ការតម្រៀបប្រូតេអ៊ីននៅក្នុងផ្លូវបញ្ចេញសារធាតុគឺមានសារៈសំខាន់សម្រាប់ការរក្សាការបែងចែកកោសិកា និង homeostasis។ បន្ថែមពីលើការតម្រៀបដែលសម្របសម្រួលដោយសំបក តួនាទីរបស់ lipids ក្នុងការតម្រៀប kinesin នៅក្នុងដំណើរការនៃការដឹកជញ្ជូនសារធាតុគឺជាសំណួរជាមូលដ្ឋានដែលមានជាយូរមកហើយដែលមិនទាន់មានចម្លើយ។ នៅទីនេះ យើងអនុវត្តការថតរូបភាព 3D ក្នុងពេលដំណាលគ្នាពហុពណ៌ដែលមានគុណភាពបង្ហាញខ្ពស់ពេលវេលាជាក់ស្តែង ដើម្បីបញ្ជាក់នៅក្នុង vivo ថាប្រូតេអ៊ីន glycosylphosphatidylinositol ដែលទើបសំយោគថ្មីជាមួយនឹង lipid moieties ceramide វែងណាស់ត្រូវបានដាក់ជាក្រុម និងចាត់ថ្នាក់ទៅជា endoplasms ឯកទេស កន្លែងចេញសុទ្ធ ដែលខុសពីអ្វីដែលប្រើដោយប្រូតេអ៊ីនឆ្លងភ្នាស។ លើសពីនេះ យើងបង្ហាញថាប្រវែងខ្សែសង្វាក់នៃ ceramide នៅក្នុងភ្នាស reticulum endoplasmic គឺមានសារៈសំខាន់សម្រាប់ការជ្រើសរើសតម្រៀបនេះ។ ការសិក្សារបស់យើងផ្តល់នូវភស្តុតាងដោយផ្ទាល់នៅក្នុង vivo ដើម្បីចាត់ថ្នាក់ទំនិញប្រូតេអ៊ីនដោយផ្អែកលើប្រវែងខ្សែសង្វាក់ lipid ទៅជាកន្លែងនាំចេញដែលបានជ្រើសរើសនៅក្នុងផ្លូវបញ្ចេញសារធាតុ។
នៅក្នុងកោសិកា eukaryotic ប្រូតេអ៊ីនដែលត្រូវបានសំយោគនៅក្នុង endoplasmic reticulum (ER) ត្រូវបានតម្រៀបក្នុងអំឡុងពេលដឹកជញ្ជូនតាមរយៈផ្លូវ secretory សម្រាប់ការដឹកជញ្ជូនទៅកាន់គោលដៅកោសិកាសមស្របរបស់វា (1)។ បន្ថែមពីលើការតម្រៀបដែលសម្របសម្រួលដោយថ្នាំកូត វាត្រូវបានគេស្មានជាយូរមកហើយថា lipids មួយចំនួនក៏អាចបម្រើជាចំណុចចេញជ្រើសរើសដោយការដាក់ជាក្រុមពួកវាទៅជាដែនភ្នាសជាក់លាក់ដែលប្រូតេអ៊ីនជាក់លាក់ (2-5)។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ នៅតែមានកង្វះភស្តុតាងដោយផ្ទាល់នៅក្នុង vivo ដើម្បីបញ្ជាក់ពីយន្តការដែលមានមូលដ្ឋានលើ lipid នេះដែលអាចធ្វើទៅបាន។ ដើម្បីដោះស្រាយបញ្ហាជាមូលដ្ឋាននេះ យើងបានសិក្សានៅក្នុង yeast អំពីរបៀបដែល glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchored proteins (GPI-APs) ត្រូវបាននាំចេញពី ER ខុសគ្នា។ GPI-APs គឺជាប្រូតេអ៊ីនផ្ទៃកោសិកាដែលភ្ជាប់ជាមួយ lipid ជាច្រើនប្រភេទ (6, 7)។ GPI-AP គឺជាប្រូតេអ៊ីនដែលបញ្ចេញចោលដែលភ្ជាប់ទៅនឹងស្លឹកខាងក្រៅនៃភ្នាសប្លាស្មាតាមរយៈ glycolipid moiety (GPI anchor)។ ពួកវាទទួលយក GPI anchors ជាការកែប្រែក្រោយការបកប្រែអភិរក្សនៅក្នុង ER lumen (8)។ បន្ទាប់ពីការភ្ជាប់ GPI-AP ឆ្លងកាត់ឧបករណ៍ Golgi (5, 9) ពី ER ទៅភ្នាសប្លាស្មា។ វត្តមាននៃយុថ្កា GPI បណ្តាលឱ្យ GPI-AP ត្រូវបានដឹកជញ្ជូនដាច់ដោយឡែកពីប្រូតេអ៊ីនដែលបញ្ចេញចេញពីភ្នាស (រួមទាំងប្រូតេអ៊ីនភ្នាសប្លាស្មាផ្សេងទៀត) តាមបណ្តោយផ្លូវបញ្ចេញ (5, 9, 10)។ នៅក្នុងកោសិកាផ្សិត GPI-APs ត្រូវបានបំបែកចេញពីប្រូតេអ៊ីនដែលបញ្ចេញផ្សេងទៀតនៅក្នុង reticulum endoplasmic ហើយបន្ទាប់មកវេចខ្ចប់ទៅជា vesicles តែមួយគត់ដែលរុំដោយស្មុគស្មាញប្រូតេអ៊ីនថ្នាំកូត II (COPII) (6, 7)។ កត្តាកំណត់នៃដំណើរការចាត់ថ្នាក់នេះនៅក្នុងដំណើរការនាំចេញ ER គឺមិនច្បាស់លាស់ទេ ប៉ុន្តែវាត្រូវបានស្មានថាយន្តការនេះអាចត្រូវការ lipids ជាពិសេសការរៀបចំរចនាសម្ព័ន្ធឡើងវិញនៃផ្នែក lipid នៃយុថ្កា GPI (5, 8)។ នៅក្នុងផ្សិត ការរៀបចំ lipid GPI ចាប់ផ្តើមភ្លាមៗបន្ទាប់ពី GPI ភ្ជាប់ ហើយក្នុងករណីជាច្រើន វាបណ្តាលឱ្យ ceramide ភ្ជាប់ទៅនឹងអាស៊ីតខ្លាញ់ឆ្អែតខ្សែសង្វាក់វែង 26 កាបូន (C26:0) (11, 12)។ រហូតមកដល់ពេលនេះ សេរ៉ាមីត C26 គឺជាសេរ៉ាមីតសំខាន់ដែលផលិតដោយកោសិកាផ្សិត។ វាត្រូវបានសំយោគនៅក្នុង ER ហើយភាគច្រើននៃវាត្រូវបាននាំចេញទៅកាន់ឧបករណ៍ Golgi តាមរយៈវេស៊ីគ្ល COPII (13)។ ការនាំចេញ ER នៃ GPI-AP តម្រូវឱ្យមានការសំយោគសេរ៉ាមីតជាបន្តបន្ទាប់ (14, 15) ហើយជាលទ្ធផល ការបំលែងសេរ៉ាមីតទៅជាអ៊ីណូស៊ីតូលផូស្វាតសេរ៉ាមីត (IPC) នៅក្នុងឧបករណ៍ Golgi អាស្រ័យលើការសំយោគយុថ្កា GPI (16)។ ការសិក្សាជីវរូបវិទ្យាជាមួយភ្នាសសិប្បនិម្មិតបានបង្ហាញថា សេរ៉ាមីតខ្សែសង្វាក់អាស៊ីលីកវែងខ្លាំងអាចបញ្ចូលគ្នាដើម្បីបង្កើតជាដែនដែលមានសណ្តាប់ធ្នាប់ជាមួយនឹងលក្ខណៈសម្បត្តិរូបវន្តតែមួយគត់ (17, 18)។ ទិន្នន័យទាំងនេះនាំឱ្យមានសម្មតិកម្មថា សេរ៉ាមីត C26 និង GPI-AP ជាមួយសេរ៉ាមីត C26 ប្រើប្រាស់លក្ខណៈសម្បត្តិរូបវន្តរបស់វាដើម្បីបញ្ចូលគ្នាទៅក្នុងតំបន់ដែលមានសណ្តាប់ធ្នាប់ ឬតំបន់នៅក្នុងបរិស្ថានខ្លាញ់ភ្នាស ER ដែលមានភាពរញ៉េរញ៉ៃ។ វាភាគច្រើនត្រូវបានផ្សំឡើងដោយគ្លីសេរ៉ូលីពីតខ្លី និងមិនឆ្អែត (C16:1 និង C18:1) (19, 20)។ តំបន់ទាំងនេះនឹងផ្តោតជាជម្រើសលើកន្លែងចេញ ER ជាក់លាក់ (ERES) ដែល ceramide និង GPI-AP ដែលមានមូលដ្ឋានលើ ceramide អាចត្រូវបានដឹកជញ្ជូនរួមគ្នាទៅកាន់ Golgi នៅក្នុង vesicle COPII តែមួយ (5)។
នៅក្នុងការសិក្សានេះ យើងបានសាកល្បងដោយផ្ទាល់នូវយន្តការដែលមានមូលដ្ឋានលើ lipid នេះដោយប្រើមីក្រូទស្សន៍រូបភាពពេលវេលាជាក់ស្តែង confocal ដែលមានគុណភាពបង្ហាញខ្ពស់ (SCLIM) ដែលជាបច្ចេកទេសមីក្រូទស្សន៍ទំនើបមួយដែលអាចសង្កេតឃើញប្រូតេអ៊ីនដែលមានស្លាក fluorescent ក្នុងពេលដំណាលគ្នា។ រូបភាពបីពណ៌ និងបីវិមាត្រ (3D) មានគុណភាពខ្ពស់ និងល្បឿនខ្ពស់បំផុតនៅក្នុងកោសិកាមានជីវិត (21, 22)។
ដំបូងយើងបានអនុវត្តបច្ចេកវិទ្យា SCLIM ដើម្បីកំណត់បន្ថែមទៀតអំពីរបៀបដែល GPI-AP ធម្មតាជាមួយក្រុម ceramide C26 ត្រូវបានត្រួតពិនិត្យពីប្រូតេអ៊ីនដែលបញ្ចេញចេញពីភ្នាសបន្ទាប់ពីចាកចេញពី ER នៅក្នុង S. cerevisiae។ ដើម្បីពិនិត្យមើលចំណាត់ថ្នាក់នៃ ER យើងបានប្រើប្រព័ន្ធហ្សែនដែលអាចមើលឃើញដោយផ្ទាល់នូវទំនិញសំយោគថ្មីដែលចូលទៅក្នុង ERES នៅក្នុង vivo (7, 23)។ ក្នុងនាមជាទំនិញ យើងបានជ្រើសរើស C26-ceramide-based GPI-AP Gas1 ដែលមានស្លាកជាមួយប្រូតេអ៊ីន fluorescent ពណ៌បៃតង (GFP) និងប្រូតេអ៊ីនដែលបញ្ចេញចេញពីភ្នាស Mid2 ដែលមានស្លាកជាមួយប្រូតេអ៊ីន fluorescent ជិតអ៊ីនហ្វ្រារ៉េដ (iRFP) ដែលទាំងពីរនេះកំណត់គោលដៅភ្នាសប្លាស្មា (24–26)។ នៅក្នុង mutant ងាយនឹងសីតុណ្ហភាព sec31-1 ទំនិញទាំងពីរនេះត្រូវបានបង្ហាញនៅក្រោម promoter ដែលបង្កឡើងដោយ galactose និងសញ្ញាសម្គាល់ ERES ជាធរមាន។ នៅសីតុណ្ហភាពខ្លាំង (37°C) ដោយសារតែការផ្លាស់ប្តូរហ្សែន sec31-1 ប៉ះពាល់ដល់មុខងាររបស់សមាសធាតុថ្នាំកូត COPII Sec31 ដើម្បីរារាំងដំណុះ COPII និងការនាំចេញ ER ទំនិញសំយោគថ្មីកកកុញនៅ ER (23)។ បន្ទាប់ពីត្រជាក់ដល់សីតុណ្ហភាពទាប (24°C) កោសិកាផ្លាស់ប្តូរហ្សែន sec31-1 ដែលបានស្តារឡើងវិញពីតំបន់បញ្ចេញ ហើយទំនិញសំយោគថ្មីដែលកកកុញបានចាប់ផ្តើមនាំចេញពី ER។ ការមើលឃើញ CLIM បានបង្ហាញថា Gas1-GFP និង Mid2-iRFP ដែលសំយោគថ្មីភាគច្រើននៅតែកកកុញនៅក្នុង ER នៃកោសិកាផ្លាស់ប្តូរហ្សែន sec31-1 បន្ទាប់ពីការភ្ញាស់នៅសីតុណ្ហភាព 37°C ហើយបន្ទាប់មកត្រូវបានបញ្ចេញនៅសីតុណ្ហភាព 24°C រយៈពេល 5 នាទី (រូបភាពទី 1)។ ដោយសារតែ Mid2-iRFP ត្រូវបានចែកចាយនៅលើភ្នាស ER ទាំងមូល ហើយ Gas1-GFP ត្រូវបានប្រមូលផ្តុំ និងប្រមូលផ្តុំនៅក្នុងតំបន់ភ្នាស ER ដែលមិនជាប់គ្នា ការចែកចាយរបស់ពួកវាគឺខុសគ្នាទាំងស្រុង (រូបភាពទី 1, A ដល់ C និង Movie S1)។ លើសពីនេះ ដូចដែលបានបង្ហាញក្នុងរូបភាពទី 1D ចង្កោម Gas1-GFP មិនមាន Mid2-iRFP ទេ។ លទ្ធផលទាំងនេះបង្ហាញថា GPI-AP និងប្រូតេអ៊ីនឆ្លងភ្នាសត្រូវបានបំបែកទៅក្នុងតំបន់ភ្នាស ER ផ្សេងៗគ្នាតាំងពីដំបូង។ ចង្កោម Gas1-GFP គឺនៅជាប់នឹង ERES ជាក់លាក់មួយដែលមានស្លាកជាមួយប្រូតេអ៊ីនថ្នាំកូត COPII របស់ mCherry Sec13 (រូបភាពទី 1, E និង F, និងភាពយន្ត S1) (23)។
