សូមអរគុណសម្រាប់ការចូលមើលគេហទំព័រ Nature.com។ កំណែកម្មវិធីរុករកដែលអ្នកកំពុងប្រើមានការគាំទ្រ CSS មានកំណត់។ ដើម្បីទទួលបានបទពិសោធន៍ល្អបំផុត យើងសូមណែនាំឱ្យអ្នកប្រើកម្មវិធីរុករកដែលបានធ្វើបច្ចុប្បន្នភាព (ឬបិទរបៀបឆបគ្នានៅក្នុង Internet Explorer)។ ទន្ទឹមនឹងនេះ ដើម្បីធានាបាននូវការគាំទ្រជាបន្តបន្ទាប់ យើងនឹងបង្ហាញគេហទំព័រដោយគ្មានរចនាប័ទ្ម និង JavaScript។
មិនដូចសត្វឆ្អឹងខ្នងទេ សត្វល្អិតត្រូវបានគេគិតយ៉ាងទូលំទូលាយថាខ្វះអរម៉ូនស្តេរ៉ូអ៊ីតផ្លូវភេទដែលលំអៀងទៅរកបុរស។ នៅក្នុងសត្វ Anopheles gambiae ស្តេរ៉ូអ៊ីត ecdysone 20-hydroxyecdysone (20E) ហាក់ដូចជាបានវិវត្តដើម្បីគ្រប់គ្រងការអភិវឌ្ឍស៊ុតនៅពេលដែលសំយោគដោយញី2 និងដើម្បីបង្កើតរយៈពេលមិនឆបគ្នានៃការរួមរ័កនៅពេលដែលត្រូវបានបញ្ជូនផ្លូវភេទដោយឈ្មោល3។ ដោយសារការអភិវឌ្ឍស៊ុត និងការរួមរ័កគឺជាលក្ខណៈបន្តពូជដ៏សំខាន់ ការយល់ដឹងពីរបៀបដែលមូស Anopheles ញីរួមបញ្ចូលសញ្ញាអរម៉ូនទាំងនេះអាចជួយសម្រួលដល់ការរចនាកម្មវិធីគ្រប់គ្រងជំងឺគ្រុនចាញ់ថ្មី។ នៅទីនេះ យើងបង្ហាញថាមុខងារបន្តពូជទាំងនេះត្រូវបានគ្រប់គ្រងដោយស្តេរ៉ូអ៊ីតផ្លូវភេទផ្សេងៗគ្នាតាមរយៈបណ្តាញស្មុគស្មាញនៃអង់ស៊ីម ecdysteroid-activating/inactivating ecdysteroid។ យើងបានកំណត់អត្តសញ្ញាណ ecdysone អុកស៊ីតកម្មជាក់លាក់ចំពោះបុរស គឺ 3-dehydro-20E (3D20E) ដែលការពារឪពុកម្តាយដោយបិទការទទួលយកផ្លូវភេទរបស់ស្ត្រីបន្ទាប់ពីការផ្ទេរផ្លូវភេទ និងការធ្វើឱ្យសកម្មដោយ dephosphorylation។ ជាពិសេស ការផ្ទេរ 3D20E ក៏បានបង្កឱ្យមានការបញ្ចេញមតិនៃហ្សែនបន្តពូជដែលរក្សាការអភិវឌ្ឍស៊ុតក្នុងអំឡុងពេលឆ្លងមេរោគ Plasmodium ដោយធានាសុខភាពរបស់ស្ត្រីដែលឆ្លងមេរោគ។ 20E ដែលមានប្រភពមកពីញីមិនបង្កឱ្យមាន... ប្រតិកម្មផ្លូវភេទ ប៉ុន្តែអនុញ្ញាតឱ្យបុគ្គលដែលរួមរ័កពងបន្ទាប់ពីគីណាសដែលរារាំង 20E ត្រូវបានរារាំង។ ការកំណត់អត្តសញ្ញាណអរម៉ូនស្តេរ៉ូអ៊ីតសត្វល្អិតជាក់លាក់នេះរបស់បុរស និងតួនាទីរបស់វាក្នុងការគ្រប់គ្រងការទទួលយកផ្លូវភេទរបស់ស្ត្រី ការមានកូន និងអន្តរកម្មជាមួយ Plasmodium បង្ហាញពីសក្តានុពលក្នុងការកាត់បន្ថយភាពជោគជ័យនៃការបន្តពូជរបស់មូសដែលចម្លងជំងឺគ្រុនចាញ់។
