± SD ហើយចំនួននៃការពិសោធន៍ត្រូវបានចង្អុលបង្ហាញនៅក្នុងរូបភាពនីមួយៗ។ ការវិភាគ និងក្រាហ្វទាំងអស់ត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើកម្មវិធីស្ថិតិ GraphPad Prism 8 សម្រាប់ Windows (GraphPad Software Inc., កំណែ 8.4.3, San Diego, សហរដ្ឋអាមេរិក)។
ដំបូង យើងបានស៊ើបអង្កេតពីទំនាក់ទំនងនៃកម្រិត IPA ក្នុងសេរ៉ូមជាមួយនឹងប្រតិចារិកថ្លើម រាងកាយទាំងមូល និងមីតូខនឌ្រី។ នៅក្នុងទម្រង់ប្រតិចារិកសរុប ហ្សែនខ្លាំងបំផុតដែលជាប់ទាក់ទងនឹងកម្រិត IPA ក្នុងសេរ៉ូមគឺ MAPKAPK3 (FDR = 0.0077; មីតូហ្សែន-ធ្វើឱ្យសកម្មប្រូតេអ៊ីនគីណាស-ធ្វើឱ្យសកម្មប្រូតេអ៊ីនគីណាស 3); នៅក្នុងទម្រង់ប្រតិចារិកដែលទាក់ទងនឹងមីតូខនឌ្រី ហ្សែនខ្លាំងបំផុតដែលជាប់ទាក់ទងនឹង AKT1 (FDR = 0.7621; AKT serine/threonine kinase 1) (ឯកសារបន្ថែម 1 និងឯកសារបន្ថែម 2)។
បន្ទាប់មកយើងបានវិភាគប្រតិចារិកសកល (n = 268; p < 0.01) និងប្រតិចារិកដែលទាក់ទងនឹងមីតូខនឌ្រី (n = 119; p < 0.05) ដោយទីបំផុតបានកំណត់អត្តសញ្ញាណអាប៉ុបតូស៊ីសជាផ្លូវស្តង់ដារសំខាន់បំផុត (p = 0.0089)។ ចំពោះប្រតិចារិកមីតូខនឌ្រីដែលទាក់ទងនឹងកម្រិត IPA ក្នុងសេរ៉ូម យើងបានផ្តោតលើអាប៉ុបតូស៊ីស (FDR = 0.00001) មីតូហ្វាជី (FDR = 0.00029) និងផ្លូវសញ្ញា TNF (FDR = 0.000006) (រូបភាពទី 1A តារាងទី 2 និងរូបភាពបន្ថែម 1A-B)។
ការវិភាគត្រួតស៊ីគ្នានៃប្រតិចារិកសកល ជាប់ទាក់ទងនឹងមីតូខនឌ្រី និងមេទីឡាស្យុង DNA នៅក្នុងថ្លើមរបស់មនុស្ស ដែលជាប់ទាក់ទងនឹងកម្រិត IPA ក្នុងសេរ៉ូម។ A តំណាងឱ្យប្រតិចារិកសកលចំនួន 268 ប្រតិចារិកដែលជាប់ទាក់ទងនឹងមីតូខនឌ្រីចំនួន 119 និងប្រតិចារិកដែលមានមេទីឡាស្យុង DNA ដែលត្រូវបានគូសផែនទីទៅកាន់ទីតាំង CpG ចំនួន 3092 ដែលជាប់ទាក់ទងនឹងកម្រិត IPA ក្នុងសេរ៉ូម (តម្លៃ p < 0.01 សម្រាប់ប្រតិចារិកសកល និង DNA ដែលមានមេទីឡាស្យុង និងតម្លៃ p < 0.05 សម្រាប់ប្រតិចារិកមីតូខនឌ្រី)។ ប្រតិចារិកដែលត្រួតស៊ីគ្នាសំខាន់ៗត្រូវបានបង្ហាញនៅចំកណ្តាល (AKT1 និង YKT6)។ B ផែនទីអន្តរកម្មនៃហ្សែនចំនួន 13 ដែលមានពិន្ទុអន្តរកម្មខ្ពស់បំផុត (0.900) ជាមួយហ្សែនផ្សេងទៀតត្រូវបានបង្កើតឡើងពីហ្សែនដែលត្រួតស៊ីគ្នាចំនួន 56 (តំបន់ខ្សែខ្មៅ) ដែលជាប់ទាក់ទងយ៉ាងសំខាន់ជាមួយនឹងកម្រិត IPA ក្នុងសេរ៉ូមដោយប្រើឧបករណ៍អនឡាញ StringDB។ ពណ៌បៃតង៖ ហ្សែនដែលត្រូវបានគូសផែនទីទៅកាន់សមាសធាតុកោសិកា Gene Ontology (GO): មីតូខនឌ្រី (GO:0005739)។ AKT1 គឺជាប្រូតេអ៊ីនដែលមានពិន្ទុខ្ពស់បំផុត (0.900) សម្រាប់អន្តរកម្មជាមួយប្រូតេអ៊ីនដទៃទៀតដោយផ្អែកលើទិន្នន័យ (ផ្អែកលើការជីកយករ៉ែអត្ថបទ ការពិសោធន៍ មូលដ្ឋានទិន្នន័យ និងការបញ្ចេញមតិរួមគ្នា)។ ថ្នាំងបណ្តាញតំណាងឱ្យប្រូតេអ៊ីន ហើយគែមតំណាងឱ្យការតភ្ជាប់រវាងប្រូតេអ៊ីន។
ដោយសារតែសារធាតុរំលាយអាហារនៃមីក្រូជីវសាស្រ្តពោះវៀនអាចគ្រប់គ្រងសមាសភាពអេពីហ្សែនតាមរយៈមេទីឡាស្យុង DNA [32] យើងបានស៊ើបអង្កេតថាតើកម្រិត IPA ក្នុងសេរ៉ូមមានទំនាក់ទំនងជាមួយនឹងមេទីឡាស្យុង DNA ក្នុងថ្លើមឬអត់។ យើងបានរកឃើញថាកន្លែងមេទីឡាស្យុងសំខាន់ពីរដែលទាក់ទងនឹងកម្រិត IPA ក្នុងសេរ៉ូមគឺនៅជិតតំបន់សម្បូរប្រូលីន-សេរីន 3 (C19orf55) និងប្រូតេអ៊ីនឆក់កំដៅគ្រួសារ B (តូច) សមាជិក 6 (HSPB6) (ឯកសារបន្ថែម 3)។ មេទីឡាស្យុង DNA 4350 CpG (p < 0.01) មានទំនាក់ទំនងជាមួយនឹងកម្រិត IPA ក្នុងសេរ៉ូម ហើយត្រូវបានបង្កើនប្រសិទ្ធភាពក្នុងផ្លូវនិយតកម្មអាយុវែង (p = 0.006) (រូបភាពទី 1A តារាងទី 2 និងរូបភាពបន្ថែមទី 1C)។
ដើម្បីយល់ពីយន្តការជីវសាស្រ្តដែលជាមូលដ្ឋាននៃទំនាក់ទំនងរវាងកម្រិត IPA ក្នុងសេរ៉ូម ប្រតិចារិកសកល ប្រតិចារិកដែលទាក់ទងនឹងមីតូខនឌ្រី និងមេទីឡាស្យុង DNA នៅក្នុងថ្លើមមនុស្ស យើងបានធ្វើការវិភាគត្រួតស៊ីគ្នានៃហ្សែនដែលបានកំណត់អត្តសញ្ញាណនៅក្នុងការវិភាគផ្លូវមុន (រូបភាពទី 1A)។ លទ្ធផលនៃការវិភាគបង្កើនប្រសិទ្ធភាពផ្លូវនៃហ្សែនត្រួតស៊ីគ្នាចំនួន 56 (នៅខាងក្នុងខ្សែខ្មៅក្នុងរូបភាពទី 1A) បានបង្ហាញថាផ្លូវអាប៉ុបតូស៊ីស (p = 0.00029) បានបន្លិចហ្សែនពីរដែលមានលក្ខណៈដូចគ្នាទៅនឹងការវិភាគទាំងបី៖ AKT1 និង YKT6 (YKT6 v-SNARE homolog) ដូចបង្ហាញក្នុងដ្យាក្រាម Venn (រូបភាពបន្ថែមទី 2 និងរូបភាពទី 1A)។ គួរឱ្យចាប់អារម្មណ៍ យើងបានរកឃើញថា AKT1 (cg19831386) និង YKT6 (cg24161647) មានទំនាក់ទំនងវិជ្ជមានជាមួយនឹងកម្រិត IPA ក្នុងសេរ៉ូម (ឯកសារបន្ថែមទី 3)។ ដើម្បីកំណត់អន្តរកម្មប្រូតេអ៊ីនដែលអាចកើតមានរវាងផលិតផលហ្សែន យើងបានជ្រើសរើសហ្សែនចំនួន 13 ដែលមានពិន្ទុតំបន់រួមខ្ពស់បំផុត (0.900) ក្នុងចំណោមហ្សែនត្រួតស៊ីគ្នាចំនួន 56 ជាធាតុចូល ហើយបានបង្កើតផែនទីអន្តរកម្ម។ យោងតាមកម្រិតទំនុកចិត្ត (ទំនុកចិត្តរឹម) ហ្សែន AKT1 ដែលមានពិន្ទុខ្ពស់បំផុត (0.900) គឺនៅកំពូល (រូបភាពទី 1B)។