កោសិកា sec31-1 បង្ហាញការបញ្ចេញដែលបង្កឡើងដោយ galactose ដែលជាខ្សែសង្វាក់ acyl វែង (C26) ceramide GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP ពណ៌បៃតង) និងប្រូតេអ៊ីនឆ្លងភ្នាស Mid2-iRFP (TMP ពណ៌ខៀវ) ហើយការដាក់ស្លាក ERES ដ៏ស្ថាបនា Sec13-mCherry (ERES ពណ៌ផ្កាឈូកស្លេក) នេះត្រូវបានភ្ញាស់នៅសីតុណ្ហភាព 37°C រយៈពេល 30 នាទី ផ្លាស់ទីទៅ 24°C និងថតរូបភាពដោយ SCLIM 5 នាទីក្រោយមក។ (A ដល់ C) បង្ហាញរូបភាព 2D រួមបញ្ចូលគ្នា ឬរូបភាពតែមួយនៃប្លង់មួយ (A) រូបភាពបញ្ចាំង 2D នៃផ្នែក z ចំនួន 10 (B) ឬរូបភាពអឌ្ឍគោលកោសិកា 3D នៃទំនិញ និងសញ្ញាសម្គាល់ ERES (C)។ របារមាត្រដ្ឋាន 1μm (A និង B)។ ឯកតាមាត្រដ្ឋានគឺ 0.551μm (C)។ Gas1-GFP ត្រូវបានរកឃើញនៅក្នុងតំបន់ ឬចង្កោម ER ដាច់ពីគ្នា ខណៈពេលដែល Mid2-iRFP ត្រូវបានរកឃើញ និងចែកចាយពាសពេញភ្នាស ER (C)។ (D) ក្រាហ្វបង្ហាញពីអាំងតង់ស៊ីតេនៃពន្លឺចែងចាំងដែលទាក់ទងគ្នានៃ Gas1-GFP និង Mid2-iRFP នៅក្នុងចង្កោម Gas1-GFP តាមបណ្តោយបន្ទាត់ព្រួញពណ៌ស (ខាងឆ្វេង)។ AU ជាឯកតាតាមអំពើចិត្ត។ (E និង F) តំណាងឱ្យរូបភាព 3D ដែលរួមបញ្ចូលគ្នានូវសញ្ញាសម្គាល់ទំនិញ និង ERES។ ចង្កោម Gas1-GFP ត្រូវបានរកឃើញនៅជិត ERES ជាក់លាក់។ ឯកតាមាត្រដ្ឋានគឺ 0.551μm។ (F) ព្រួញរឹងពណ៌សសម្គាល់ចង្កោម Gas1-GFP ដែលភ្ជាប់ជាមួយ ERES។ បន្ទះកណ្តាល និងស្តាំបង្ហាញរូបភាព 3D ដែលបានពង្រីកបញ្ចូលគ្នា និងទិដ្ឋភាពបង្វិលនៃចង្កោម Gas1-GFP ដែលបានជ្រើសរើស។
ទំនាក់ទំនងលំហជិតស្និទ្ធរវាងចង្កោម Gas1-GFP និង ERES ជាក់លាក់មួយបង្ហាញថា Gas1-GFP អាចចូលទៅក្នុង ERES ជ្រើសរើស ដែលខុសពីការជ្រើសរើសដែលប្រើដោយ Mid2-iRFP ដើម្បីចាកចេញពី ER។ ដើម្បីដោះស្រាយលទ្ធភាពនេះ យើងបានវាស់បរិមាណសមាមាត្រ ERES សម្រាប់ទំនិញតែមួយឬពីរប៉ុណ្ណោះ (រូបភាពទី 2, A ដល់ C)។ យើងបានរកឃើញថា ERES ភាគច្រើន (70%) មានទំនិញតែមួយប្រភេទប៉ុណ្ណោះ។ រូបភាពខាងក្រោមនៃរូបភាពទី 2C បង្ហាញឧទាហរណ៍ធម្មតាពីរនៃ ERES ដែលមានតែ Gas1-GFP (រូបភាពទី 1) ឬតែ Mid2-iRFP (រូបភាពទី 2)។ ផ្ទុយទៅវិញ ប្រហែល 20% នៃ ERES មានទំនិញពីរដែលត្រួតស៊ីគ្នានៅក្នុងតំបន់ដូចគ្នា។ វាត្រូវបានគេរកឃើញថា ERES មួយចំនួន (10%) មានទំនិញពីរប្រភេទ ប៉ុន្តែពួកវាត្រូវបានញែកដាច់ពីគ្នានៅក្នុងតំបន់ខុសគ្នាយ៉ាងច្បាស់។ ដូច្នេះ ការវិភាគស្ថិតិនេះបង្ហាញថា បន្ទាប់ពី ER ត្រូវបាននាំចេញ GPI-AP Gas1-GFP និងទំនិញឆ្លងភ្នាស Mid2-iRFP ត្រូវបានបែងចែកជា ERES ផ្សេងៗគ្នា (រូបភាពទី 2D)។ ប្រសិទ្ធភាពនៃការតម្រៀបនេះគឺស្របគ្នាយ៉ាងខ្លាំងជាមួយនឹងការវិភាគជីវគីមីពីមុន (6) និងការកំណត់រូបវិទ្យា (7)។ យើងក៏អាចសង្កេតមើលឥរិយាបថនៃទំនិញដែលត្រូវបានដាក់ឱ្យនៅដាច់ដោយឡែកដែលចូលទៅក្នុង ERES (រូបភាពទី 2E និងភាពយន្ត S2)។ រូបភាពទី 2E បង្ហាញថាមានតែផ្នែកតូចមួយនៃ Gas1-GFP (បន្ទះទី 3) ឬ Mid2-iRFP (បន្ទះទី 4) ចូលទៅក្នុង ERES ពីម្ខាង ហើយត្រូវបានកំណត់នៅក្នុងតំបន់ដាច់ពីគ្នា។ បន្ទះទី 5 នៃរូបភាពទី 2E បង្ហាញថា Gas1-GFP និង Mid2-iRFP ជួនកាលត្រូវបានរកឃើញនៅក្នុង ERES ដូចគ្នា ប៉ុន្តែពួកវាចូលពីភាគីផ្សេងៗគ្នា ហើយត្រូវបានប្រមូលផ្តុំនៅក្នុងតំបន់ដាច់ដោយឡែកដែលអាចតំណាងឱ្យវេស៊ីគុល COPII ផ្សេងៗគ្នា។ យើងក៏បានបញ្ជាក់ផងដែរថា ការបំបែក និងការចាត់ថ្នាក់ដែលសង្កេតឃើញនៃ C26 ceramide-based GPI-AP Gas1 ជា ERES ជ្រើសរើសគឺជាក់លាក់ដោយសារតែទំនិញបញ្ចេញសារធាតុឆ្លងកាត់ភ្នាសមួយទៀត គឺប្រូតេអ៊ីនភ្នាសប្លាស្មាដែលមានស្លាក GFP Axl2 (27) ដែលបង្ហាញពីឥរិយាបថស្រដៀងគ្នាទៅនឹង Mid2-iRFP។ (រូបភាព S1 និងភាពយន្ត S3)។ Axl2-GFP ដែលសំយោគថ្មីត្រូវបានចែកចាយតាមរយៈភ្នាស ER ដូចជា Mid2-iRFP (រូបភាព S1, A និង B) ហើយត្រូវបានធ្វើមូលដ្ឋានីយកម្មរួមគ្នាជាមួយ Mid2-iRFP នៅក្នុង ERES ភាគច្រើន (រូបភាព S1, B ដល់ D)។ បន្ទះទី 1 និងទី 2 នៃរូបភាពទី 1។ S1C បង្ហាញឧទាហរណ៍ធម្មតាពីរនៃ ERES ដែលទំនិញឆ្លងកាត់ភ្នាសពីរត្រួតស៊ីគ្នា។ ក្នុងករណីទាំងនេះ ទំនិញទាំងពីរចូលទៅក្នុង ERES ជាមួយគ្នា (រូបភាព S1E បន្ទះទី 3 និងភាពយន្ត S3)។
កោសិកា sec31-1 ដែលបង្ហាញពីការបញ្ចេញសារធាតុ galactose ដែលបង្កឡើងដោយ Gas1-GFP (GPI-AP ពណ៌បៃតង) និង Mid2-iRFP (TMP ពណ៌ខៀវ) និងស្លាក ERES ថេរ Sec13-mCherry (ERES ពណ៌ក្រហមស្វាយ) ត្រូវបានដាក់នៅសីតុណ្ហភាព 37 អង្សាសេ។ បន្ទាប់ពីភ្ញាស់រយៈពេល 30 នាទីនៅសីតុណ្ហភាព °C សូមផ្លាស់ទីទៅ 24 °C ដើម្បីបញ្ចេញប្លុកបញ្ចេញសារធាតុ ហើយថតរូបភាពជាមួយ SCLIM បន្ទាប់ពី 20 នាទី។ (A ដល់ C) រូបភាពបញ្ចាំង 2D តំណាង (A; របារមាត្រដ្ឋាន 1μm) ឬរូបភាពអឌ្ឍគោលកោសិកា 3D (B និង C; ឯកតាមាត្រដ្ឋាន 0.456μm) នៃទំនិញ និងផ្នែក z ចំនួន 10 ដែលសម្គាល់ដោយ ERES។ បន្ទះខាងក្រោមក្នុង (B) និងបន្ទះក្នុង (C) បង្ហាញរូបភាពដែលបានដំណើរការដើម្បីបង្ហាញតែទំនិញដែលមាននៅក្នុង ERES (ពណ៌ក្រហមស្វាយ) [Gas1-GFP (ពណ៌ប្រផេះ) និង Mid2-iRFP (ពណ៌ខៀវខ្ចី)]។ (C) ព្រួញបើក៖ ERES ផ្ទុកទំនិញតែមួយដុំប៉ុណ្ណោះ (1 ដល់ 4)។ ព្រួញពណ៌ប្រផេះ៖ ERES មានទំនិញដែលបានបំបែក (5)។ ព្រួញពណ៌សរឹង៖ ERES មានទំនិញដែលមានទីតាំងរួមគ្នា។ ខាងក្រោម៖ ERES តែមួយដែលបានជ្រើសរើសមានតែ Gas1-GFP (1) ឬ Mid2-iRFP (2) ប៉ុណ្ណោះ។ របារមាត្រដ្ឋាន 100 nm។ (D) ការវាស់បរិមាណនៃរូបថតមីក្រូទស្សន៍ដែលបានពិពណ៌នានៅក្នុង (C)។ ភាគរយជាមធ្យមនៃ ERES ដែលមានទំនិញតែមួយ (Gas1-GFP ឬ Mid2-iRFP) ទំនិញដែលបានបំបែក និងទំនិញដែលត្រួតស៊ីគ្នា។ នៅក្នុងការពិសោធន៍ឯករាជ្យចំនួនបី n=432 ក្នុង 54 ក្រឡា។ របារកំហុស = SD។ ការធ្វើតេស្ត t ពីរកន្ទុយដែលមិនបានផ្គូផ្គង។ *** P = 0.0002។ (E) រូបភាព 3D នៃ ERES ដែលបានជ្រើសរើសនៃទំនិញដែលត្រូវបានដាក់ឱ្យនៅដាច់ដោយឡែកដែលសម្គាល់ដោយ (C)។ Gas1-GFP (ពណ៌បៃតង) (3) ឬ Mid2-iRFP (ពណ៌ខៀវ) (4) ចូលទៅក្នុង ERES (ពណ៌ស្វាយ) ពីម្ខាង ហើយត្រូវបានកំណត់ចំពោះតំបន់តូចមួយនៅក្នុង ERES។ ពេលខ្លះ ទំនិញទាំងពីរប្រភេទចូលទៅក្នុង ERES (5) ដូចគ្នាពីចំហៀងដូចគ្នា ហើយត្រូវបានកំណត់ចំពោះតំបន់ដាច់ស្រយាលមួយនៅក្នុង ERES។ របារមាត្រដ្ឋាន 100 nm។