ករណី​ជំងឺគ្រុនចាញ់ និង​ការស្លាប់​កំពុង​កើនឡើង​ម្តងទៀត4 ដោយសារតែ​ភាពធន់នឹងថ្នាំសម្លាប់សត្វល្អិត​យ៉ាងទូលំទូលាយ​នៅក្នុង​មូស Anopheles ដែលជា​វ៉ិចទ័រ​តែមួយគត់​នៃ​ប៉ារ៉ាស៊ីត​គ្រុនចាញ់​របស់មនុស្ស។ ជីវវិទ្យា​នៃ​ការរួមរ័ក​របស់​មូស​ទាំងនេះ​គឺជា​គោលដៅ​ដ៏ទាក់ទាញ​ជាពិសេស​សម្រាប់​អន្តរាគមន៍​គ្រប់គ្រង​ជំងឺគ្រុនចាញ់​ថ្មីៗ ពីព្រោះ​មូស​ញី​រួមរ័ក​តែម្តង5។ ការធ្វើឱ្យ​ព្រឹត្តិការណ៍​រួមរ័ក​តែមួយ​នេះ​គ្មាន​មេរោគ​នឹងមាន​សក្តានុពល​យ៉ាងខ្លាំង​ក្នុងការ​កាត់បន្ថយ​ចំនួន​មូស​នៅក្នុង​វាលស្រែ។
ស្ត្រីក្លាយជាអសមត្ថភាពផ្លូវភេទបន្ទាប់ពីទទួលបានអរម៉ូនស្តេរ៉ូអ៊ីតដែលមានកម្រិត titer ខ្ពស់ពីបុរស។ ការសិក្សាបានបង្ហាញថាកត្តាជំរុញឱ្យមានការលំបាកក្នុងការរួមរ័កបន្ថែមទៀតគឺ 20-hydroxyecdysone (20E) ដែលជាអរម៉ូនស្តេរ៉ូអ៊ីតដែលត្រូវបានគេស្គាល់ថាជានិយតករនៃវដ្តនៃការរលាយកោសិកានៅក្នុងដំណាក់កាលដង្កូវ។ សមត្ថភាពរបស់បុរសក្នុងការសំយោគ និងផ្ទេរ 20E បានវិវត្តជាពិសេសនៅក្នុងប្រភេទសត្វ Anopheles ដែលជាផ្នែកមួយនៃអនុពូជ Cellia7 ដែលត្រូវបានចែកចាយនៅទ្វីបអាហ្វ្រិក និងរួមបញ្ចូលវ៉ិចទ័រដ៏គ្រោះថ្នាក់បំផុតនៃជំងឺគ្រុនចាញ់ រួមទាំង Anopheles gambiae។ នេះគួរឱ្យកត់សម្គាល់ជាពិសេស ពីព្រោះនៅក្នុងប្រភេទសត្វទាំងនេះ ស្ត្រីក៏ផលិត 20E បន្ទាប់ពីអាហារឈាមនីមួយៗ ហើយ 20E ជំរុញវដ្ត oogenesis (សូមមើលឯកសារយោងទី 8)។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ មានព័ត៌មានតិចតួចណាស់អំពីរបៀបដែលស្ត្រីរួមបញ្ចូលសញ្ញាពីប្រភពពីរផ្សេងគ្នានៃ ecdysone (ការផ្ទេរបុរស និងការបង្កើតការបញ្ចូលឈាម) ដោយមិនធ្វើឱ្យខូចសមត្ថភាពរបស់ពួកគេក្នុងការរួមរ័ក។ តាមពិតទៅ ប្រសិនបើ 20E ដែលផលិតដោយស្ត្រីបង្កឱ្យមានការមិនអត់ឱនផ្លូវភេទ នេះនឹងនាំឱ្យមានភាពគ្មានកូនចំពោះសត្វដែលបំបៅដោះកូនព្រហ្មចារី ដែលជាអាកប្បកិរិយាទូទៅមួយនៅក្នុងមូសទាំងនេះ5។