ដោយផ្អែកលើការវិភាគផ្លូវ យើងបានរកឃើញថា apoptosis គឺជាផ្លូវសំខាន់ ដូច្នេះយើងបានស៊ើបអង្កេតថាតើការព្យាបាលដោយ IPA នឹងប៉ះពាល់ដល់ apoptosis នៃ HSCs នៅក្នុង vitro ដែរឬទេ។ ពីមុនយើងបានបង្ហាញថាកម្រិត IPA ផ្សេងៗគ្នា (10 μM, 100 μM, និង 1 mM) មិនពុលដល់កោសិកា LX-2 [15]។ ការសិក្សានេះបានបង្ហាញថាការព្យាបាលដោយ IPA នៅ 10 μM និង 100 μM បានបង្កើនចំនួនកោសិកាដែលអាចរស់បាន និងកោសិកាដែលងាប់។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ បើប្រៀបធៀបជាមួយក្រុមត្រួតពិនិត្យ សមត្ថភាពរស់រានមានជីវិតរបស់កោសិកាបានថយចុះនៅកំហាប់ IPA 1 mM ខណៈពេលដែលអត្រា necrosis កោសិកានៅតែមិនផ្លាស់ប្តូរ (រូបភាពទី 2A, B)។ បន្ទាប់មក ដើម្បីស្វែងរកកំហាប់ល្អបំផុតដើម្បីបង្កឱ្យមាន apoptosis នៅក្នុងកោសិកា LX-2 យើងបានសាកល្បង 10 μM, 100 μM, និង 1 mM IPA រយៈពេល 24 ម៉ោង (រូបភាពទី 2A-E និងរូបភាពបន្ថែមទី 3A-B)។ គួរឱ្យចាប់អារម្មណ៍ IPA 10 μM និង 100 μM បានបន្ថយអត្រា apoptosis (%) ប៉ុន្តែ IPA 1 mM បានបង្កើន apoptosis យឺត និងអត្រា apoptosis (%) បើប្រៀបធៀបទៅនឹងការគ្រប់គ្រង ហើយដូច្នេះត្រូវបានជ្រើសរើសសម្រាប់ការពិសោធន៍បន្ថែមទៀត (រូបភាពទី 2A–D)។
IPA បង្ក​ឲ្យ​មាន​អាប៉ុបតូស៊ីស​នៃ​កោសិកា LX-2។ វិធីសាស្ត្រ​ជ្រលក់​ពណ៌​ពីរ​ដង​របស់ Annexin V និង 7-AAD ត្រូវ​បាន​ប្រើ​ដើម្បី​វាស់​បរិមាណ​អត្រា​អាប៉ុបតូស៊ីស និង​រូបរាង​កោសិកា​ដោយ​វិធីសាស្ត្រ​លំហូរ​ស៊ីតូមេទ្រី។ កោសិកា BA ត្រូវ​បាន​ភ្ញាស់​ជាមួយ 10 μM, 100 μM និង 1 mM IPA រយៈពេល 24 ម៉ោង ឬ​ជាមួយ F–H TGF-β1 (5 ng/ml) និង 1 mM IPA ក្នុង​ឧបករណ៍​ផ្សព្វផ្សាយ​ដែល​មិន​មាន​សេរ៉ូម​រយៈពេល 24 ម៉ោង។ A: កោសិកា​មានជីវិត (Annexin V -/ 7AAD-); B: កោសិកា​ងាប់ (Annexin V -/ 7AAD+); C, F: ដើម (Annexin V +/ 7AAD-); D, G: ចុង (Annexin V+/7AAD.+); E, H: ភាគរយ​នៃ​កោសិកា​អាប៉ុបតូស៊ីស​ដើម និង​ចុង​សរុប​ក្នុង​អត្រា​អាប៉ុបតូស៊ីស (%)។ ទិន្នន័យ​ត្រូវ​បាន​បង្ហាញ​ជា​មធ្យម ± SD, n = 3 ការ​ពិសោធន៍​ឯករាជ្យ។ ការប្រៀបធៀបស្ថិតិត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើ ANOVA មួយផ្លូវជាមួយនឹងការធ្វើតេស្ត Bonferroni post hoc។ *p < 0.05; ****p < 0.0001
ដូចដែលយើងបានបង្ហាញពីមុន TGF-β1 កំហាប់ 5 ng/ml អាចជំរុញការធ្វើឱ្យសកម្ម HSC ដោយបង្កើនការបញ្ចេញមតិនៃហ្សែនសម្គាល់បុរាណ [15]។ កោសិកា LX-2 ត្រូវបានព្យាបាលដោយ TGF-β1 កំហាប់ 5 ng/ml និង IPA 1 mM រួមគ្នា (រូបភាពទី 2E–H)។ ការព្យាបាលដោយ TGF-β1 មិនបានផ្លាស់ប្តូរអត្រា apoptosis ទេ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ ការព្យាបាលដោយ IPA រួមគ្នាបានបង្កើន apoptosis យឺត និងអត្រា apoptosis (%) បើប្រៀបធៀបជាមួយការព្យាបាលដោយ TGF-β1 (រូបភាពទី 2E–H)។ លទ្ធផលទាំងនេះបង្ហាញថា IPA កំហាប់ 1 mM អាចជំរុញ apoptosis នៅក្នុងកោសិកា LX-2 ដោយឯករាជ្យពីការបង្កើត TGF-β1។
យើងបានស៊ើបអង្កេតបន្ថែមទៀតអំពីឥទ្ធិពលរបស់ IPA ទៅលើការដកដង្ហើមមីតូខនឌ្រីនៅក្នុងកោសិកា LX-2។ លទ្ធផលបានបង្ហាញថា 1 mM IPA បានបន្ថយប៉ារ៉ាម៉ែត្រអត្រាប្រើប្រាស់អុកស៊ីសែន (OCR)៖ ការដកដង្ហើមមិនមែនមីតូខនឌ្រី ការដកដង្ហើមមូលដ្ឋាន និងអតិបរមា ការលេចធ្លាយប្រូតុង និងការផលិត ATP បើប្រៀបធៀបទៅនឹងក្រុមត្រួតពិនិត្យ (រូបភាពទី 3A, B) ខណៈពេលដែលសន្ទស្សន៍សុខភាពជីវថាមពល (BHI) មិនបានផ្លាស់ប្តូរទេ។
IPA កាត់បន្ថយការដកដង្ហើមមីតូខនឌ្រីនៅក្នុងកោសិកា LX-2។ ខ្សែកោងការដកដង្ហើមមីតូខនឌ្រី (OCR) ត្រូវបានបង្ហាញជាប៉ារ៉ាម៉ែត្រការដកដង្ហើមមីតូខនឌ្រី (ការដកដង្ហើមមិនមែនមីតូខនឌ្រី ការដកដង្ហើមមូលដ្ឋាន ការដកដង្ហើមអតិបរមា ការលេចធ្លាយប្រូតុង ការបង្កើត ATP SRC និង BHI)។ កោសិកា A និង B ត្រូវបានភ្ញាស់ជាមួយ 10 μM, 100 μM និង 1 mM IPA រយៈពេល 24 ម៉ោងរៀងៗខ្លួន។ កោសិកា C និង D ត្រូវបានភ្ញាស់ជាមួយ TGF-β1 (5 ng/ml) និង 1 mM IPA ក្នុងឧបករណ៍ផ្ទុកសេរ៉ូមរយៈពេល 24 ម៉ោងរៀងៗខ្លួន។ ការវាស់វែងទាំងអស់ត្រូវបានធ្វើឱ្យមានលក្ខណៈធម្មតាទៅនឹងមាតិកា DNA ដោយប្រើឧបករណ៍ CyQuant។ BHI៖ សន្ទស្សន៍សុខភាពជីវថាមពល; SRC៖ សមត្ថភាពបម្រុងផ្លូវដង្ហើម; OCR៖ អត្រាប្រើប្រាស់អុកស៊ីសែន។ ទិន្នន័យត្រូវបានបង្ហាញជាមធ្យម ± គម្លាតស្តង់ដារ (SD) ការពិសោធន៍ឯករាជ្យ n = 5។ ការប្រៀបធៀបស្ថិតិត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើការធ្វើតេស្ត ANOVA មួយផ្លូវ និង Bonferroni post hoc។ *p < 0.05; **p < 0.01; និង ***p < 0.001