បន្ទាប់មក យើងបានសាកល្បងសម្មតិកម្មមួយដែលថា សេរ៉ាមីតខ្សែសង្វាក់អាស៊ីលីកវែង (C26) ដែលមាននៅក្នុងភ្នាស ER ជំរុញការប្រមូលផ្តុំជាក់លាក់ និងការតម្រៀប Gas1 ទៅជា ERES ជ្រើសរើស។ ចំពោះគោលបំណងនេះ យើងបានប្រើពូជផ្សិតដែលបានកែប្រែ GhLag1 ដែលការសំយោគសេរ៉ាមីតខាងក្នុងពីរគឺ Lag1 និង Lac1 ត្រូវបានជំនួសដោយ GhLag1 ( homolog Lag1 នៃកប្បាស) ដែលបណ្តាលឱ្យមានពូជផ្សិតដែលមានភ្នាសកោសិកា សេរ៉ាមីតខ្សែសង្វាក់ខ្លីជាងប្រភេទព្រៃ (រូបភាពទី 3A) (28)។ ការវិភាគម៉ាសស្ពិចត្រូម៉ែត្រី (MS) បានបង្ហាញថា នៅក្នុងពូជព្រៃ 95% នៃសេរ៉ាមីតសរុបគឺសេរ៉ាមីតខ្សែសង្វាក់វែងខ្លាំង (C26) ខណៈពេលដែលនៅក្នុង GhLag1 85% នៃសេរ៉ាមីតវែងខ្លាំង (C18 និង C16)។ មានតែ 2% នៃសេរ៉ាមីតប៉ុណ្ណោះដែលមានសេរ៉ាមីតខ្សែសង្វាក់វែងខ្លាំង (C26)។ ទោះបីជាសេរ៉ាមីត C18 និង C16 គឺជាសេរ៉ាមីតសំខាន់ៗដែលត្រូវបានរកឃើញនៅក្នុងភ្នាស GhLag1 រហូតមកដល់ពេលនេះក៏ដោយ ការវិភាគ MS ក៏បានបញ្ជាក់ផងដែរថា យុថ្កា GPI នៃ Gas1-GFP ដែលបានបង្ហាញនៅក្នុងពូជ GhLag1 មានផ្ទុកសេរ៉ាមីត C26 ដែលអាចប្រៀបធៀបទៅនឹងជាតិខ្លាញ់ប្រភេទព្រៃ។ គុណភាពគឺដូចគ្នា (រូបភាពទី 3A) (26)។ ដូច្នេះ នេះមានន័យថា អង់ស៊ីមកែច្នៃសេរ៉ាមីត Cwh43 គឺជ្រើសរើសខ្ពស់សម្រាប់សេរ៉ាមីត C26 ដូចបង្ហាញក្នុងរូបភាពទី 26 វាបញ្ចូលយុថ្កា GPI ពីសេរ៉ាមីត C26 បរិមាណតិចតួចនៅក្នុងពូជ GhLag1។ S2 (29)។ យ៉ាងណាក៏ដោយ ភ្នាសកោសិការបស់ GhLag1 ជាទូទៅមានតែសេរ៉ាមីត C18-C16 ប៉ុណ្ណោះ ខណៈពេលដែល Gas1-GFP នៅតែមានសេរ៉ាមីត C26។ ការពិតនេះធ្វើឱ្យពូជនេះក្លាយជាឧបករណ៍ដ៏ល្អមួយដើម្បីដោះស្រាយបញ្ហានៃប្រវែងខ្សែសង្វាក់អាស៊ីលីននៃសេរ៉ាមីតភ្នាសនៅក្នុង ER។ តួនាទីសម្មតិកម្មនៃថ្នាក់ និងការតម្រៀប។ បន្ទាប់មក យើងបានសិក្សាដំបូងអំពីសមត្ថភាពរបស់ C26 Gas1-GFP ក្នុងការប្រមូលផ្តុំជាចង្កោមនៅក្នុង GhLag1 ជាមួយនឹងអាឡែលដែលមានការផ្លាស់ប្តូរសីតុណ្ហភាពនៃ sec31-1 តាមរយៈមីក្រូទស្សន៍ហ្វ្លុយអូរីសស្កូបធម្មតា ដែលមានតែខ្សែសង្វាក់វែង (C18-C16) ប៉ុណ្ណោះដែលមាននៅក្នុងភ្នាស ER Ceramide (រូបភាពទី 3)។ យើងបានសង្កេតឃើញថានៅក្នុង sec31-1 ភាគច្រើននៃ Gas1-GFP ត្រូវបានប្រមូលផ្តុំជាចង្កោម ខណៈពេលដែល Gas1-GFP នៅក្នុង sec31-1 GhLag1 ជាមួយនឹងភ្នាស ER ceramide វែង (C18-C16) ភាគច្រើនមិនត្រូវបានប្រមូលផ្តុំ និងចែកចាយនៅក្នុងភ្នាស ER ទាំងមូលទេ។ ដើម្បីឱ្យច្បាស់លាស់ ដោយសារតែការចងចង្កោមដែលមានមូលដ្ឋានលើ ceramide C26 មានទំនាក់ទំនងយ៉ាងជិតស្និទ្ធទៅនឹង ERES ជាក់លាក់ (រូបភាពទី 1) បន្ទាប់មកយើងបានស៊ើបអង្កេតថាតើដំណើរការនេះក៏អាចពាក់ព័ន្ធនឹងមុខងារនៃយន្តការប្រូតេអ៊ីននាំចេញ ER ដែរឬទេ។ GPI-AP ប្រើប្រព័ន្ធ COPII ពិសេសសម្រាប់ការនាំចេញ ER ដែលត្រូវបានគ្រប់គ្រងយ៉ាងសកម្មដោយការរៀបចំរចនាសម្ព័ន្ធឡើងវិញរបស់ Ted1 នៃផ្នែក glycan នៃយុថ្កា GPI (30, 31)។ បន្ទាប់មក GPI-glycan ដែលបានបង្កើតឡើងវិញត្រូវបានទទួលស្គាល់ដោយស្មុគស្មាញ p24 នៃអ្នកទទួលទំនិញឆ្លងកាត់ភ្នាស ដែលជ្រើសរើស Lst1 ដែលជាអ៊ីសូហ្វមជាក់លាក់នៃអនុឯកតាចងទំនិញ COPII ដ៏សំខាន់ Sec24 បង្កើតជា GPI-AP-rich COPII Vesicles គឺចាំបាច់ (31-33)។ ដូច្នេះ យើងបានបង្កើតការផ្លាស់ប្តូរទ្វេដងដែលរួមបញ្ចូលគ្នានូវការលុបប្រូតេអ៊ីនតែមួយទាំងនេះ (សមាសធាតុស្មុគស្មាញ p24 Emp24 អង់ស៊ីមកែច្នៃ GPI-glycan Ted1 និងអនុឯកតា COPII ជាក់លាក់ Lst1) ជាមួយនឹងពូជផ្លាស់ប្តូរ sec31-1 ហើយបានសិក្សាពួកវាថាតើអាចបង្កើតជាចង្កោម Gas1 GFP បានទេ (រូបភាពទី 3)។ យើងបានសង្កេតឃើញថានៅក្នុង sec31-1emp24Δ និង sec31-1ted1Δ Gas1-GFP ភាគច្រើនមិនត្រូវបានប្រមូលផ្តុំ និងចែកចាយពាសពេញភ្នាស ER ដូចដែលបានឃើញពីមុននៅក្នុង sec31-1 GhLag1 ខណៈពេលដែលនៅក្នុង sec31-1lst1Δ Gas1-GFP ដូចជា sec31-1។ លទ្ធផលទាំងនេះបង្ហាញថា បន្ថែមពីលើវត្តមានរបស់ C26 ceramide នៅក្នុងភ្នាស ER ការដាក់ជាក្រុមនៃ Gas1-GFP ក៏ត្រូវភ្ជាប់ទៅនឹងស្មុគស្មាញ p24 ដែរ ហើយមិនតម្រូវឱ្យមានការជ្រើសរើស Lst1 ជាក់លាក់នោះទេ។ បន្ទាប់មក យើងបានស្វែងយល់ពីលទ្ធភាពដែលប្រវែងខ្សែសង្វាក់នៃ ceramide នៅក្នុងភ្នាស ER អាចគ្រប់គ្រងការភ្ជាប់នៃ Gas1-GFP ទៅ p24។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ យើងបានរកឃើញថាវត្តមានរបស់ C18-C16 ceramide នៅក្នុងភ្នាសមិនប៉ះពាល់ដល់ GPI-glycans ដែលត្រូវបានសាងសង់ឡើងវិញដោយស្មុគស្មាញ p24 (រូបភាព S3 និង S4, A និង B) ឬការភ្ជាប់ទៅនឹង GPI-AP និងការនាំចេញ GPI-AP ទេ។ ជ្រើសរើសប្រភេទរង COPII Lst1 (រូបភាព S4C)។ ដូច្នេះ ការដាក់ជាក្រុមដែលពឹងផ្អែកលើ ceramide C26 មិនតម្រូវឱ្យមានអន្តរកម្មប្រូតេអ៊ីនជាមួយនឹងយន្តការនាំចេញប្រូតេអ៊ីន ER ផ្សេងៗគ្នានោះទេ ប៉ុន្តែគាំទ្រយន្តការតម្រៀបជំនួសដែលជំរុញដោយប្រវែង lipid។ បន្ទាប់មក យើងបានវិភាគថាតើប្រវែងខ្សែសង្វាក់ ceramide acyl នៅក្នុងភ្នាស ER មានសារៈសំខាន់សម្រាប់ការចាត់ថ្នាក់ប្រកបដោយប្រសិទ្ធភាពនៃ Gas1-GFP ជា ERES ជ្រើសរើសឬអត់។ ដោយសារ Gas1 នៅក្នុងពូជ GhLag1 ដែលមាន ceramide ខ្សែខ្លីចាកចេញពី ER ហើយចូលទៅក្នុងភ្នាសប្លាស្មា (រូបភាព S5) យើងជឿជាក់ថា ប្រសិនបើការតម្រៀបត្រូវបានជំរុញដោយប្រវែងនៃខ្សែ ceramide acyl នោះ Gas1 នៅក្នុងពូជ GhLag1 អាចត្រូវបានប្តូរទិស និងឆ្លងកាត់ទំនិញ ERES ដែលមានភ្នាសដូចគ្នា។
(ក) ភ្នាសកោសិការបស់ GhLag1 ភាគច្រើនមានផ្ទុកសេរ៉ាមីត C18-C16 ដែលខ្លីជាង ខណៈពេលដែលយុថ្កា GPI របស់ Gas1-GFP នៅតែមាន C26 IPC ដូចគ្នានឹងកោសិកាប្រភេទព្រៃ។ ខាងលើ៖ ការវិភាគប្រវែងខ្សែសង្វាក់អាស៊ីលីនៃសេរ៉ាមីតនៅក្នុងភ្នាសកោសិកានៃពូជប្រភេទព្រៃ (Wt) និង GhLag1p ដោយម៉ាស្សស្ពិចត្រូម៉ែត្រី (MS)។ ទិន្នន័យតំណាងឱ្យភាគរយនៃសេរ៉ាមីតសរុប។ មធ្យមភាគនៃការពិសោធន៍ឯករាជ្យចំនួនបី។ របារកំហុស = SD។ ការធ្វើតេស្ត t ពីរកន្ទុយដែលមិនបានផ្គូផ្គង។ **** P <0.0001។ បន្ទះខាងក្រោម៖ ការវិភាគ MS នៃប្រវែងខ្សែសង្វាក់អាស៊ីលីនៃ IPC ដែលមានវត្តមាននៅក្នុងយុថ្កា GPI Gas1-GFP (GPI-IPC) ដែលបានបង្ហាញនៅក្នុងពូជប្រភេទព្រៃ និង GhLag1p។ ទិន្នន័យតំណាងឱ្យភាគរយនៃសញ្ញា IPC សរុប។ មធ្យមភាគនៃការពិសោធន៍ឯករាជ្យចំនួនប្រាំ។ របារកំហុស = SD។ ការធ្វើតេស្ត t ពីរកន្ទុយដែលមិនបានផ្គូផ្គង។ ns មិនសំខាន់ទេ។ P = 0.9134។ (ខ) មីក្រូទស្សន៍ហ្វ្លុយអូរីសង់នៃកោសិកា sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ និង sec31-1lst1Δ ដែលបង្ហាញកោសិកា Gas1-GFP ដែលបង្កឡើងដោយ galactose ត្រូវបានភ្ញាស់នៅសីតុណ្ហភាព 37°C រយៈពេល 30 នាទី ហើយបញ្ជូនទៅអនុវត្តមីក្រូទស្សន៍ហ្វ្លុយអូរីសង់ជាប្រចាំបន្ទាប់ពីសីតុណ្ហភាព 24°C។ ព្រួញពណ៌ស៖ ចង្កោម Gas1-GFP ER។ ព្រួញបើក៖ Gas1-GFP ដែលមិនបានចង្កោម ត្រូវបានចែកចាយលើភ្នាស ER ទាំងមូល ដែលបង្ហាញពីការជ្រលក់ពណ៌ចិញ្ចៀននុយក្លេអ៊ែរលក្ខណៈ ER។ របារមាត្រដ្ឋាន 5μm។ (គ) ការវាស់បរិមាណនៃរូបថតមីក្រូទស្សន៍ដែលបានពិពណ៌នានៅក្នុង (ខ)។ ភាគរយជាមធ្យមនៃកោសិកាដែលមានរចនាសម្ព័ន្ធ Gas1-GFP ដែលមានចំណុច។ នៅក្នុងការពិសោធន៍ឯករាជ្យចំនួនបី កោសិកា n≥300។ របារកំហុស = SD។ ការធ្វើតេស្ត t កន្ទុយពីរដែលមិនបានផ្គូផ្គង។ **** P <0.0001។