ដើម្បីទទួលបានការយល់ដឹងកាន់តែទូលំទូលាយអំពីឥទ្ធិពលរបស់ IPA ទៅលើទម្រង់ជីវថាមពលនៃកោសិកា LX-2 ដែលបានធ្វើឱ្យសកម្មដោយ TGF-β1 យើងបានវិភាគការផូស្វ័រអុកស៊ីតកម្មមីតូខុនឌ្រីដោយ OCR (រូបភាពទី 3C, D)។ លទ្ធផលបានបង្ហាញថា ការព្យាបាលដោយ TGF-β1 អាចកាត់បន្ថយការដកដង្ហើមអតិបរមា សមត្ថភាពបម្រុងផ្លូវដង្ហើម (SRC) និង BHI បើប្រៀបធៀបជាមួយក្រុមត្រួតពិនិត្យ (រូបភាពទី 3C, D)។ លើសពីនេះ ការព្យាបាលរួមគ្នាបានកាត់បន្ថយការដកដង្ហើមមូលដ្ឋាន ការលេចធ្លាយប្រូតុង និងការផលិត ATP ប៉ុន្តែ SRC និង BHI គឺខ្ពស់ជាងការព្យាបាលជាមួយ TGF-β1 យ៉ាងខ្លាំង (រូបភាពទី 3C, D)។
យើងក៏បានអនុវត្ត "ការធ្វើតេស្តប្រភេទថាមពលកោសិកា" ដែលផ្តល់ដោយកម្មវិធី Seahorse (រូបភាពបន្ថែម 4A–D)។ ដូចបង្ហាញក្នុងរូបភាពបន្ថែម 3B សក្តានុពលមេតាបូលីសទាំង OCR និង ECAR ត្រូវបានថយចុះបន្ទាប់ពីការព្យាបាលដោយ TGF-β1 ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ មិនមានភាពខុសគ្នាណាមួយត្រូវបានគេសង្កេតឃើញនៅក្នុងក្រុមរួមបញ្ចូលគ្នា និងក្រុមព្យាបាល IPA បើប្រៀបធៀបទៅនឹងក្រុមត្រួតពិនិត្យនោះទេ។ លើសពីនេះ ទាំងកម្រិតមូលដ្ឋាន និងកម្រិតស្ត្រេសនៃ OCR ត្រូវបានថយចុះបន្ទាប់ពីការព្យាបាលដោយការរួមបញ្ចូលគ្នា និង IPA បើប្រៀបធៀបទៅនឹងក្រុមត្រួតពិនិត្យ (រូបភាពបន្ថែម 4C)។ គួរឱ្យចាប់អារម្មណ៍ គំរូស្រដៀងគ្នានេះត្រូវបានគេសង្កេតឃើញជាមួយនឹងការព្យាបាលរួមបញ្ចូលគ្នា ដែលមិនមានការផ្លាស់ប្តូរកម្រិតមូលដ្ឋាន និងកម្រិតស្ត្រេសនៃ ECAR ត្រូវបានគេសង្កេតឃើញបើប្រៀបធៀបទៅនឹងការព្យាបាល TGF-β1 (រូបភាពបន្ថែម 4C)។ នៅក្នុង HSCs ការថយចុះនៃផូស្វ័រអុកស៊ីតកម្មមីតូខុនឌ្រី និងសមត្ថភាពនៃការព្យាបាលរួមបញ្ចូលគ្នាដើម្បីស្តារ SCR និង BHI បន្ទាប់ពីការប៉ះពាល់នឹងការព្យាបាល TGF-β1 មិនបានផ្លាស់ប្តូរសក្តានុពលមេតាបូលីស (OCR និង ECAR) ទេ។ ប្រសិនបើយើងពិចារណាលើលទ្ធផលទាំងនេះរួមគ្នា លទ្ធផលទាំងនេះបង្ហាញថា IPA អាចកាត់បន្ថយជីវថាមពលនៅក្នុង HSCs ដែលបង្ហាញថា IPA អាចបង្កឱ្យមានទម្រង់ថាមពលទាបដែលផ្លាស់ប្តូរ phenotype HSC ឆ្ពោះទៅរកការអសកម្ម (រូបភាពបន្ថែម 4D)។
ឥទ្ធិពលនៃ IPA ទៅលើឌីណាមិកមីតូខនឌ្រីត្រូវបានស៊ើបអង្កេតដោយប្រើការវាស់វែងបរិមាណបីវិមាត្រនៃរូបវិទ្យាមីតូខនឌ្រី និងការតភ្ជាប់បណ្តាញ ក៏ដូចជាការជ្រលក់ពណ៌ MTR (រូបភាពទី 4 និងរូបភាពបន្ថែមទី 5)។ រូបភាពទី 4 បង្ហាញថា បើប្រៀបធៀបជាមួយក្រុមត្រួតពិនិត្យ ការព្យាបាលដោយ TGF-β1 បានបន្ថយផ្ទៃមធ្យម ចំនួនសាខា ប្រវែងសាខាសរុប និងចំនួនចំណុចប្រសព្វសាខា (រូបភាពទី 4A និង B) ហើយបានផ្លាស់ប្តូរសមាមាត្រនៃមីតូខនឌ្រីពីរូបវិទ្យាស្វ៊ែរទៅរូបវិទ្យាកម្រិតមធ្យម (រូបភាពទី 4C)។ មានតែការព្យាបាលដោយ IPA ប៉ុណ្ណោះដែលបានបន្ថយបរិមាណមីតូខនឌ្រីជាមធ្យម និងបានផ្លាស់ប្តូរសមាមាត្រនៃមីតូខនឌ្រីពីរូបវិទ្យាស្វ៊ែរទៅរូបវិទ្យាកម្រិតមធ្យមបើប្រៀបធៀបជាមួយក្រុមត្រួតពិនិត្យ (រូបភាពទី 4A)។ ផ្ទុយទៅវិញ ភាពស្វ៊ែរ ប្រវែងសាខាមធ្យម និងសកម្មភាពមីតូខនឌ្រីដែលវាយតម្លៃដោយ MTR ដែលពឹងផ្អែកលើសក្តានុពលភ្នាសមីតូខនឌ្រី (រូបភាពទី 4A និង E) នៅតែមិនផ្លាស់ប្តូរ ហើយប៉ារ៉ាម៉ែត្រទាំងនេះមិនខុសគ្នារវាងក្រុមនោះទេ។ សរុបមក លទ្ធផលទាំងនេះបង្ហាញថា ការព្យាបាលដោយ TGF-β1 និង IPA ហាក់ដូចជាកែប្រែរូបរាង និងទំហំមីតូខនឌ្រី ក៏ដូចជាភាពស្មុគស្មាញនៃបណ្តាញនៅក្នុងកោសិកា LX-2 ដែលមានជីវិត។
IPA ផ្លាស់ប្តូរឌីណាមិកមីតូខនឌ្រី និងភាពសម្បូរបែបនៃ DNA មីតូខនឌ្រីនៅក្នុងកោសិកា LX-2។ ក. រូបភាពកុងហ្វូកាល់តំណាងនៃកោសិកា LX-2 រស់ដែលត្រូវបានភ្ញាស់ជាមួយ TGF-β1 (5 ng/ml) និង 1 mM IPA រយៈពេល 24 ម៉ោងនៅក្នុងឧបករណ៍ផ្ទុកសេរ៉ូមដែលគ្មានសេរ៉ូម ដែលបង្ហាញពីបណ្តាញមីតូខនឌ្រីដែលប្រឡាក់ដោយ Mitotracker™ Red CMXRos និងស្នូលដែលប្រឡាក់ពណ៌ខៀវជាមួយ DAPI។ ទិន្នន័យទាំងអស់មានយ៉ាងហោចណាស់ 15 រូបភាពក្នុងមួយក្រុម។ យើងទទួលបានរូបភាព Z-stack ចំនួន 10 សម្រាប់ប្រភេទគំរូនីមួយៗ។ លំដាប់អ័ក្ស Z នីមួយៗមាន 30 ចំណិត ដែលនីមួយៗមានកម្រាស់ 9.86 μm។ របារមាត្រដ្ឋាន៖ 10 μm។ ខ. វត្ថុតំណាង (មីតូខនឌ្រីតែប៉ុណ្ណោះ) ត្រូវបានកំណត់អត្តសញ្ញាណដោយការអនុវត្តកម្រិតសម្របខ្លួនទៅនឹងរូបភាព។ ការវិភាគបរិមាណ និងការប្រៀបធៀបនៃការតភ្ជាប់បណ្តាញរូបវិទ្យាមីតូខនឌ្រីត្រូវបានអនុវត្តសម្រាប់កោសិកាទាំងអស់នៅក្នុងក្រុមនីមួយៗ។ គ. ភាពញឹកញាប់នៃសមាមាត្ររាងមីតូខនឌ្រី។ តម្លៃជិត 0 បង្ហាញពីរាងស្វ៊ែរ ហើយតម្លៃជិត 1 បង្ហាញពីរាងសរសៃ។ ឃ. មាតិកា DNA មីតូខនឌ្រី (mtDNA) ត្រូវបានកំណត់ដូចដែលបានពិពណ៌នានៅក្នុងសម្ភារៈ និងវិធីសាស្រ្ត។ ង. ការវិភាគ Mitotracker™ Red CMXRos ត្រូវបានអនុវត្តដោយលំហូរស៊ីតូមេទ្រី (30,000 ព្រឹត្តិការណ៍) ដូចដែលបានពិពណ៌នានៅក្នុងសម្ភារៈ និងវិធីសាស្រ្ត។ ទិន្នន័យត្រូវបានបង្ហាញជាមធ្យម ± SD, n = 3 ការពិសោធន៍ឯករាជ្យ។ ការប្រៀបធៀបស្ថិតិត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើការធ្វើតេស្ត ANOVA មួយផ្លូវ និង Bonferroni post hoc។ *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
បន្ទាប់មកយើងបានវិភាគមាតិកា mtDNA នៅក្នុងកោសិកា LX-2 ជាសូចនាករនៃចំនួនមីតូខនឌ្រី។ បើប្រៀបធៀបជាមួយក្រុមត្រួតពិនិត្យ មាតិកា mtDNA បានកើនឡើងនៅក្នុងក្រុមដែលបានព្យាបាលដោយ TGF-β1 (រូបភាពទី 4D)។ បើប្រៀបធៀបជាមួយក្រុមដែលបានព្យាបាលដោយ TGF-β1 មាតិកា mtDNA ត្រូវបានថយចុះនៅក្នុងក្រុមព្យាបាលរួមគ្នា (រូបភាពទី 4D) ដែលបង្ហាញថា IPA អាចកាត់បន្ថយមាតិកា mtDNA និងប្រហែលជាចំនួនមីតូខនឌ្រី ក៏ដូចជាការដកដង្ហើមមីតូខនឌ្រី (រូបភាពទី 3C)។ លើសពីនេះ IPA ហាក់ដូចជាកាត់បន្ថយមាតិកា mtDNA នៅក្នុងការព្យាបាលរួមគ្នា ប៉ុន្តែមិនបានប៉ះពាល់ដល់សកម្មភាពមីតូខនឌ្រីដែលសម្របសម្រួលដោយ MTR ទេ (រូបភាពទី 4A–C)។
យើងបានស៊ើបអង្កេតទំនាក់ទំនងរវាង IPA និងកម្រិត mRNA នៃហ្សែនដែលទាក់ទងនឹងជំងឺសរសៃកោសិកា ការស្លាប់កោសិកាដោយកោសិកាមិនប្រក្រតី (apoptosis) ការរស់រានមានជីវិត និងឌីណាមិកមីតូខនឌ្រីនៅក្នុងកោសិកា LX-2 (រូបភាពទី 5A–D)។ បើប្រៀបធៀបជាមួយក្រុមត្រួតពិនិត្យ ក្រុមដែលបានព្យាបាលដោយ TGF-β1 បានបង្ហាញពីការកើនឡើងនៃការបញ្ចេញមតិនៃហ្សែនដូចជាខ្សែសង្វាក់កូឡាជែនប្រភេទទី I α2 (COL1A2) អាកទីនសាច់ដុំរលោង α (αSMA) ម៉ាទ្រីសមេតាឡូប្រូទីណាស 2 (MMP2) សារធាតុទប់ស្កាត់ជាលិកាមេតាឡូប្រូទីណាស 1 (TIMP1) និងហ្សែនដូចឌីណាមីន 1 (DRP1) ដែលបង្ហាញពីការកើនឡើងនៃជំងឺសរសៃកោសិកា និងការធ្វើឱ្យសកម្ម។ លើសពីនេះ បើប្រៀបធៀបជាមួយក្រុមត្រួតពិនិត្យ ការព្យាបាលដោយ TGF-β1 បានកាត់បន្ថយកម្រិត mRNA នៃ receptor nuclear pregnane X (PXR), caspase 8 (CASP8), MAPKAPK3, inhibitor of B-cell α, enhancer of nuclear factor κ gene light peptide (NFκB1A), និង inhibitor of nuclear factor κB kinase subunit β (IKBKB) (រូបភាពទី 5A–D)។ បើប្រៀបធៀបជាមួយការព្យាបាលដោយ TGF-β1 ការព្យាបាលរួមគ្នាជាមួយ TGF-β1 និង IPA បានកាត់បន្ថយការបញ្ចេញមតិរបស់ COL1A2 និង MMP2 ប៉ុន្តែបានបង្កើនកម្រិត mRNA នៃ PXR, TIMP1, B-cell lymphoma-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β, និង IKBKB។ ការព្យាបាលដោយ IPA បានបន្ថយការបញ្ចេញមតិរបស់ MMP2, ប្រូតេអ៊ីន X (BAX) ដែលជាប់ទាក់ទងជាមួយ Bcl-2, AKT1, ប្រូតេអ៊ីន optic atrophy 1 (OPA1) និងប្រូតេអ៊ីន mitochondrial fusion 2 (MFN2) យ៉ាងច្រើន ចំណែកឯការបញ្ចេញមតិរបស់ CASP8, NFκB1A, NFκB1B និង IKBKB បានកើនឡើងបើប្រៀបធៀបជាមួយក្រុមត្រួតពិនិត្យ។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ មិនមានភាពខុសប្លែកគ្នាណាមួយត្រូវបានរកឃើញនៅក្នុងការបញ្ចេញមតិរបស់ caspase-3 (CASP3), apoptotic peptidase activating factor 1 (APAF1), ប្រូតេអ៊ីន mitochondrial fusion 1 (MFN1) និងប្រូតេអ៊ីន fission 1 (FIS1) នោះទេ។ ជារួម លទ្ធផលទាំងនេះបង្ហាញថា ការព្យាបាលដោយ IPA កែប្រែការបញ្ចេញមតិរបស់ហ្សែនដែលជាប់ទាក់ទងនឹង fibrosis, apoptosis, ការរស់រានមានជីវិត និងឌីណាមិក mitochondrial។ ទិន្នន័យរបស់យើងបង្ហាញថា ការព្យាបាលដោយ IPA កាត់បន្ថយ fibrosis នៅក្នុងកោសិកា LX-2; ក្នុងពេលជាមួយគ្នានេះ វាជំរុញការរស់រានមានជីវិតដោយការផ្លាស់ប្តូរ phenotype ឆ្ពោះទៅរកការអសកម្ម។
IPA កែប្រែការបញ្ចេញមតិរបស់ហ្សែន fibroblast, apoptosis, viability និង dynamic mitochondrial នៅក្នុងកោសិកា LX-2។ អ៊ីស្តូក្រាមបង្ហាញពីការបញ្ចេញមតិ mRNA ទាក់ទងទៅនឹងការគ្រប់គ្រង endogenous (RPLP0 ឬ PPIA) បន្ទាប់ពីកោសិកា LX-2 ត្រូវបានជំរុញដោយ TGF-β1 និង IPA នៅក្នុងឧបករណ៍ផ្សព្វផ្សាយដែលគ្មានសេរ៉ូមរយៈពេល 24 ម៉ោង។ A បង្ហាញពី fibroblasts, B បង្ហាញពីកោសិកា apoptosis, C បង្ហាញពីកោសិកាដែលនៅរស់រានមានជីវិត និង D បង្ហាញពីការបញ្ចេញមតិហ្សែន dynamic mitochondrial។ ទិន្នន័យត្រូវបានបង្ហាញជាមធ្យម ± គម្លាតស្តង់ដារ (SD), n = 3 ការពិសោធន៍ឯករាជ្យ។ ការប្រៀបធៀបស្ថិតិត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើការធ្វើតេស្ត ANOVA មួយផ្លូវ និង Bonferroni post hoc។ *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
បន្ទាប់មក ការផ្លាស់ប្តូរទំហំកោសិកា (FSC-H) និងភាពស្មុគស្មាញនៃស៊ីតូប្លាស្ម (SSC-H) ត្រូវបានវាយតម្លៃដោយលំហូរស៊ីតូមេទ្រី (រូបភាពទី 6A,B) ហើយការផ្លាស់ប្តូររូបរាងកោសិកាបន្ទាប់ពីការព្យាបាលដោយ IPA ត្រូវបានវាយតម្លៃដោយមីក្រូទស្សន៍អេឡិចត្រុងបញ្ជូន (TEM) និងមីក្រូទស្សន៍កម្រិតពណ៌ដំណាក់កាល (រូបភាពបន្ថែម 6A-B)។ ដូចដែលរំពឹងទុក កោសិកានៅក្នុងក្រុមដែលបានព្យាបាលដោយ TGF-β1 បានកើនឡើងទំហំបើប្រៀបធៀបទៅនឹងក្រុមត្រួតពិនិត្យ (រូបភាពទី 6A,B) ដែលបង្ហាញពីការពង្រីកបុរាណនៃប្រេទីគុលអង់ដូប្លាស្មិករដុប (ER*) និងហ្វាហ្គោលីសូសូម (P) ដែលបង្ហាញពីការធ្វើឱ្យសកម្មនៃកោសិកាដើមអេម៉ាតូប៉ូអ៊ីទិក (HSC) (រូបភាពបន្ថែម 6A)។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ បើប្រៀបធៀបជាមួយក្រុមដែលបានព្យាបាលដោយ TGF-β1 ទំហំកោសិកា ភាពស្មុគស្មាញនៃស៊ីតូប្លាស្មិក (រូបភាពទី 6A,B) និងមាតិកា ER* ត្រូវបានថយចុះនៅក្នុងក្រុមព្យាបាលរួមបញ្ចូលគ្នា TGF-β1 និង IPA (រូបភាពបន្ថែម 6A)។ លើសពីនេះ ការព្យាបាលដោយ IPA បានបន្ថយទំហំកោសិកា ភាពស្មុគស្មាញនៃស៊ីតូប្លាស្ម (រូបភាពទី 6A,B) មាតិកា P និង ER* (រូបភាពបន្ថែម 6A) បើប្រៀបធៀបជាមួយក្រុមត្រួតពិនិត្យ។ លើសពីនេះ មាតិកានៃកោសិកា apoptosis បានកើនឡើងបន្ទាប់ពីការព្យាបាល IPA 24 ម៉ោងបើប្រៀបធៀបជាមួយក្រុមត្រួតពិនិត្យ (ព្រួញពណ៌ស រូបភាពបន្ថែម 6B)។ ជារួម លទ្ធផលទាំងនេះបង្ហាញថា IPA 1 mM អាចជំរុញ apoptosis របស់ HSC និងបញ្ច្រាស់ការផ្លាស់ប្តូរប៉ារ៉ាម៉ែត្ររូបវិទ្យាកោសិកាដែលបង្កឡើងដោយ TGF-β1 ដោយហេតុនេះគ្រប់គ្រងទំហំ និងភាពស្មុគស្មាញកោសិកា ដែលអាចត្រូវបានផ្សារភ្ជាប់ជាមួយនឹងការអសកម្មរបស់ HSC។
IPA ផ្លាស់ប្តូរទំហំកោសិកា និងភាពស្មុគស្មាញនៃស៊ីតូប្លាស្មនៅក្នុងកោសិកា LX-2។ រូបភាពតំណាងនៃការវិភាគលំហូរស៊ីតូមេទ្រី។ ការវិភាគបានប្រើយុទ្ធសាស្ត្រ gating ជាក់លាក់សម្រាប់កោសិកា LX-2៖ SSC-A/FSC-A ដើម្បីកំណត់ចំនួនប្រជាជនកោសិកា FSC-H/FSC-A ដើម្បីកំណត់ doublets និង SSC-H/FSC-H សម្រាប់ទំហំកោសិកា និងការវិភាគភាពស្មុគស្មាញ។ កោសិកាត្រូវបានភ្ញាស់ជាមួយ TGF-β1 (5 ng/ml) និង 1 mM IPA ក្នុងឧបករណ៍ផ្ទុកសេរ៉ូមរយៈពេល 24 ម៉ោង។ កោសិកា LX-2 ត្រូវបានចែកចាយទៅជាផ្នែកខាងក្រោមខាងឆ្វេង (SSC-H-/FSC-H-) ផ្នែកខាងលើខាងឆ្វេង (SSC-H+/FSC-H-) ផ្នែកខាងក្រោមខាងស្តាំ (SSC-H-/FSC-H+) និងផ្នែកខាងលើខាងស្តាំ (SSC-H+/FSC-H+) សម្រាប់ទំហំកោសិកា និងការវិភាគភាពស្មុគស្មាញនៃស៊ីតូប្លាស្ម។ ខ. រូបរាងកោសិកាត្រូវបានវិភាគដោយវិធីសាស្ត្រលំហូរស៊ីតូម៉ែត្រីដោយប្រើ FSC-H (ការខ្ចាត់ខ្ចាយទៅមុខ ទំហំកោសិកា) និង SSC-H (ការខ្ចាត់ខ្ចាយចំហៀង ភាពស្មុគស្មាញនៃស៊ីតូប្លាស្មិក) (ព្រឹត្តិការណ៍ចំនួន 30,000)។ ទិន្នន័យត្រូវបានបង្ហាញជាមធ្យម ± SD, n = 3 ការពិសោធន៍ឯករាជ្យ។ ការប្រៀបធៀបស្ថិតិត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើការធ្វើតេស្ត ANOVA មួយផ្លូវ និង Bonferroni post hoc។ *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001 និង ****p < 0.0001
សារធាតុរំលាយក្នុងពោះវៀនដូចជា IPA បានក្លាយជាប្រធានបទស្រាវជ្រាវដ៏ក្តៅគគុក ដែលបង្ហាញថាគោលដៅថ្មីអាចត្រូវបានរកឃើញនៅក្នុងមីក្រូជីវសាស្រ្តពោះវៀន។ ដូច្នេះវាគួរឱ្យចាប់អារម្មណ៍ណាស់ដែល IPA ដែលជាសារធាតុរំលាយដែលយើងបានភ្ជាប់ទៅនឹងជំងឺក្រិនថ្លើមចំពោះមនុស្ស [15] ត្រូវបានបង្ហាញថាជាសមាសធាតុប្រឆាំងក្រិនថ្លើមដ៏មានសក្តានុពលនៅក្នុងគំរូសត្វ [13, 14]។ នៅទីនេះ យើងបង្ហាញជាលើកដំបូងអំពីទំនាក់ទំនងរវាង IPA ក្នុងសេរ៉ូម និងប្រតិចារិកថ្លើមសកល និងមេទីឡាស្យុង DNA ចំពោះមនុស្សធាត់ដែលមិនមានជំងឺទឹកនោមផ្អែមប្រភេទទី 2 (T2D) ដោយបង្ហាញពី apoptosis, mitophagy និងអាយុវែង ក៏ដូចជាហ្សែន AKT1 ដែលអាចគ្រប់គ្រង homeostasis ថ្លើម។ ភាពថ្មីថ្មោងមួយទៀតនៃការសិក្សារបស់យើងគឺថា យើងបានបង្ហាញពីអន្តរកម្មនៃការព្យាបាលដោយ IPA ជាមួយនឹង apoptosis, morphology កោសិកា, ជីវថាមពលមីតូខនឌ្រី និងឌីណាមិកនៅក្នុងកោសិកា LX-2 ដែលបង្ហាញពីវិសាលគមថាមពលទាបដែលផ្លាស់ប្តូរ phenotype HSC ឆ្ពោះទៅរកការអសកម្ម ដែលធ្វើឱ្យ IPA ក្លាយជាបេក្ខជនដ៏មានសក្តានុពលសម្រាប់ការកែលម្អជំងឺក្រិនថ្លើម។