ដើម្បីដោះស្រាយបញ្ហានេះដោយផ្ទាល់ យើងបានអនុវត្តការមើលឃើញ SCLIM នៃ Gas1-GFP និង Mid2-iRFP នៅក្នុង GhLag1 ជាមួយនឹងអាឡែលដែលងាយនឹងផ្លាស់ប្តូរសីតុណ្ហភាព sec31-1 (រូបភាពទី 4 និងភាពយន្ត S4)។ បន្ទាប់ពី ER ត្រូវបានរក្សាទុកនៅសីតុណ្ហភាព 37°C ហើយបន្ទាប់មកត្រូវបានបញ្ចេញនៅសីតុណ្ហភាព 24°C ភាគច្រើននៃ Gas1-GFP ដែលទើបសំយោគថ្មីមិនត្រូវបានប្រមូលផ្តុំ និងចែកចាយពាសពេញភ្នាស ER ដូចដែលបានសង្កេតឃើញដោយមីក្រូទស្សន៍ធម្មតា (រូបភាពទី 4, A និង B)។ លើសពីនេះ ភាគរយធំនៃ ERES (67%) រួមមានទំនិញពីរប្រភេទដែលមានទីតាំងរួមគ្នានៅក្នុងវា (រូបភាពទី 4D)។ បន្ទះទី 1 និងទី 2 នៃរូបភាពទី 4C បង្ហាញឧទាហរណ៍ធម្មតាពីរនៃ ERES ដែលមាន Gas1-GFP និង Mid2-GFP ត្រួតស៊ីគ្នា។ លើសពីនេះ ទំនិញទាំងពីរត្រូវបានជ្រើសរើសទៅក្នុង ERES ដូចគ្នា (រូបភាពទី 4E បន្ទះទី 3 និងភាពយន្ត S4)។ ដូច្នេះ លទ្ធផលរបស់យើងបង្ហាញថាប្រវែងនៃខ្សែសង្វាក់ ceramide acyl នៅក្នុងភ្នាស ER គឺជាកត្តាកំណត់ដ៏សំខាន់នៃការប្រមូលផ្តុំ និងការចាត់ថ្នាក់ប្រូតេអ៊ីន ER។
កោសិកា Sec31-1 GhLag1 ដែលបញ្ចេញសារធាតុរាវដែលបង្កឡើងដោយ galactose, Gas1-GFP (GPI-AP, ពណ៌បៃតង) និង Mid2-iRFP (TMP, ពណ៌ខៀវ) និង Sec13-mCherry ដែលមានស្លាក ERES ជាប់លាប់ ត្រូវបានភ្ញាស់នៅសីតុណ្ហភាព 37°C។ បន្តរយៈពេល 30 នាទី ធ្លាក់ចុះដល់ 24°C ដើម្បីបញ្ចេញសារធាតុរាវ ហើយថតរូបភាពជាមួយ SCLIM បន្ទាប់ពី 20 នាទី។ (A ដល់ C) រូបភាពបញ្ចាំង 2D តំណាង (A; របារមាត្រដ្ឋាន, 1μm) ឬរូបភាពអឌ្ឍគោលកោសិកា 3D (B និង C; ឯកតាមាត្រដ្ឋាន, 0.45μm) នៃផ្នែក z ចំនួន 10 ដែលសម្គាល់ដោយទំនិញ និង ERES។ បន្ទះខាងក្រោមក្នុង (B) និងបន្ទះក្នុង (C) បង្ហាញរូបភាពដែលបានដំណើរការដើម្បីបង្ហាញតែទំនិញដែលមាននៅក្នុង ERES (ពណ៌ស្វាយ) [Gas1-GFP (ពណ៌ប្រផេះ) និង Mid2-iRFP (ពណ៌ខៀវខ្ចី)]។ (C) ព្រួញពណ៌សបំពេញ៖ ERES ទំនិញត្រួតស៊ីគ្នា។ ព្រួញបើក៖ ERES មានតែធាតុមួយប៉ុណ្ណោះ។ បន្ទះខាងក្រោម៖ ERES ដែលបានជ្រើសរើសមានទំនិញត្រួតស៊ីគ្នា (1 និង 2) ដែលសម្គាល់នៅក្នុង (C)។ របារមាត្រដ្ឋាន 100 nm។ (D) ការវាស់បរិមាណនៃរូបថតមីក្រូទស្សន៍ដែលបានពិពណ៌នានៅក្នុង (C)។ នៅក្នុងឯកតា sec31-1 និង sec31-1 GhLag1 មានតែទំនិញមួយប៉ុណ្ណោះ (Gas1-GFP ឬ Mid2-iRFP) ត្រូវបានរួមបញ្ចូល និងភាគរយជាមធ្យមនៃ ERES សម្រាប់ទំនិញដាច់ដោយឡែក និងទំនិញត្រួតស៊ីគ្នា។ នៅក្នុងការពិសោធន៍ឯករាជ្យចំនួនបី n = 432 ក្នុង 54 ក្រឡា (sec31-1) និង n = 430 ក្នុង 47 ក្រឡា (sec31-1 GhLag1)។ របារកំហុស = SD។ ការធ្វើតេស្ត t ពីរកន្ទុយដែលមិនបានផ្គូផ្គង។ *** P = 0.0002 (sec31-1) និង ** P = 0.0031 (sec31-1 GhLag1)។ (E) រូបភាព 3D នៃ ERES ដែលបានជ្រើសរើសជាមួយនឹងទំនិញត្រួតស៊ីគ្នា (3) ដែលសម្គាល់នៅក្នុង (C)។ Gas1-GFP (ពណ៌បៃតង) និង Mid2-iRFP (ពណ៌ខៀវ) ចូលទៅជិត ERES (ពណ៌ស្វាយ) ពីជ្រុងតែមួយ ហើយស្ថិតនៅក្នុងតំបន់ហាមឃាត់ ERES ដូចគ្នា។ របារមាត្រដ្ឋាន 100 nm។
ការសិក្សានេះផ្តល់នូវភស្តុតាងដោយផ្ទាល់នៅក្នុងខ្លួនថា ទំនិញប្រូតេអ៊ីនដែលមានមូលដ្ឋានលើជាតិខ្លាញ់ត្រូវបានចាត់ថ្នាក់ទៅជាកន្លែងនាំចេញជ្រើសរើសនៅក្នុងផ្លូវបញ្ចេញ ហើយបង្ហាញពីសារៈសំខាន់នៃប្រវែងខ្សែសង្វាក់អាស៊ីលីមសម្រាប់ការជ្រើសរើសចំណាត់ថ្នាក់។ ដោយប្រើបច្ចេកទេសមីក្រូទស្សន៍ដ៏មានអានុភាព និងទំនើបហៅថា SCLIM យើងបានបង្ហាញ Gas1-GFP ដែលទើបសំយោគថ្មី (ភ្នាសប្លាស្មាសំខាន់ GPI-AP ជាមួយនឹងផ្នែកខ្លាញ់សេរ៉ាមីតខ្សែសង្វាក់អាស៊ីលីមវែង (C26) នៅក្នុងផ្សិត)។ តំបន់ដែលប្រមូលផ្តុំនៅក្នុង ER ដាច់ពីគ្នាត្រូវបានផ្សារភ្ជាប់ជាមួយនឹង ERES ជាក់លាក់ ខណៈពេលដែលប្រូតេអ៊ីនដែលបញ្ចេញចេញពីភ្នាសត្រូវបានចែកចាយពាសពេញភ្នាស ER (រូបភាពទី 1)។ លើសពីនេះ ទំនិញទាំងពីរប្រភេទនេះចូលទៅក្នុង ERES ផ្សេងគ្នាដោយជ្រើសរើស (រូបភាពទី 2)។ ប្រវែងខ្សែសង្វាក់អាស៊ីលីមនៃសេរ៉ាមីតកោសិកានៅក្នុងភ្នាសត្រូវបានកាត់បន្ថយពី C26 ទៅ C18-C16 ចង្កោម Gas1-GFP ត្រូវបានបំបែកចូលទៅក្នុងតំបន់ ER ដាច់ពីគ្នា ហើយ Gas1-GFP ត្រូវបានបញ្ជូនបន្តដើម្បីទុក ER ជាមួយប្រូតេអ៊ីនបញ្ជូនភ្នាសតាមរយៈ ERES ដូចគ្នា (រូបភាពទី 3 និងរូបភាពទី 3)។
ទោះបីជា GPI-AP ប្រើប្រាស់យន្តការប្រូតេអ៊ីនឯកទេសដើម្បីចេញពី ER ក៏ដោយ យើងបានរកឃើញថា ការបំបែកដែលពឹងផ្អែកលើសេរ៉ាមីត C26 មិនពឹងផ្អែកលើអន្តរកម្មប្រូតេអ៊ីនឌីផេរ៉ង់ស្យែលដែលអាចនាំឱ្យមានឯកទេស ERES (រូបភាព S4 និង S5)។ ផ្ទុយទៅវិញ ការរកឃើញរបស់យើងគាំទ្រយន្តការចាត់ថ្នាក់ជំនួសដែលជំរុញដោយការដាក់ជាក្រុមប្រូតេអ៊ីនដែលមានមូលដ្ឋានលើ lipid និងការដកចេញជាបន្តបន្ទាប់នៃទំនិញផ្សេងទៀត។ ការសង្កេតរបស់យើងបង្ហាញថា តំបន់ ឬចង្កោម Gas1-GFP ដែលជាប់ទាក់ទងនឹង ERES ជាក់លាក់មួយខ្វះប្រូតេអ៊ីន Mid2-iRFP ដែលបញ្ចេញចេញពីភ្នាស ដែលបង្ហាញថាចង្កោម GPI-AP ដែលពឹងផ្អែកលើសេរ៉ាមីត C26 នឹងជួយសម្រួលដល់ការចូលទៅក្នុង ERES ដែលពាក់ព័ន្ធ ហើយក្នុងពេលជាមួយគ្នានេះ មិនរាប់បញ្ចូលសារធាតុបញ្ចេញចេញពីភ្នាសចូលទៅក្នុង ERES ជាក់លាក់នេះទេ (រូបភាពទី 1 និងទី 2)។ ផ្ទុយទៅវិញ វត្តមាននៃសេរ៉ាមីត C18-C16 នៅក្នុងភ្នាស ER មិនបណ្តាលឱ្យ GPI-AP បង្កើតជាតំបន់ ឬចង្កោមទេ ដូច្នេះពួកវាមិនរាប់បញ្ចូល ឬជំនួសប្រូតេអ៊ីនដែលបញ្ចេញចេញពីភ្នាសទៅក្នុង ERES ដូចគ្នាទេ (រូបភាពទី 3 និងទី 4)។ ដូច្នេះ យើងស្នើថា សេរ៉ាមីត C26 ជំរុញការបំបែក និងការចាត់ថ្នាក់ដោយសម្រួលដល់ការដាក់ជាក្រុមនៃប្រូតេអ៊ីនដែលភ្ជាប់ទៅនឹង ERES ជាក់លាក់។
តើធ្វើដូចម្តេចដើម្បីសម្រេចបាននូវការដាក់ជាក្រុមដែលពឹងផ្អែកលើសេរ៉ាមីត C26 នេះទៅក្នុងតំបន់ ER ជាក់លាក់មួយ? ទំនោរនៃសេរ៉ាមីតភ្នាសដើម្បីបំបែកពីចំហៀងអាចបណ្តាលឱ្យ GPI-AP និងសេរ៉ាមីត C26 បង្កើតជាជាតិខ្លាញ់តូចៗ និងមានលំដាប់លំដោយភ្លាមៗនៅក្នុងបរិស្ថានជាតិខ្លាញ់មិនទៀងទាត់នៃភ្នាស ER ដែលមានគ្លីសេរ៉ូលីពីតខ្លី និងមិនឆ្អែត។ ចង្កោមដែលមានគុណភាព (17, 18)។ ចង្កោមបណ្ដោះអាសន្នតូចៗទាំងនេះអាចត្រូវបានបញ្ចូលគ្នាបន្ថែមទៀតទៅជាចង្កោមធំជាង និងមានស្ថេរភាពជាងមុនបន្ទាប់ពីភ្ជាប់ទៅនឹងស្មុគស្មាញ p24 (34)។ ស្របនឹងរឿងនេះ យើងបានបង្ហាញថា C26 Gas1-GFP ត្រូវការធ្វើអន្តរកម្មជាមួយស្មុគស្មាញ p24 ដើម្បីបង្កើតជាចង្កោមដែលអាចមើលឃើញធំជាង (រូបភាពទី 3)។ ស្មុគស្មាញ p24 គឺជាអូលីហ្គោម័រដែលមានសមាសធាតុ heterozygous ដែលផ្សំឡើងពីប្រូតេអ៊ីនឆ្លងភ្នាស p24 ចំនួនបួនផ្សេងគ្នានៅក្នុងផ្សិត (35) ដែលផ្តល់នូវការភ្ជាប់ពហុវ៉ាឡង់ ដែលអាចនាំឱ្យមានការភ្ជាប់គ្នានៃចង្កោម GPI-AP តូចៗ ដោយហេតុនេះបង្កើតជាចង្កោមដែលមានស្ថេរភាពធំជាង (34)។ អន្តរកម្មរវាង ectodomains ប្រូតេអ៊ីននៃ GPI-APs ក៏អាចរួមចំណែកដល់ការប្រមូលផ្តុំរបស់ពួកវាផងដែរ ដូចដែលបានបង្ហាញក្នុងអំឡុងពេលដឹកជញ្ជូន Golgi របស់ពួកវានៅក្នុងកោសិកា epithelial ដែលមានប៉ូលនៃថនិកសត្វ (36)។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ នៅពេលដែល ceramide C18-C16 មានវត្តមាននៅក្នុងភ្នាស ER នៅពេលដែលស្មុគស្មាញ p24 ភ្ជាប់ទៅនឹង Gas1-GFP ចង្កោមធំៗដាច់ដោយឡែកពីគ្នានឹងមិនត្រូវបានបង្កើតឡើងទេ។ យន្តការមូលដ្ឋានអាចអាស្រ័យលើលក្ខណៈសម្បត្តិរូបវន្ត និងគីមីជាក់លាក់នៃ ceramide ខ្សែសង្វាក់ acyl វែង។ ការសិក្សាជីវរូបវិទ្យានៃភ្នាសសិប្បនិម្មិតបង្ហាញថា ទោះបីជា ceramide ខ្សែសង្វាក់ acyl វែង (C24) និងខ្លី (C18-C16) អាចបណ្តាលឱ្យមានការបំបែកដំណាក់កាលក៏ដោយ មានតែ ceramide ខ្សែសង្វាក់ acyl វែង (C24) ប៉ុណ្ណោះដែលអាចជំរុញការកោងខ្ពស់ និងការពត់កោងខ្សែភាពយន្តដើម្បីផ្លាស់ប្តូររូបរាងខ្សែភាពយន្ត។ តាមរយៈការយោងទៅវិញទៅមក (17, 37, 38)។ វាត្រូវបានបង្ហាញថា វង់ឆ្លងភ្នាសនៃ TMED2 ដែលជា homologue របស់មនុស្សរបស់ Emp24 មានអន្តរកម្មជ្រើសរើសជាមួយ sphingomyelin ដែលមានមូលដ្ឋានលើ ceramide C18 នៅក្នុង lobules ស៊ីតូប្លាស្មិក (39)។ ដោយប្រើការក្លែងធ្វើឌីណាមិកម៉ូលេគុល (MD) យើងបានរកឃើញថា ceramides C18 និង C26 ទាំងពីរកកកុញនៅជុំវិញ lobules ស៊ីតូប្លាស្មិកនៃ helix ឆ្លងភ្នាស Emp24 ហើយពួកវាមានចំណង់ចំណូលចិត្តស្រដៀងគ្នា (រូបភាព S6)។ វាគួរឱ្យកត់សម្គាល់ថា នេះបង្ហាញថា helix ឆ្លងភ្នាសនៃ Emp24 អាចនាំឱ្យមានការចែកចាយមិនស៊ីមេទ្រីនៃ lipids នៅក្នុងភ្នាស។ នេះគឺជាលទ្ធផលថ្មីៗដែលផ្អែកលើកោសិកាថនិកសត្វ។ ការក្លែងធ្វើ MD ស្រដៀងគ្នានេះក៏បង្ហាញពីវត្តមាននៃ lipids អេធើរ (40)។ ដូច្នេះ យើងសន្និដ្ឋានថា ceramide C26 នៅក្នុង lobules ពីរនៃ ER26 គឺសម្បូរទៅដោយមូលដ្ឋាន។ នៅពេលដែល GPI-AP នៅក្នុង lobules luminal ភ្ជាប់ដោយផ្ទាល់ទៅនឹង p24 ពហុវ៉ាឡង់ និងការប្រមូលផ្តុំនៃ C26 ceramide នៅជុំវិញ p24 នៅក្នុង lobules cytoplasmic វាអាចជំរុញការប្រមូលផ្តុំប្រូតេអ៊ីន និងការកោងភ្នាសត្រូវបានបង្កើតតាមរយៈម្រាមដៃ (41) ដែលបណ្តាលឱ្យ GPI-AP បំបែកទៅជាតំបន់ដាច់ពីគ្នានៅជាប់នឹង ERES ដែលក៏ពេញចិត្តតំបន់កោងខ្ពស់នៃភ្នាស ER (42)។ របាយការណ៍មុនៗបានគាំទ្រយន្តការដែលបានស្នើឡើង (43, 44)។ ការភ្ជាប់ពហុវ៉ាឡង់នៃ oligolectins ភ្នាក់ងារបង្ករោគ ឬអង្គបដិប្រាណទៅនឹង glycosphingolipids (GSL) ដែលមានមូលដ្ឋានលើ ceramide នៅលើភ្នាសប្លាស្មាបង្កឱ្យមានការប្រមូលផ្តុំ GSL ដ៏ធំ បង្កើនការបំបែកដំណាក់កាល និងបណ្តាលឱ្យមានការខូចទ្រង់ទ្រាយភ្នាស និងការធ្វើផ្ទៃក្នុង (44)។ Iwabuchi ជាដើម (43) គេបានរកឃើញថា នៅក្នុងវត្តមាននៃខ្សែសង្វាក់អាស៊ីលវែង (C24) ប៉ុន្តែមិនមែនខ្សែសង្វាក់ខ្លី (C16) សារធាតុភ្ជាប់ពហុវ៉ាឡង់ដែលភ្ជាប់ទៅនឹងឡាក់តូស៊ីលសេរ៉ាមីត GSL បានបង្កឱ្យមានការបង្កើតចង្កោមធំៗ និងការលុកលុយភ្នាស ហើយការបញ្ជូនសញ្ញាដែលសម្របសម្រួលដោយលីននៅលើខិត្តប័ណ្ណត្រូវបានបញ្ចូលទៅក្នុងឌីជីតាទីកដោយខ្សែសង្វាក់អាស៊ីលនៅក្នុងនឺត្រូហ្វីលដែលភ្ជាប់គ្នា។
នៅក្នុងកោសិកាអេពីធីលីលដែលមានប៉ូលរបស់ថនិកសត្វ កំហាប់នៃបណ្តាញប្រឆាំងហ្គោលជី (TGN) ដល់កម្រិតនៃភ្នាសប្លាស្មាកំពូលគ្រប់គ្រងការបំបែក និងការតម្រៀបនៃ GPI-AP (10, 45)។ ការប្រមូលផ្តុំនេះត្រូវបានជំរុញដោយអូលីហ្គោមេរីសាស្យុង GPI-AP (36) ប៉ុន្តែវាក៏អាចអាស្រ័យលើប្រវែងខ្សែសង្វាក់សេរ៉ាមីតដែលយើងរកឃើញនៅក្នុងផ្សិតផងដែរ។ ទោះបីជា GPI-AP របស់ថនិកសត្វមានយុថ្កាដែលមានមូលដ្ឋានលើអ៊ីធើរលីពីត ហើយរចនាសម្ព័ន្ធគីមីរបស់វាគឺខុសគ្នាខ្លាំងពីសេរ៉ាមីតខ្សែសង្វាក់អាស៊ីលីនដែលវែងខ្លាំងក៏ដោយ ការសិក្សាថ្មីៗនេះបានរកឃើញថា លីពីតទាំងពីរមានលក្ខណៈសម្បត្តិរូបវន្ត និងគីមីស្រដៀងគ្នាខាងវិវត្តន៍ និងមុខងារ (40)។ ដូច្នេះ ផ្នែកលីពីតអេធើរនៅក្នុងកោសិកាថនិកសត្វអាចស្រដៀងនឹងសេរ៉ាមីត C26 នៅក្នុងផ្សិត ហើយតួនាទីរបស់វាគឺភ្ជាប់ជាមួយសេរ៉ាមីតខ្សែសង្វាក់វែងនៅក្នុងភ្នាសដើម្បីលើកកម្ពស់ការប្រមូលផ្តុំ និងការតម្រៀប GPI-AP។ ទោះបីជាលទ្ធភាពនេះនៅតែត្រូវការធ្វើតេស្តដោយផ្ទាល់ក៏ដោយ ការរកឃើញពីមុនគាំទ្រថាការដឹកជញ្ជូនសេរ៉ាមីតខ្សែសង្វាក់អាស៊ីលីវវែងទៅកាន់តួ Golgi មិនត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រូតេអ៊ីនផ្ទេរស៊ីតូប្លាស្មិកទេ ប៉ុន្តែអាស្រ័យលើការសំយោគយុថ្កា GPI ដូចជាផ្សិត។ ដូច្នេះ យន្តការអភិរក្សវិវត្តន៍ហាក់ដូចជាអាចដឹកជញ្ជូនសេរ៉ាមីតខ្សែសង្វាក់អាស៊ីលីវវែងខ្លាំង និង GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) ដោយជ្រើសរើសរួមគ្នានៅក្នុងវីស៊ីខលដឹកជញ្ជូនដូចគ្នា។
នៅក្នុងប្រព័ន្ធកោសិកាអេពីធីលីលដែលមានប៉ូលរបស់ផ្សិត និងថនិកសត្វ ការប្រមូលផ្តុំ និងការបំបែក GPI-AP ពីប្រូតេអ៊ីនភ្នាសប្លាស្មាផ្សេងទៀតទាំងអស់កើតឡើងមុនពេលទៅដល់ផ្ទៃកោសិកា។ Paladino et al. (48) បានរកឃើញថានៅលើ TGN នៃកោសិកាអេពីធីលីលដែលមានប៉ូលរបស់ថនិកសត្វ ការដាក់ជាក្រុម GPI-AP មិនត្រឹមតែចាំបាច់សម្រាប់ការចាត់ថ្នាក់ជ្រើសរើសនៃ GPI-APs ទៅនឹងភ្នាសប្លាស្មាកំពូលប៉ុណ្ណោះទេ ប៉ុន្តែថែមទាំងគ្រប់គ្រងការរៀបចំការដាក់ជាក្រុមនៃ GPI-APs និងសកម្មភាពជីវសាស្រ្តរបស់វាផងដែរ។ ផ្ទៃកោសិកា។ នៅក្នុងផ្សិត ការសិក្សានេះបានបង្ហាញថា ចង្កោម GPI-AP ដែលពឹងផ្អែកលើសេរ៉ាមីត C26 នៅលើ ER អាចគ្រប់គ្រងការរៀបចំចង្កោម និងសកម្មភាពមុខងាររបស់ GPI-AP នៅលើភ្នាសប្លាស្មា (24, 49)។ ស្របនឹងគំរូនេះ កោសិកា GhLag1 មានអាឡែស៊ីទៅនឹងថ្នាំទប់ស្កាត់ GPI ឬថ្នាំដែលប៉ះពាល់ដល់ភាពសុចរិតនៃជញ្ជាំងកោសិកា (28) ហើយតម្រូវការសម្រាប់ចង្កោម Gas1-GFP ដែលមានមុខងារ (49) នៃសេរ៉ាមីតចុងដែលបានព្យាករនៅក្នុងការរួមផ្សំនៃកោសិកាផ្សិតបង្ហាញពី G ផលវិបាកសរីរវិទ្យាដែលអាចកើតមាននៃកោសិកា hLag1។ កំហុស GPI-AP។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ ការធ្វើតេស្តបន្ថែមថាតើការរៀបចំមុខងារនៃផ្ទៃកោសិកាត្រូវបានសរសេរកម្មវិធីពី ER ដោយវិធីសាស្ត្រតម្រៀបដោយផ្អែកលើប្រវែងជាតិខ្លាញ់ឬអត់ នឹងជាប្រធានបទនៃការស្រាវជ្រាវនាពេលអនាគតរបស់យើង។
ពូជ Saccharomyces cerevisiae ដែលប្រើក្នុងការងារនេះត្រូវបានរាយក្នុងតារាង S1។ ពូជ MMY1583 និង MMY1635 នៃ SCLIM សម្រាប់ការថតរូបភាពកោសិការស់ត្រូវបានបង្កើតឡើងនៅផ្ទៃខាងក្រោយនៃ W303។ ពូជទាំងនេះដែលបង្ហាញ Sec13-mCherry ជាមួយនឹងស្លាកប្រូតេអ៊ីន fluorescent ត្រូវបានបង្កើតឡើងដោយប្រើវិធីសាស្ត្រផ្អែកលើប្រតិកម្មខ្សែសង្វាក់ polymerase (PCR) ជាមួយ plasmid pFA6a ជាគំរូ (23)។ ពូជដែលបង្ហាញ Mid2-iRFP ដែលដាក់ស្លាកជាមួយប្រូតេអ៊ីន fluorescent ក្រោមការគ្រប់គ្រងរបស់ប្រូម៉ូទ័រ GAL1 ត្រូវបានបង្កើតឡើងដូចខាងក្រោម។ ការពង្រីក PCR នៃលំដាប់ iRFP-KanMx ពីវ៉ិចទ័រ pKTiRFP-KAN (អំណោយរបស់ E. O'Shea, លេខ plasmid Addgene 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; ឧបករណ៍កំណត់អត្តសញ្ញាណធនធានស្រាវជ្រាវ (RRID): Addgene_64687) ហើយបញ្ចូលទៅក្នុង C-terminus នៃ Mid2 ដើម។ បន្ទាប់ពីលំដាប់ហ្សែន Mid2-iRFP ត្រូវបានពង្រីក និងក្លូនចូលទៅក្នុងប្រូម៉ូទ័រ GAL1 វាត្រូវបានបញ្ចូលទៅក្នុងទីតាំង Not I-Sac I នៃប្លាស្មីតសមាហរណកម្ម pRS306។ ប្លាស្មីត pRGS7 លទ្ធផលត្រូវបានធ្វើលីនេអ៊ែរជាមួយ Pst I ដើម្បីបញ្ចូលទៅក្នុងទីតាំង URA3។