យើងបានរកឃើញថា apoptosis, mitophagy និងអាយុវែងគឺជាផ្លូវ canonical សំខាន់បំផុតដែលសម្បូរទៅដោយហ្សែនថ្លើមដែលជាប់ទាក់ទងនឹង IPA ក្នុងសេរ៉ូមដែលចរាចរ។ ការរំខានដល់ប្រព័ន្ធត្រួតពិនិត្យគុណភាពមីតូខនឌ្រី (MQC) អាចនាំឱ្យមានមុខងារមិនប្រក្រតីរបស់មីតូខនឌ្រី, mitophagy និង apoptosis ដោយហេតុនេះជំរុញការកើតឡើងនៃ MASLD [33, 34]។ ដូច្នេះ យើងអាចស្មានថា IPA អាចពាក់ព័ន្ធនឹងការរក្សាថាមវន្តកោសិកា និងភាពសុចរិតរបស់មីតូខនឌ្រីតាមរយៈ apoptosis, mitophagy និងអាយុវែងនៅក្នុងថ្លើម។ ទិន្នន័យរបស់យើងបានបង្ហាញថា ហ្សែនពីរគឺជារឿងធម្មតានៅទូទាំងការវិភាគទាំងបី៖ YKT6 និង AKT1។ គួរកត់សម្គាល់ថា YKT6 គឺជាប្រូតេអ៊ីន SNARE ដែលពាក់ព័ន្ធនឹងដំណើរការនៃការលាយបញ្ចូលគ្នានៃភ្នាសកោសិកា។ វាដើរតួនាទីក្នុង autophagy និង mitophagy ដោយបង្កើតជាស្មុគស្មាញចាប់ផ្តើមជាមួយ STX17 និង SNAP29 នៅលើ autophagosome ដោយហេតុនេះជំរុញការលាយបញ្ចូលគ្នានៃ autophagosomes និង lysosomes [35]។ លើសពីនេះ ការបាត់បង់មុខងារ YKT6 បណ្តាលឱ្យមាន mitophagy ខ្សោយ [36] ខណៈពេលដែលការកើនឡើងនៃ YKT6 ត្រូវបានផ្សារភ្ជាប់ជាមួយនឹងការវិវត្តនៃជំងឺមហារីកថ្លើមកោសិកា (HCC) ដែលបង្ហាញពីការកើនឡើងនៃការរស់រានមានជីវិតកោសិកា [37]។ ម្យ៉ាងវិញទៀត AKT1 គឺជាហ្សែនអន្តរកម្មដ៏សំខាន់បំផុត និងដើរតួនាទីយ៉ាងសំខាន់នៅក្នុងជំងឺថ្លើម រួមទាំងផ្លូវសញ្ញា PI3K/AKT វដ្តកោសិកា ការធ្វើចំណាកស្រុកកោសិកា ការរីកសាយភាយ ការស្អិតជាប់គ្នា មុខងារមីតូខនឌ្រី និងការសំងាត់កូឡាជែន [38–40]។ ផ្លូវសញ្ញា PI3K/AKT ដែលបានធ្វើឱ្យសកម្មអាចធ្វើឱ្យកោសិកាដើម hematopoietic (HSCs) សកម្ម ដែលជាកោសិកាដែលទទួលខុសត្រូវចំពោះការផលិតម៉ាទ្រីសក្រៅកោសិកា (ECM) សកម្ម ហើយភាពមិនប្រក្រតីរបស់វាអាចរួមចំណែកដល់ការកើតឡើង និងការវិវត្តនៃជំងឺ fibrosis ថ្លើម [40]។ លើសពីនេះ AKT គឺជាកត្តារស់រានមានជីវិតកោសិកាដ៏សំខាន់មួយដែលរារាំង apoptosis កោសិកាដែលពឹងផ្អែកលើ p53 ហើយការធ្វើឱ្យសកម្ម AKT អាចត្រូវបានផ្សារភ្ជាប់ជាមួយនឹងការរារាំង apoptosis កោសិកាថ្លើម [41, 42]។ លទ្ធផលដែលទទួលបានបង្ហាញថា IPA អាចពាក់ព័ន្ធនឹង apoptosis ដែលទាក់ទងនឹងមីតូខនឌ្រីថ្លើម ដោយប៉ះពាល់ដល់ការសម្រេចចិត្តរបស់ hepatocytes រវាងការចូលទៅក្នុង apoptosis ឬការរស់រានមានជីវិត។ ផលប៉ះពាល់ទាំងនេះអាចត្រូវបានគ្រប់គ្រងដោយហ្សែនបេក្ខជន AKT និង/ឬ YKT6 ដែលមានសារៈសំខាន់សម្រាប់ homeostasis ថ្លើម។
លទ្ធផលរបស់យើងបានបង្ហាញថា 1 mM IPA បានបង្កឱ្យមាន apoptosis និងការថយចុះនៃការដកដង្ហើមមីតូខនឌ្រីនៅក្នុងកោសិកា LX-2 ដោយមិនគិតពីការព្យាបាលដោយ TGF-β1។ គួរកត់សម្គាល់ថា apoptosis គឺជាផ្លូវសំខាន់មួយសម្រាប់ការដោះស្រាយជំងឺ fibrosis និងការធ្វើឱ្យសកម្មកោសិកាដើម hematopoietic (HSC) ហើយក៏ជាព្រឹត្តិការណ៍សំខាន់មួយនៅក្នុងការឆ្លើយតបខាងសរីរវិទ្យាដែលអាចបញ្ច្រាស់បាននៃជំងឺ fibrosis ថ្លើម [4, 43]។ លើសពីនេះ ការស្ដារឡើងវិញនៃ BHI នៅក្នុងកោសិកា LX-2 បន្ទាប់ពីការព្យាបាលរួមគ្នាបានផ្តល់នូវការយល់ដឹងថ្មីអំពីតួនាទីដ៏មានសក្តានុពលរបស់ IPA ក្នុងការគ្រប់គ្រងជីវថាមពលមីតូខនឌ្រី។ ក្រោមលក្ខខណ្ឌសម្រាក និងអសកម្ម កោសិកា hematopoietic ជាធម្មតាប្រើប្រាស់ phosphorylation អុកស៊ីតកម្មមីតូខនឌ្រីដើម្បីផលិត ATP និងមានសកម្មភាពមេតាបូលីសទាប។ ម្យ៉ាងវិញទៀត ការធ្វើឱ្យសកម្ម HSC បង្កើនការដកដង្ហើមមីតូខនឌ្រី និងជីវសំយោគដើម្បីទូទាត់សងសម្រាប់តម្រូវការថាមពលនៃការចូលទៅក្នុងស្ថានភាព glycolytic [44]។ ការពិតដែលថា IPA មិនបានប៉ះពាល់ដល់សក្តានុពលមេតាបូលីស និង ECAR បង្ហាញថាផ្លូវ glycolytic មិនសូវត្រូវបានផ្តល់អាទិភាពទេ។ ស្រដៀងគ្នានេះដែរ ការសិក្សាមួយផ្សេងទៀតបានបង្ហាញថា 1 mM IPA អាចកែប្រែសកម្មភាពខ្សែសង្វាក់ផ្លូវដង្ហើមមីតូខនឌ្រីនៅក្នុងកោសិកាសាច់ដុំបេះដូង ខ្សែកោសិកាថ្លើមរបស់មនុស្ស (Huh7) និងកោសិកា endothelial សរសៃឈាមវ៉ែនទងផ្ចិតរបស់មនុស្ស (HUVEC)។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ មិនមានឥទ្ធិពលនៃ IPA លើ glycolysis នៅក្នុងកោសិកាសាច់ដុំបេះដូងទេ ដែលបង្ហាញថា IPA អាចប៉ះពាល់ដល់ជីវថាមពលនៃប្រភេទកោសិកាផ្សេងទៀត [45]។ ដូច្នេះ យើងសន្និដ្ឋានថា 1 mM IPA អាចដើរតួជាសារធាតុ uncoupler គីមីស្រាល ព្រោះវាអាចកាត់បន្ថយការបញ្ចេញហ្សែន fibrogenic រូបរាងកោសិកា និងជីវថាមពលមីតូខនឌ្រីយ៉ាងច្រើនដោយមិនផ្លាស់ប្តូរបរិមាណ mtDNA [46]។ សារធាតុ uncoupler មីតូខនឌ្រីអាចរារាំង fibrosis ដែលបង្កឡើងដោយវប្បធម៌ និងការធ្វើឱ្យសកម្ម HSC [47] និងកាត់បន្ថយការផលិត ATP មីតូខនឌ្រីដែលគ្រប់គ្រង ឬបង្កឡើងដោយប្រូតេអ៊ីនមួយចំនួនដូចជាប្រូតេអ៊ីន uncoupling (UCP) ឬ adenine nucleotide translocase (ANT)។ អាស្រ័យលើប្រភេទកោសិកា បាតុភូតនេះអាចការពារកោសិកាពី apoptosis និង/ឬជំរុញ apoptosis [46]។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ ការសិក្សាបន្ថែមទៀតគឺត្រូវការជាចាំបាច់ដើម្បីបញ្ជាក់ពីតួនាទីរបស់ IPA ជាឧបករណ៍បំបែកមីតូខនឌ្រីក្នុងការធ្វើឱ្យកោសិកាដើម hematopoietic អសកម្ម។
បន្ទាប់មកយើងបានស៊ើបអង្កេតថាតើការផ្លាស់ប្តូរនៃការដកដង្ហើមមីតូខនឌ្រីត្រូវបានឆ្លុះបញ្ចាំងនៅក្នុងរូបរាងមីតូខនឌ្រីនៅក្នុងកោសិកា LX-2 ដែលមានជីវិតឬអត់។ គួរឱ្យចាប់អារម្មណ៍ ការព្យាបាលដោយ TGF-β1 ផ្លាស់ប្តូរសមាមាត្រមីតូខនឌ្រីពីរាងស្វ៊ែរទៅជារាងមធ្យម ជាមួយនឹងការថយចុះនៃការបែកខ្ញែកមីតូខនឌ្រី និងការកើនឡើងនៃការបញ្ចេញមតិនៃ DRP1 ដែលជាកត្តាសំខាន់ក្នុងការបំបែកមីតូខនឌ្រី [48]។ លើសពីនេះ ការបំបែកមីតូខនឌ្រីត្រូវបានផ្សារភ្ជាប់ជាមួយនឹងភាពស្មុគស្មាញនៃបណ្តាញទាំងមូល ហើយការផ្លាស់ប្តូរពីការលាយបញ្ចូលគ្នាទៅជាការបំបែកគឺមានសារៈសំខាន់សម្រាប់ការធ្វើឱ្យសកម្មនៃកោសិកាដើម hematopoietic (HSC) ខណៈពេលដែលការរារាំងនៃការបំបែកមីតូខនឌ្រីនាំឱ្យមានការស្លាប់កោសិកា HSC [49]។ ដូច្នេះ លទ្ធផលរបស់យើងបង្ហាញថា ការព្យាបាលដោយ TGF-β1 អាចបណ្តាលឱ្យមានការថយចុះនៃភាពស្មុគស្មាញនៃបណ្តាញមីតូខនឌ្រីជាមួយនឹងការថយចុះនៃការបែកខ្ញែក ដែលជារឿងធម្មតាជាងនៅក្នុងការបំបែកមីតូខនឌ្រីដែលទាក់ទងនឹងកោសិកាដើម hematopoietic ដែលបានធ្វើឱ្យសកម្ម (HSCs)។ លើសពីនេះ ទិន្នន័យរបស់យើងបានបង្ហាញថា IPA អាចផ្លាស់ប្តូរសមាមាត្រនៃមីតូខនឌ្រីពីរាងស្វ៊ែរទៅជារាងមធ្យម ដោយហេតុនេះកាត់បន្ថយការបញ្ចេញមតិនៃ OPA1 និង MFN2។ ការសិក្សាបានបង្ហាញថា ការថយចុះនៃ OPA1 អាចបណ្តាលឱ្យមានការថយចុះនៃសក្តានុពលភ្នាសមីតូខនឌ្រី និងបង្កឱ្យមាន apoptosis កោសិកា [50]។ MFN2 ត្រូវបានគេដឹងថាសម្របសម្រួលការលាយបញ្ចូលគ្នានៃមីតូខនឌ្រី និង apoptosis [51]។ លទ្ធផលដែលទទួលបានបង្ហាញថា ការបង្កើតកោសិកា LX-2 ដោយ TGF-β1 និង/ឬ IPA ហាក់ដូចជាកែប្រែរូបរាង និងទំហំមីតូខនឌ្រី ក៏ដូចជាស្ថានភាពធ្វើឱ្យសកម្ម និងភាពស្មុគស្មាញនៃបណ្តាញ។
លទ្ធផលរបស់យើងបង្ហាញថា ការព្យាបាលរួមគ្នានៃ TGFβ-1 និង IPA អាចកាត់បន្ថយ mtDNA និងប៉ារ៉ាម៉ែត្ររូបវិទ្យាកោសិកា ដោយការគ្រប់គ្រងការបញ្ចេញមតិ mRNA នៃជំងឺសរសៃ ការស្លាប់កោសិកាដោយឯកឯង និងហ្សែនដែលទាក់ទងនឹងការរស់រានមានជីវិតនៅក្នុងកោសិកាដែលគេចផុតពីការស្លាប់កោសិកាដោយឯកឯង។ ជាការពិតណាស់ IPA បានបន្ថយកម្រិតការបញ្ចេញមតិ mRNA នៃ AKT1 និងហ្សែនជំងឺសរសៃសំខាន់ៗដូចជា COL1A2 និង MMP2 ប៉ុន្តែបានបង្កើនកម្រិតការបញ្ចេញមតិរបស់ CASP8 ដែលជាប់ទាក់ទងនឹងការស្លាប់កោសិកាដោយឯកឯង។ លទ្ធផលរបស់យើងបានបង្ហាញថា បន្ទាប់ពីការព្យាបាលដោយ IPA ការបញ្ចេញមតិ BAX បានថយចុះ និងការបញ្ចេញមតិ mRNA នៃអនុឯកតាគ្រួសារ TIMP1 គឺ BCL-2 និង NF-κB បានកើនឡើង ដែលបង្ហាញថា IPA អាចជំរុញសញ្ញារស់រានមានជីវិតនៅក្នុងកោសិកាដើម hematopoietic (HSCs) ដែលគេចផុតពីការស្លាប់កោសិកាដោយឯកឯង។ ម៉ូលេគុលទាំងនេះអាចដើរតួជាសញ្ញាគាំទ្រការរស់រានមានជីវិតនៅក្នុងកោសិកាដើម hematopoietic ដែលបានធ្វើឱ្យសកម្ម ដែលអាចត្រូវបានផ្សារភ្ជាប់ជាមួយនឹងការកើនឡើងនៃការបញ្ចេញមតិនៃប្រូតេអ៊ីនប្រឆាំងនឹង apoptosis (ដូចជា Bcl-2) ការថយចុះនៃការបញ្ចេញមតិនៃ BAX ដែលគាំទ្រ apoptosis និងអន្តរកម្មស្មុគស្មាញរវាង TIMP និង NF-κB [5, 7]។ IPA បញ្ចេញឥទ្ធិពលរបស់វាតាមរយៈ PXR ហើយយើងបានរកឃើញថាការព្យាបាលរួមគ្នាជាមួយ TGF-β1 និង IPA បានបង្កើនកម្រិតការបញ្ចេញមតិ mRNA PXR ដែលបង្ហាញពីការទប់ស្កាត់ការធ្វើឱ្យសកម្ម HSC។ សញ្ញា PXR ដែលបានធ្វើឱ្យសកម្មត្រូវបានគេដឹងថារារាំងការធ្វើឱ្យសកម្ម