ហ្សែនផ្សំ Gas1-GFP ត្រូវបានបង្ហាញក្រោមការគ្រប់គ្រងរបស់ប្រូម៉ូទ័រ GAL1 នៅក្នុងប្លាស្មីតសេនត្រូមៀរ (CEN) ដែលត្រូវបានបង្កើតឡើងដូចខាងក្រោម។ លំដាប់ Gas1-GFP ត្រូវបានពង្រីកដោយ PCR ពីប្លាស្មីត pRS416-GAS1-GFP (24) (អំណោយរបស់ L. Popolo) ហើយត្រូវបានក្លូនទៅក្នុងទីតាំង Xma I–Xho I នៃប្លាស្មីត CEN pBEVY-GL LEU2 (អំណោយរបស់ C)។ Miller; លេខប្លាស្មីត Addgene 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225)។ ប្លាស្មីតលទ្ធផលត្រូវបានគេដាក់ឈ្មោះថា pRGS6។ ហ្សែនផ្សំ Axl2-GFP ក៏ត្រូវបានបង្ហាញក្រោមការគ្រប់គ្រងរបស់ប្រូម៉ូទ័រ GAL1 នៃវ៉ិចទ័រ pBEVY-GL LEU2 ហើយការសាងសង់របស់វាមានដូចខាងក្រោម។ លំដាប់ Axl2-GFP ត្រូវបានពង្រីកពីប្លាស្មីត pRS304-p2HSE-Axl2-GFP (23) ដោយ PCR ហើយត្រូវបានក្លូនចូលទៅក្នុងទីតាំង Bam HI-Pst I នៃវ៉ិចទ័រ pBEVY-GL LEU2។ ប្លាស្មីតលទ្ធផលត្រូវបានគេដាក់ឈ្មោះថា pRGS12។ លំដាប់នៃអូលីហ្គោនុយក្លេអូទីតដែលប្រើក្នុងការសិក្សានេះត្រូវបានរាយក្នុងតារាង S2។
ពូជនេះត្រូវបានបំពេញបន្ថែមដោយអាដេនីន 0.2% និងគ្លុយកូស 2% [YP-dextrose (YPD)], ប្រូតេអ៊ីនចំរាញ់ចេញពីដំបែសម្បូររ៉ាហ្វីណូស 2% [YP-raffinose] (YP) មធ្យម (1% ចំរាញ់ចេញពីដំបែ និងប្រូតេអ៊ីន ept 2%)។ (YPR)] ឬហ្គាឡាក់តូស 2% [YP-galactose (YPG)] ជាប្រភពកាបូន ឬក្នុងមធ្យមសំយោគអប្បបរមា (មូលដ្ឋានអាសូតដំបែ 0.15% និងស៊ុលហ្វាតអាម៉ូញ៉ូម 0.5%) ដើម្បីបំពេញបន្ថែមអាស៊ីតអាមីណូ និងមូលដ្ឋានសមស្របដែលត្រូវការសម្រាប់អាហារូបត្ថម្ភ និងមានផ្ទុកគ្លុយកូស 2% (មធ្យមសំយោគគ្លុយកូសអប្បបរមា) ឬហ្គាឡាក់តូស 2% (មធ្យមសំយោគហ្គាឡាក់តូសអប្បបរមា) ជាប្រភពកាបូន។
សម្រាប់ការថតរូបភាពជាក់ស្តែង កោសិកាដែលមានការផ្លាស់ប្តូរហ្សែន sec31-1 ដែលងាយនឹងប្រតិកម្មនឹងសីតុណ្ហភាព ដែលបង្ហាញរចនាសម្ព័ន្ធនៅក្រោមប្រូម៉ូទ័រ GAL1 ត្រូវបានដាំដុះនៅក្នុងឧបករណ៍ផ្ទុក YPR នៅសីតុណ្ហភាព 24°C ពេញមួយយប់ រហូតដល់ដំណាក់កាល mid-log។ បន្ទាប់ពីបញ្ចូល YPG នៅសីតុណ្ហភាព 24°C រយៈពេល 1 ម៉ោង កោសិកាត្រូវបានភ្ញាស់នៅក្នុង SG នៅសីតុណ្ហភាព 37°C រយៈពេល 30 នាទី ហើយបន្ទាប់មកផ្ទេរទៅ 24°C ដើម្បីបញ្ចេញចេញពីប្លុកបញ្ចេញ។ Concanavalin A ត្រូវបានប្រើដើម្បីជួសជុលកោសិកានៅលើស្លាយកញ្ចក់ និងថតរូបភាពដោយ SCLIM។ SCLIM គឺជាការរួមបញ្ចូលគ្នានៃមីក្រូទស្សន៍ហ្វ្លុយអូរីសស៊ីនបញ្ច្រាស Olympus IX-71 និងកែវថតប្រេង UPlanSApo 100×1.4 រន្ធលេខ (Olympus) ម៉ាស៊ីនស្កេនឌីសបង្វិលខនហ្វូកាល់ល្បឿនលឿន និងសមាមាត្រសញ្ញាទៅសំឡេងរំខានខ្ពស់ (Yokogawa Electric) ស្ពិចត្រូម៉ែត្រផ្ទាល់ខ្លួន និងប្រព័ន្ធត្រជាក់ផ្ទាល់ខ្លួន។ ឧបករណ៍បង្កើនប្រសិទ្ធភាពរូបភាពរបស់ប្រព័ន្ធ (Hamamatsu Photonics) អាចផ្តល់ប្រព័ន្ធកែវពង្រីកជាមួយនឹងការពង្រីកចុងក្រោយ ×266.7 និងកាមេរ៉ាឧបករណ៍ភ្ជាប់បន្ទុកដែលគុណអេឡិចត្រុង (Hamamatsu Photonics) (21)។ ការទទួលបានរូបភាពត្រូវបានអនុវត្តដោយកម្មវិធីផ្ទាល់ខ្លួន (Yokogawa Electric)។ សម្រាប់រូបភាព 3D យើងបានប្រើឧបករណ៍បញ្ជា piezoelectric ដែលផលិតតាមតម្រូវការដើម្បីញ័រកែវថតបញ្ឈរ ហើយបានប្រមូលផ្នែកអុបទិក 100 nm ពីគ្នាក្នុងជង់មួយ។ រូបភាព Z-stack ត្រូវបានបំប្លែងទៅជាទិន្នន័យ voxel 3D ហើយមុខងាររីករាលដាលចំណុចទ្រឹស្តីដែលប្រើសម្រាប់មីក្រូទស្សន៍ខនហ្វូកាល់ឌីសបង្វិលត្រូវបានប្រើសម្រាប់ដំណើរការ deconvolution ដោយកម្មវិធី Volocity (PerkinElmer)។ តាមរយៈការប្រើប្រាស់កម្មវិធី Volocity ដើម្បីកំណត់កម្រិតដោយស្វ័យប្រវត្តិសម្រាប់ការវិភាគទីតាំងរួមគ្នា ERES រួមទាំងទំនិញត្រូវបានវាស់វែង។ ការវិភាគស្កេនបន្ទាត់ត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើកម្មវិធី MetaMorph (ឧបករណ៍ម៉ូលេគុល)។
សូមប្រើប្រាស់កម្មវិធី GraphPad Prism ដើម្បីកំណត់សារៈសំខាន់ខាងស្ថិតិ។ ចំពោះការធ្វើតេស្ត t របស់សិស្សដែលមានកន្ទុយពីរ និងការធ្វើតេស្តវិភាគភាពខុសគ្នាតាមវិធីតែមួយធម្មតា (ANOVA) ភាពខុសគ្នារវាងក្រុមនានាត្រូវបានគេចាត់ទុកថាមានផលប៉ះពាល់យ៉ាងសំខាន់ទៅលើ P <0.05 (*)។
ចំពោះមីក្រូទស្សន៍ហ្វ្លុយអូរីសស្យុងនៃ Gas1-GFP កោសិកាដំណាក់កាលឡូកត្រូវបានដាំដុះពេញមួយយប់នៅក្នុង YPD ហើយប្រមូលដោយការបង្វិល លាងសម្អាតពីរដងជាមួយអំបិលផូស្វាត ហើយភ្ញាស់លើទឹកកកយ៉ាងហោចណាស់ 15 នាទី ហើយបន្ទាប់មកបន្តនៅក្រោមមីក្រូទស្សន៍ដូចដែលបានពិពណ៌នាពីមុន (24)។ មីក្រូទស្សន៍ Leica DMi8 (HCX PL APO 1003/1.40 ប្រេង PH3 CS) បំពាក់ដោយកែវថតគោលបំណង តម្រង L5 (GFP) កាមេរ៉ា Hamamatsu និងកម្មវិធី Application Suite X (LAS X) ត្រូវបានប្រើសម្រាប់ការទទួលបាន។
សំណាកត្រូវបានបំប្លែងជាសារធាតុជាមួយសារធាតុរាវសំណាក SDS នៅសីតុណ្ហភាព 65°C រយៈពេល 10 នាទី ហើយបន្ទាប់មកបំបែកដោយសារធាតុ SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE)។ សម្រាប់ការវិភាគអ៊ីមមូណូប្លូទីង សំណាក 10 μl ត្រូវបានផ្ទុកក្នុងមួយគន្លង។ អង្គបដិប្រាណបឋម៖ ប្រើសារធាតុ polyclonal anti-Gas1 របស់ទន្សាយក្នុងកម្រិតពនលាយ 1:3000, polyclonal anti-Emp24 របស់ទន្សាយក្នុងកម្រិតពនលាយ 1:500 និង polyclonal anti-GFP របស់ទន្សាយ (ជាអំណោយពី H. Riezman) ក្នុងកម្រិតពនលាយ 1:3000។ អង្គបដិប្រាណ monoclonal anti-Pgk1 របស់កណ្ដុរត្រូវបានប្រើក្នុងកម្រិតពនលាយ 1:5000 (ជាអំណោយពី J. de la Cruz)។ អង្គបដិប្រាណបន្ទាប់បន្សំ៖ អ៊ីមមូណូក្លូណាលប្រឆាំងទន្សាយពពែដែលភ្ជាប់ជាមួយ Horseradish peroxidase (HRP) ដែលប្រើក្នុងកម្រិតពនលាយ 1:3000 (Pierce)។ អង្គបដិប្រាណ IgG ប្រឆាំងកណ្ដុរដែលភ្ជាប់ជាមួយ HRP ត្រូវបានប្រើក្នុងកម្រិតពនលាយ 1:3000 (Pierce)។ តំបន់ឆ្លើយតបនៃភាពស៊ាំត្រូវបានសង្កេតឃើញដោយវិធីសាស្ត្រ chemiluminescence នៃសារធាតុ SuperSignal West Pico (Thermo Fisher Scientific)។
ដូចដែលបានពិពណ៌នានៅក្នុង (31) ការពិសោធន៍ immunoprecipitation ធម្មជាតិត្រូវបានអនុវត្តលើប្រភាគ ER ដែលសំបូរទៅដោយសារធាតុ។ សរុបមក លាងសម្អាតកោសិកាផ្សិតជាមួយសារធាតុ TNE buffer [50 mM tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride និងល្បាយ protease inhibitor) នៅ 600 nm (OD600) នៅដង់ស៊ីតេអុបទិក 100 ពីរដង។ វាត្រូវបានបំបែកដោយអង្កាំកញ្ចក់ ហើយបន្ទាប់មកកំទេចកំទីកោសិកា និងអង្កាំកញ្ចក់ត្រូវបានយកចេញដោយការបង្វិល។ បន្ទាប់មកសារធាតុរាវខាងលើត្រូវបានបង្វិលនៅ 17,000 g រយៈពេល 15 នាទីនៅសីតុណ្ហភាព 4°C។ គ្រាប់ត្រូវបានរំលាយឡើងវិញនៅក្នុង TNE ហើយ digitalis saponin ត្រូវបានបន្ថែមទៅកំហាប់ចុងក្រោយ 1%។ ស៊ុស្ប៉ង់ស្យុងត្រូវបានភ្ញាស់រយៈពេល 1 ម៉ោងជាមួយនឹងការបង្វិលនៅ 4°C ហើយបន្ទាប់មកសមាសធាតុដែលមិនរលាយត្រូវបានយកចេញដោយការបង្វិលនៅ 13,000 g នៅ 4°C រយៈពេល 60 នាទី។ ចំពោះការភ្ញាស់កោសិកា Gas1-GFP ដំបូងត្រូវភ្ញាស់គំរូជាមុនជាមួយអង្កាំ agarose ទទេ (ChromoTek) នៅសីតុណ្ហភាព 4°C រយៈពេល 1 ម៉ោង ហើយបន្ទាប់មកភ្ញាស់ជាមួយ GFP-Trap_A (ChromoTek) នៅសីតុណ្ហភាព 4°C រយៈពេល 3 ម៉ោង។ អង្កាំដែលត្រូវបានភ្ញាស់ត្រូវបានលាងសម្អាតប្រាំដងជាមួយ TNE ដែលមានផ្ទុក digoxigenin 0.2% ដែលត្រូវបានលាងសម្អាតជាមួយសារធាតុ SDS sample buffer បំបែកនៅលើ SDS-PAGE និងវិភាគដោយ immunoblotting។
ដូចដែលបានពិពណ៌នានៅក្នុង (31) ការកំណត់តំណភ្ជាប់ឆ្លងកាត់ត្រូវបានអនុវត្តលើប្រភាគ ER ដែលសំបូរទៅដោយសារធាតុ។ សរុបមក ប្រភាគ ER ដែលសំបូរទៅដោយសារធាតុនេះត្រូវបានភ្ញាស់ជាមួយ 0.5 mM dithiobis(succinimidyl propionate) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA; 20°C, 20 នាទី)។ ប្រតិកម្មតំណភ្ជាប់ឆ្លងកាត់ត្រូវបានពន្លត់ដោយបន្ថែម glycine (កំហាប់ចុងក្រោយ 50 mM, 5 នាទី, 20°C)។
ដូចដែលបានពិពណ៌នាពីមុន (50) ការវិភាគ MS នៃសេរ៉ាមីតនៅក្នុងពូជប្រភេទធម្មជាតិ និង GhLag1 ត្រូវបានអនុវត្ត។ សរុបមក កោសិកាត្រូវបានដាំដុះដល់ដំណាក់កាលអិចស្ប៉ូណង់ស្យែល (3 ទៅ 4 OD600 ឯកតា/មីលីលីត្រ) ក្នុង YPD នៅសីតុណ្ហភាព 30°C ហើយកោសិកាចំនួន 25×107 ត្រូវបានប្រមូលផល។ ការរំលាយអាហាររបស់ពួកវាត្រូវបានពន្លត់ដោយអាស៊ីតទ្រីក្លរ៉ូអាសេទិក។ ប្រើសារធាតុរំលាយ [អេតាណុល ទឹក អេធើរ ពីរីឌីន និងអាម៉ូញ៉ូមអ៊ីដ្រូស៊ីត 4.2 N (15:15:5:1:0.018 v/v)] និង 1.2 nmol នៃសេរ៉ាមីតស្តង់ដារផ្ទៃក្នុង C17 (860517 គុណភាព Avanti polar lipid))។ ប្រើសារធាតុប្រតិកម្មម៉ូណូមេទីឡាមីន [មេតាណុល ទឹក ដំណោះស្រាយ n-butanol និងមេទីឡាមីន (4:3:1:5 v/v)] ដើម្បីអនុវត្តការរំលាយអាល់កាឡាំងស្រាលនៃសារធាតុចម្រាញ់ ហើយបន្ទាប់មកប្រើ n-butanol ដែលឆ្អែតដោយទឹកដើម្បីរំលាយអំបិល។ ជាចុងក្រោយ សារធាតុចម្រាញ់ត្រូវបានរំលាយឡើងវិញក្នុងសារធាតុរំលាយរបៀបវិជ្ជមាន [ក្លរ៉ូហ្វម/មេតាណុល/ទឹក (2:7:1) + 5 mM អាម៉ូញ៉ូមអាសេតាត] ហើយចាក់ចូលទៅក្នុងម៉ាស៊ីនវាស់ម៉ាស។ ការតាមដានប្រតិកម្មច្រើន (MRM) ត្រូវបានអនុវត្តសម្រាប់ការកំណត់អត្តសញ្ញាណ និងការវាស់បរិមាណម៉ូលេគុលស្ហ្វីងហ្គោលីពីត។ ម៉ាស៊ីនវាស់ម៉ាសស្ហ្វីងហ្គោលីពីតទីបី TSQ Vantage (Thermo Fisher Scientific) ត្រូវបានបំពាក់ដោយប្រភពអ៊ីយ៉ុងណាណូហ្វ្លូបរ៉ូបូត Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) សម្រាប់ការវិភាគលីពីត។ ថាមពលប៉ះទង្គិចត្រូវបានធ្វើឱ្យប្រសើរសម្រាប់ប្រភេទសេរ៉ាមីតនីមួយៗ។ ទិន្នន័យ MS ត្រូវបានទទួលក្នុងរបៀបវិជ្ជមាន។ សម្រាប់ការចម្លងជីវសាស្រ្តនីមួយៗ សញ្ញាលីពីតគឺជាមេឌីយ៉ាននៃការវាស់វែងឯករាជ្យចំនួនបី។
ដូចដែលបានពិពណ៌នានៅក្នុង (31) កោសិកា (800 × 107) ដែលបញ្ចេញ Gas1-GFP ត្រូវបានទទួលរងនូវប្រតិកម្ម immunoprecipitation ធម្មជាតិ។ Gas1-GFP ដែលបានបន្សុទ្ធត្រូវបានបំបែកដោយ SDS-PAGE ហើយត្រូវបានផ្ទេរទៅភ្នាស polyvinylidene fluoride (PVDF)។ ប្រូតេអ៊ីនត្រូវបានមើលឃើញដោយការជ្រលក់ពណ៌ PVDF ជាមួយអាមីតខ្មៅ។ បន្ទះ Gas1-GFP ត្រូវបានកាត់ចេញពី PVDF ហើយលាងសម្អាត 5 ដងជាមួយមេតាណុល និងម្តងជាមួយទឹកថ្នាក់ chromatography-MS (LC-MS)។ តាមរយៈការភ្ញាស់បន្ទះភ្នាសជាមួយ 500μl 0.3 M NaOAc (pH 4.0) សារធាតុ buffer និងល្បាយ sodium nitrite 1 M រលាយថ្មីៗ 500μl នៅសីតុណ្ហភាព 37°C រយៈពេល 3 ម៉ោង ប្រភាគ lipid ត្រូវបានបញ្ចេញចេញពី Gas1-GFP ហើយរលាយ។ ការបញ្ចេញ inosine phosphate ceramide រវាង glucosamine និង inositol (51)។ បន្ទាប់ពីនោះ បន្ទះភ្នាសត្រូវបានលាងសម្អាតចំនួនបួនដងជាមួយទឹកថ្នាក់ LC-MS សម្ងួតនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់ ហើយរក្សាទុកក្នុងបរិយាកាសអាសូតនៅសីតុណ្ហភាព -80°C រហូតដល់ការវិភាគ។ ក្នុងនាមជាការគ្រប់គ្រង គំរូទទេនៃភ្នាស PVDF ត្រូវបានប្រើសម្រាប់ការពិសោធន៍នីមួយៗ។ ជាតិខ្លាញ់ដែលស្រង់ចេញពី Gas1-GFP បន្ទាប់មកត្រូវបានវិភាគដោយ MS ដូចដែលបានពិពណ៌នា (50)។ សរុបមក បន្ទះ PVDF ដែលមានជាតិខ្លាញ់ GPI ត្រូវបានរំលាយឡើងវិញនៅក្នុងសារធាតុរំលាយផ្សិតអវិជ្ជមាន 75μl [ក្លរ៉ូហ្វម/មេតាណុល (1:2) + អាម៉ូញ៉ូមអាសេតាត 5 mM] ហើយបានឆ្លងកាត់ការវិភាគអ៊ីយ៉ូដអេឡិចត្រូស្ព្រាយ (ESI)-MRM/MS នៃប្រភេទស្ហ្វីងហ្គោលីពីត (TSQ Vantage)។ ក្នុងករណីនេះ ទិន្នន័យ MS ត្រូវបានទទួលក្នុងរបៀបអ៊ីយ៉ុងអវិជ្ជមាន។
ដូចដែលបានរៀបរាប់ខាងលើ ផ្នែកលីពីតនៃយុថ្កា GPI ត្រូវបានបំបែកចេញពី GPI-AP ដែលមានស្លាក [3H]-អ៊ីណូស៊ីតូល (16)។ លីពីតត្រូវបានបំបែកដោយក្រូម៉ាតូក្រាហ្វីស្រទាប់ស្តើងដោយប្រើប្រព័ន្ធសារធាតុរំលាយ (55:45:10 ក្លរ៉ូហ្វម-មេតាណុល-0.25% KCl) និងមើលឃើញដោយប្រើ FLA-7000 (Fujifilm)។
កោសិកាដែលបញ្ចេញ Gas1-GFP (600×107) ត្រូវបានលាងសម្អាតពីរដងជាមួយសារធាតុ TNE buffer ជាមួយសារធាតុ TNE buffer ហើយបំបែកជាមួយអង្កាំកញ្ចក់ ហើយបន្ទាប់មកបង្វិលដើម្បីយកកំទេចកំទីកោសិកា និងអង្កាំកញ្ចក់ចេញ។ បន្ទាប់មកសារធាតុរាវខាងលើត្រូវបានបង្វិលនៅ 17,000 g រយៈពេល 1 ម៉ោងនៅសីតុណ្ហភាព 4°C។ គ្រាប់ត្រូវបានលាងសម្អាតក្នុង TNE ហើយភ្ញាស់ជាមួយ 1 U PI-PLC (Invitrogen) ក្នុង TNE ដែលមានផ្ទុក digitalis saponin 0.2% រយៈពេល 1 ម៉ោងនៅសីតុណ្ហភាព 37°C។ បន្ទាប់ពីការព្យាបាលដោយអង់ស៊ីម ភ្នាសត្រូវបានយកចេញដោយការបង្វិលនៅ 17,000 g នៅសីតុណ្ហភាព 4°C រយៈពេល 1 ម៉ោង។ ដើម្បីធ្វើឱ្យ Gas1-GFP សកម្ម សារធាតុរាវខាងលើត្រូវបានភ្ញាស់ជាមួយ GFP-Trap_A (ChromoTek) នៅសីតុណ្ហភាព 4°C ពេញមួយយប់។ Gas1-GFP ដែលបានបន្សុទ្ធដោយ SDS-PAGE ត្រូវបានលាបពណ៌ដោយ Coomassie brilliant blue។ បន្ទះពណ៌ Gas1-GFP ត្រូវបានកាត់ចេញពីពណ៌ប្រផេះជុំវិញបំពង់ទឹក ហើយបន្ទាប់មកបន្ទាប់ពីអាល់គីឡាស្យុងជាមួយអ៊ីយ៉ូដូអាសេតាមីត និងការកាត់បន្ថយជាមួយឌីធីអូទ្រីអ៊ីតូល ការរំលាយអាហារក្នុងជែលជាមួយទ្រីបស៊ីនត្រូវបានអនុវត្ត។ សារធាតុចម្រាញ់ និងសម្ងួតប៉ិបទីក និងប៉ិបទីតជាមួយ GPI-glycans។ ប៉ិបទីតស្ងួតត្រូវបានរំលាយក្នុងទឹក 20 μl។ ចាក់មួយផ្នែក (8μl) ចូលទៅក្នុង LC។ ជួរឈរ octadecylsilane (ODS) (Develosil 300ODS-HG-5; អង្កត់ផ្ចិតខាងក្នុង 150 mm × 1.0 mm; Nomura Chemical, Aichi Prefecture, ប្រទេសជប៉ុន) ត្រូវបានប្រើដើម្បីបំបែកប៉ិបទីតក្រោមលក្ខខណ្ឌជម្រាលជាក់លាក់។ ដំណាក់កាលចល័តគឺសារធាតុរំលាយ A (អាស៊ីតហ្វមិក 0.08%) និងសារធាតុរំលាយ B (អាស៊ីតហ្វមិក 0.15% ក្នុងអាសេតូនីទ្រីល 80%)។ ប្រព័ន្ធ Accela HPLC (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) ត្រូវបានប្រើដើម្បី elut ជួរឈរជាមួយសារធាតុរំលាយ A ក្នុងរយៈពេល 55 នាទីក្នុងអត្រាលំហូរ 50 μl min-1 រយៈពេល 5 នាទី ហើយបន្ទាប់មកកំហាប់នៃសារធាតុរំលាយ B ត្រូវបានកើនឡើងដល់ 40% (សហរដ្ឋអាមេរិក)។ សារធាតុ eluate ត្រូវបានណែនាំជាបន្តបន្ទាប់ទៅក្នុងប្រភពអ៊ីយ៉ុង ESI ហើយ peptides tryptic និង peptides ជាមួយ GPI-glycans ត្រូវបានវិភាគដោយ LTQ Orbitrap XL (hybrid linear ion trap-orbitrap mass spectrometer; Thermo Fisher Scientific)។ នៅក្នុងការរៀបចំ MS វ៉ុលនៃប្រភព capillary ត្រូវបានកំណត់ទៅ 4.5 kV ហើយសីតុណ្ហភាពនៃ capillary ផ្ទេរត្រូវបានរក្សាទុកនៅ 300°C។ វ៉ុល capillary និងវ៉ុលកែវបំពង់ត្រូវបានកំណត់ទៅ 15 V និង 50 V រៀងៗខ្លួន។ ទិន្នន័យ MS ត្រូវបានទទួលក្នុងរបៀបអ៊ីយ៉ុងវិជ្ជមាន (គុណភាពបង្ហាញ 60,000; ភាពត្រឹមត្រូវនៃម៉ាស់ 10 ផ្នែកក្នុងមួយលាន) ក្នុងជួរម៉ាស់ 300/m/z សមាមាត្រម៉ាស់/បន្ទុក (m/z) 3000។ ទិន្នន័យ MS/MS ត្រូវបានទទួលតាមរយៈអន្ទាក់អ៊ីយ៉ុងនៅក្នុង LTQ Orbitrap XL [ខ្ទង់ទី 3 ដំបូងដែលទិន្នន័យអាស្រ័យ ការបំបែកដែលបង្កឡើងដោយការប៉ះទង្គិច (CID)]។