HSC ទាំងនៅក្នុង vivo និងនៅក្នុង vitro [52, 53]។ លទ្ធផលរបស់យើងបង្ហាញថា IPA អាចចូលរួមក្នុងការសម្អាត HSC ដែលបានធ្វើឱ្យសកម្មដោយជំរុញ apoptosis កាត់បន្ថយ fibrosis និងការរំលាយអាហារ mitochondrial និងបង្កើនសញ្ញារស់រានមានជីវិត ដែលជាដំណើរការធម្មតាដែលបំប្លែង phenotype HSC ដែលបានធ្វើឱ្យសកម្មទៅជា phenotype អសកម្ម។ ការពន្យល់ដែលអាចធ្វើទៅបានមួយទៀតសម្រាប់យន្តការ និងតួនាទីដ៏មានសក្តានុពលរបស់ IPA ក្នុង apoptosis គឺថាវារើសយក mitochondria ដែលមិនដំណើរការជាចម្បងតាមរយៈ mitophagy (ផ្លូវខាងក្នុង) និងផ្លូវសញ្ញា TNF ខាងក្រៅ (តារាងទី 1) ដែលត្រូវបានភ្ជាប់ដោយផ្ទាល់ទៅនឹងផ្លូវសញ្ញារស់រានមានជីវិត NF-κB (រូបភាពបន្ថែមទី 7)។ គួរឱ្យចាប់អារម្មណ៍ ហ្សែនដែលសម្បូរទៅដោយ IPA អាចបង្កើតសញ្ញា pro-apoptotic និង pro-survival នៅក្នុងផ្លូវ apoptosis [54] ដែលបង្ហាញថា IPA អាចបង្កើតផ្លូវ apoptosis ឬការរស់រានមានជីវិតដោយធ្វើអន្តរកម្មជាមួយហ្សែនទាំងនេះ។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ របៀបដែល IPA បង្កឱ្យមាន apoptosis ឬការរស់រានមានជីវិតក្នុងអំឡុងពេលធ្វើឱ្យសកម្ម HSC និងផ្លូវយន្តការរបស់វានៅតែមិនច្បាស់លាស់។
IPA គឺជាសារធាតុរំលាយអាហារអតិសុខុមប្រាណដែលបង្កើតឡើងពីទ្រីបតូហ្វានក្នុងរបបអាហារតាមរយៈមីក្រូជីវសាស្រ្តពោះវៀន។ ការសិក្សាបានបង្ហាញថាវាមានលក្ខណៈសម្បត្តិប្រឆាំងនឹងការរលាក ប្រឆាំងអុកស៊ីតកម្ម និងបទប្បញ្ញត្តិអេពីហ្សែននៅក្នុងបរិស្ថានពោះវៀន។[55] ការសិក្សាបានបង្ហាញថា IPA អាចកែប្រែមុខងាររបាំងពោះវៀន និងកាត់បន្ថយភាពតានតឹងអុកស៊ីតកម្ម ដែលអាចរួមចំណែកដល់ផលប៉ះពាល់សរីរវិទ្យាក្នុងតំបន់របស់វា។[56] តាមពិត IPA ត្រូវបានដឹកជញ្ជូនទៅកាន់សរីរាង្គគោលដៅតាមរយៈចរន្តឈាម ហើយដោយសារតែ IPA មានរចនាសម្ព័ន្ធសារធាតុរំលាយអាហារសំខាន់ស្រដៀងគ្នាជាមួយទ្រីបតូហ្វាន សេរ៉ូតូនីន និងដេរីវេអ៊ីនដូល IPA បញ្ចេញសកម្មភាពមេតាបូលីសដែលបណ្តាលឱ្យមានជោគវាសនាមេតាបូលីសប្រកួតប្រជែង។[52] IPA អាចប្រកួតប្រជែងជាមួយសារធាតុរំលាយអាហារដែលមានប្រភពមកពីទ្រីបតូហ្វានសម្រាប់កន្លែងភ្ជាប់លើអង់ស៊ីម ឬអ្នកទទួល ដែលអាចរំខានដល់ផ្លូវមេតាបូលីសធម្មតា។ នេះបង្ហាញពីតម្រូវការសម្រាប់ការសិក្សាបន្ថែមលើឱសថសាស្ត្រ និងឱសថសាស្ត្ររបស់វា ដើម្បីយល់កាន់តែច្បាស់អំពីបង្អួចព្យាបាលរបស់វា។[57] វានៅតែត្រូវមើលថាតើរឿងនេះក៏អាចកើតឡើងនៅក្នុងកោសិកាដើម hematopoietic (HSCs) ដែរឬទេ។
យើងទទួលស្គាល់ថាការសិក្សារបស់យើងមានដែនកំណត់មួយចំនួន។ ដើម្បីពិនិត្យមើលជាពិសេសនូវទំនាក់ទំនងដែលទាក់ទងនឹង IPA យើងបានដកចេញអ្នកជំងឺដែលមានជំងឺទឹកនោមផ្អែមប្រភេទទី 2 (T2DM)។ យើងទទួលស្គាល់ថារឿងនេះកំណត់ការអនុវត្តយ៉ាងទូលំទូលាយនៃការរកឃើញរបស់យើងចំពោះអ្នកជំងឺដែលមានជំងឺទឹកនោមផ្អែមប្រភេទទី 2 និងជំងឺថ្លើមកម្រិតខ្ពស់។ ទោះបីជាកំហាប់សរីរវិទ្យានៃ IPA នៅក្នុងសេរ៉ូមរបស់មនុស្សគឺ 1–10 μM [11, 20] ក៏ដោយ កំហាប់ 1 mM IPA ត្រូវបានជ្រើសរើសដោយផ្អែកលើកំហាប់មិនពុលខ្ពស់បំផុត [15] និងអត្រាខ្ពស់បំផុតនៃ apoptosis ដោយគ្មានភាពខុសគ្នានៃភាគរយនៃចំនួនប្រជាជនកោសិកា necrotic នោះទេ។ ទោះបីជាកម្រិត supraphysiological នៃ IPA ត្រូវបានប្រើប្រាស់ក្នុងការសិក្សានេះក៏ដោយ បច្ចុប្បន្ននេះមិនមានការឯកភាពគ្នាទាក់ទងនឹងកម្រិតថ្នាំដែលមានប្រសិទ្ធភាពនៃ IPA [52] នោះទេ។ ទោះបីជាលទ្ធផលរបស់យើងមានសារៈសំខាន់ក៏ដោយ ជោគវាសនាមេតាបូលីសដ៏ទូលំទូលាយនៃ IPA នៅតែជាវិស័យស្រាវជ្រាវសកម្ម។ លើសពីនេះ ការរកឃើញរបស់យើងលើទំនាក់ទំនងរវាងកម្រិត IPA ក្នុងសេរ៉ូម និងការមេទីល DNA នៃការចម្លងថ្លើមត្រូវបានទទួលមិនត្រឹមតែពីកោសិកាដើម hematopoietic (HSCs) ប៉ុណ្ណោះទេ ប៉ុន្តែក៏មកពីជាលិកាថ្លើមផងដែរ។ យើងបានជ្រើសរើសប្រើកោសិកា LX-2 របស់មនុស្សដោយផ្អែកលើការរកឃើញពីមុនរបស់យើងពីការវិភាគ transcriptome ដែល IPA ត្រូវបានផ្សារភ្ជាប់ជាមួយនឹងការធ្វើឱ្យសកម្មនៃកោសិកាដើម hematopoietic (HSC) [15] ហើយ HSCs គឺជាកោសិកាសំខាន់ៗដែលពាក់ព័ន្ធនឹងការវិវត្តនៃជំងឺក្រិនថ្លើម។ ថ្លើមត្រូវបានផ្សំឡើងដោយកោសិកាច្រើនប្រភេទ ដូច្នេះគំរូកោសិកាផ្សេងទៀតដូចជាប្រព័ន្ធសហវប្បធម៌កោសិកា hepatocyte-HSC-immune រួមផ្សំជាមួយនឹងការធ្វើឱ្យសកម្ម caspase និងការបែងចែក DNA ក៏ដូចជាយន្តការនៃសកម្មភាពរួមទាំងកម្រិតប្រូតេអ៊ីនគួរតែត្រូវបានពិចារណាដើម្បីសិក្សាពីតួនាទីរបស់ IPA និងអន្តរកម្មរបស់វាជាមួយប្រភេទកោសិកាថ្លើមផ្សេងទៀត។