ការក្លែងធ្វើ MD ត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើកម្មវិធី GROMACS (52) និងដែនកម្លាំង MARTINI 2 (53-55)។ បន្ទាប់មក CHARMM GUI Membrane Builder (56, 57) ត្រូវបានប្រើដើម្បីបង្កើតស្រទាប់ពីរដែលមានផ្ទុក dioleoylphosphatidylcholine (DOPC) និង Cer C18 ឬ DOPC និង Cer C26។ រចនាសម្ព័ន្ធ និងកូអរដោនេនៃ Cer C26 ត្រូវបានទទួលពី DXCE ដោយការដកអង្កាំបន្ថែមចេញពីកន្ទុយ sphingosine។ ប្រើដំណើរការដែលបានពិពណ៌នាខាងក្រោមដើម្បីធ្វើឱ្យស្រទាប់ទ្វេមានតុល្យភាព ហើយដំណើរការវា បន្ទាប់មកប្រើកូអរដោនេចុងក្រោយនៃប្រព័ន្ធដើម្បីបង្កើតប្រព័ន្ធដែលមាន Emp24។ ដែនឆ្លងភ្នាសនៃ yeast Emp24 (សំណល់ 173 ដល់ 193) ត្រូវបានបង្កើតឡើងជា α-helix ដោយប្រើរចនាសម្ព័ន្ធម៉ូលេគុលឧបករណ៍ MD ដែលមើលឃើញ (VMD) (58)។ បន្ទាប់មក បន្ទាប់ពីយកជាតិខ្លាញ់ដែលត្រួតស៊ីគ្នាចេញ ប្រូតេអ៊ីនត្រូវបានកិនជាដុំៗ ហើយបញ្ចូលទៅក្នុងស្រទាប់ពីរដោយប្រើ CHARMM GUI។ ប្រព័ន្ធចុងក្រោយមាន DOPC ចំនួន 1202 និង Cer C26 ចំនួន 302 ឬ DOPC ចំនួន 1197 និង Cer C18 និង Emp24 ចំនួន 295។ ធ្វើឱ្យប្រព័ន្ធមានអ៊ីយ៉ូដដល់កំហាប់ 0.150 M។ ការចម្លងឯករាជ្យចំនួនបួនត្រូវបានធ្វើឡើងសម្រាប់សមាសធាតុពីរស្រទាប់។
ស្រទាប់ខ្លាញ់ពីរស្រទាប់ត្រូវបានធ្វើឲ្យមានតុល្យភាពដោយប្រើដំណើរការ CHARMM GUI ដែលពាក់ព័ន្ធនឹងការបង្រួមអប្បបរមា និងបន្ទាប់មកធ្វើឲ្យមានតុល្យភាពជំហានចំនួន 405,000 ដែលការរឹតត្បិតទីតាំងត្រូវបានកាត់បន្ថយ និងលុបបំបាត់ជាបន្តបន្ទាប់ ហើយជំហានពេលវេលាត្រូវបានបង្កើនពី 0.005 ps ដល់ 0.02 ps។ បន្ទាប់ពីធ្វើឲ្យមានតុល្យភាព វាបង្កើតបាន 6 µs ជាមួយជំហានពេលវេលា 0.02 ps។ បន្ទាប់ពីបញ្ចូល Emp24 សូមប្រើដំណើរការ CHARMM GUI ដូចគ្នាដើម្បីបង្រួមអប្បបរមា និងធ្វើឲ្យប្រព័ន្ធមានតុល្យភាព ហើយបន្ទាប់មកដំណើរការរយៈពេល 8 វិនាទីក្នុងផលិតកម្ម។
សម្រាប់ប្រព័ន្ធទាំងអស់ ក្នុងអំឡុងពេលដំណើរការធ្វើឱ្យមានតុល្យភាព សម្ពាធត្រូវបានគ្រប់គ្រងដោយ barostat Berendsen (59) ហើយក្នុងអំឡុងពេលដំណើរការផលិត សម្ពាធត្រូវបានគ្រប់គ្រងដោយ barostat Parrinello-Rahman (60)។ ក្នុងករណីទាំងអស់ សម្ពាធជាមធ្យមគឺ 1 bar ហើយគ្រោងការណ៍ភ្ជាប់សម្ពាធពាក់កណ្តាលអ៊ីសូត្រូពិចត្រូវបានប្រើ។ នៅក្នុងដំណើរការតុល្យភាព និងផលិតកម្ម ទែម៉ូស្តាត (61) ដែលមានការក្រិតតាមល្បឿនឡើងវិញត្រូវបានប្រើដើម្បីភ្ជាប់សីតុណ្ហភាពនៃប្រូតេអ៊ីន ខ្លាញ់ និងភាគល្អិតសារធាតុរំលាយរៀងៗខ្លួន។ ក្នុងអំឡុងពេលប្រតិបត្តិការទាំងមូល សីតុណ្ហភាពគោលដៅគឺ 310K។ អន្តរកម្មមិនភ្ជាប់ត្រូវបានគណនាដោយបង្កើតបញ្ជីផ្គូផ្គងដោយប្រើគ្រោងការណ៍ Verlet ជាមួយនឹងភាពអត់ធ្មត់នៃសតិបណ្ដោះអាសន្ន 0.005។ ពាក្យ Coulomb ត្រូវបានគណនាដោយប្រើវាលប្រតិកម្ម និងចម្ងាយកាត់ផ្តាច់ 1.1 nm។ ពាក្យ Vander Waals ប្រើគ្រោងការណ៍កាត់ផ្តាច់ដែលមានចម្ងាយកាត់ផ្តាច់ 1.1 nm ហើយគ្រោងការណ៍កាត់ផ្តាច់ Verlet ត្រូវបានប្រើសម្រាប់ការរសាត់សក្តានុពល (62)។
ដោយប្រើ VMD រលកកាត់ផ្តាច់រវាងអង្កាំផូស្វាត DOPC ឬអង្កាំសេរ៉ាមីត AM1 និងប្រូតេអ៊ីនគឺ 0.7 nm ហើយចំនួនជាតិខ្លាញ់ដែលមានអន្តរកម្មជាមួយប្រូតេអ៊ីនត្រូវបានគណនា។ យោងតាមរូបមន្តខាងក្រោម សូមគណនាកត្តា depletion-enrichment (DE) ដូចនៅក្នុង (63): កត្តា DE = (បរិមាណជាតិខ្លាញ់សរុបនៅក្នុងប្រូតេអ៊ីន 0.7) នៅក្នុងប្រូតេអ៊ីន 0.7 (បរិមាណ Cer នៅក្នុងជាតិខ្លាញ់សរុប)
តម្លៃដែលបានរាយការណ៍ត្រូវបានទទួលជាមធ្យមភាគ ហើយរបារកំហុសគឺជាច្បាប់ចម្លងឯករាជ្យចំនួនបួននៃ SE។ សារៈសំខាន់ស្ថិតិនៃកត្តា DE ត្រូវបានគណនាដោយការធ្វើតេស្ត t [(averageDE-factor-1)/SE]។ គណនាតម្លៃ P ពីការចែកចាយកន្ទុយតែមួយ។
ឧបករណ៍ GROMACS ត្រូវបានប្រើដើម្បីគណនាផែនទីដង់ស៊ីតេចំហៀង 2D នៃប្រព័ន្ធដែលមាន Emp24 ក្នុងរយៈពេល 250 ns ចុងក្រោយនៃដាន។ ដើម្បីទទួលបានផែនទីបង្កើន/បន្ថយនៃ ceramide ផែនទីដង់ស៊ីតេនៃ Cer ត្រូវបានចែកដោយផលបូកនៃផែនទីនៃ Cer និង DOPC ហើយបន្ទាប់មកចែកដោយកំហាប់នៃ Cer នៅក្នុងខ្លួន។ មាត្រដ្ឋានផែនទីពណ៌ដូចគ្នាត្រូវបានប្រើ។
សម្រាប់ឯកសារបន្ថែមសម្រាប់អត្ថបទនេះ សូមមើល http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
នេះជាអត្ថបទសម្រាប់ចូលមើលដោយសេរី ដែលចែកចាយក្រោមលក្ខខណ្ឌនៃអាជ្ញាប័ណ្ណ Creative Commons Attribution-Non-Commercial ដែលអនុញ្ញាតឱ្យប្រើប្រាស់ ចែកចាយ និងផលិតឡើងវិញក្នុងមធ្យោបាយណាមួយ ដរាបណាការប្រើប្រាស់ចុងក្រោយមិនមែនសម្រាប់ផលប្រយោជន៍ពាណិជ្ជកម្ម ហើយគោលការណ៍គឺថាស្នាដៃដើមគឺត្រឹមត្រូវ។ ជាឯកសារយោង។
ចំណាំ៖ យើងគ្រាន់តែស្នើសុំឱ្យអ្នកផ្តល់អាសយដ្ឋានអ៊ីមែលរបស់អ្នក ដើម្បីឱ្យមនុស្សដែលអ្នកណែនាំទៅកាន់ទំព័រដឹងថាអ្នកចង់ឱ្យពួកគេឃើញអ៊ីមែល ហើយវាមិនមែនជាសារឥតបានការទេ។ យើងនឹងមិនចាប់យកអាសយដ្ឋានអ៊ីមែលណាមួយឡើយ។
សំណួរនេះត្រូវបានប្រើដើម្បីសាកល្បងថាតើអ្នកជាអ្នកទស្សនា និងការពារការដាក់ស្នើសារឥតបានការដោយស្វ័យប្រវត្តិឬអត់។
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, AnaroSergio (Lópezio Maria) Waga (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
ការថតរូបភាព 3D ក្នុងពេលជាក់ស្តែងដែលមានគុណភាពបង្ហាញខ្ពស់បង្ហាញពីសារៈសំខាន់នៃប្រវែងខ្សែសង្វាក់សេរ៉ាមីតសម្រាប់ការតម្រៀបប្រូតេអ៊ីននៅកន្លែងទិន្នផលដែលបានជ្រើសរើស។
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, AnaroSergio (Lópezio Maria) Waga (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
ការថតរូបភាព 3D ក្នុងពេលជាក់ស្តែងដែលមានគុណភាពបង្ហាញខ្ពស់បង្ហាញពីសារៈសំខាន់នៃប្រវែងខ្សែសង្វាក់សេរ៉ាមីតសម្រាប់ការតម្រៀបប្រូតេអ៊ីននៅកន្លែងទិន្នផលដែលបានជ្រើសរើស។
© 2020 សមាគមអាមេរិចសម្រាប់ការជឿនលឿននៃវិទ្យាសាស្ត្រ។ រក្សាសិទ្ធិគ្រប់យ៉ាង។ AAAS គឺជាដៃគូរបស់ HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef និង CountER ។ ScienceAdvances ISSN 2375-2548 ។
ពេលវេលាបង្ហោះ៖ ថ្ងៃទី ២៣ ខែធ្នូ ឆ្នាំ ២០២០