ការពន្យល់ដែលអាចទៅរួចមួយគឺថា សត្វឈ្មោល A. gambiae ផ្ទេរអេឌីសូនជាក់លាក់ឈ្មោលដែលបានកែប្រែ ដែលធ្វើឱ្យសកម្មនូវខ្សែសង្វាក់បញ្ជូនសញ្ញានៅក្នុងប្រព័ន្ធបន្តពូជញី ដែលបណ្តាលឱ្យមានអស្ថិរភាពនៃការរួមរ័ក។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ ទោះបីជាសត្វឆ្អឹងខ្នងមានអរម៉ូនស្តេរ៉ូអ៊ីតច្រើនដូចជា អេស្ត្រូសែន និង អង់ដ្រូសែន (ពិនិត្យឡើងវិញនៅក្នុងឯកសារយោងទី 9) តាមដែលយើងដឹង ស្តេរ៉ូអ៊ីតដែលមានភាពលំអៀងទៅនឹងអង់ដ្រូសែនមិនទាន់ត្រូវបានកំណត់អត្តសញ្ញាណនៅក្នុងសត្វល្អិតនៅឡើយទេ។
យើង​បាន​កំណត់​បញ្ជី​នៃ​អរម៉ូន​ស្តេរ៉ូអ៊ីត​នៅ​ក្នុង​ក្រពេញ​បន្ថែម​បុរស​ឈ្មោល (MAG) របស់ A. gambiae ដែល​មាន​ភាព​ចាស់ទុំ​ខាង​ផ្លូវភេទ ដើម្បី​ស្វែងរក​ស្តេរ៉ូអ៊ីត​កែប្រែ​ដែល​អាច​ធ្វើ​ទៅ​បាន។ ដោយ​ប្រើ​វិធីសាស្ត្រ​ក្រូម៉ាតូក្រាហ្វី​រាវ​ដំណើរការ​ខ្ពស់​រួម​ជាមួយ​នឹង​វិសាលគម​ម៉ាស​តង់ដេម (HPLC-MS/MS) ជាជាង​វិធីសាស្ត្រ​ដែល​មិន​ជាក់លាក់​ដែល​បាន​ប្រើ​ពីមុន យើង​បាន​រកឃើញ​អេកឌីសុន (E) និង 20E នៅ​ក្នុង​ជាលិកា​នេះ ដែល​បញ្ជាក់​ពី​លទ្ធផល​ពីមុន។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ គំរូ​ត្រូវ​បាន​គ្របដណ្ដប់​ដោយ​ស្តេរ៉ូអ៊ីត​ផូស្វ័រ​អុកស៊ីតកម្ម ដែល​ស្រប​នឹង​រូបមន្ត 3-dehydro-20E-22-phosphate (3D20E22P)12 (រូបភាពទី 1)។ ទម្រង់​ផ្សេងទៀត​រួមមាន 3-dehydro-20E (3D20E) និង 20E-22-phosphate (20E22P)។ អាំងតង់ស៊ីតេ​សញ្ញា HPLC-MS/MS របស់ 3D20E22P គឺ​ខ្ពស់​ជាង​ទម្រង់​ដេផូស្វ័រ​របស់​វា​គឺ 3D20E ពីរ​លំដាប់​នៃ​រ៉ិចទ័រ និង​ខ្ពស់​ជាង E និង 20E បី​លំដាប់​នៃ​រ៉ិចទ័រ (រូបភាពទី 1)។ ទោះបីជា​នៅ​ក្នុង​ផ្នែក​ផ្សេង​ទៀត​ក៏ដោយ នៃរាងកាយ និងប្រព័ន្ធបន្តពូជផ្នែកខាងក្រោម (LRT; រូបភាពទិន្នន័យបន្ថែម 1a)។ យើងក៏បានវិភាគអេកឌីស្តេរ៉ូអ៊ីតចំពោះបុរស និងស្ត្រីដែលទើបបិទថ្មី (អាយុតិចជាង 1 ថ្ងៃ) ហើយបានរកឃើញ 3D20E និង 3D20E22P តែនៅក្នុង MAG ប៉ុណ្ណោះ។ E, 20E និង 20E22P មានវត្តមាននៅក្នុងភេទទាំងពីរ (រូបភាពទិន្នន័យបន្ថែម 1b)។ ទិន្នន័យទាំងនេះបង្ហាញថា បុរសពេញវ័យ A. gambiae ផលិតអរម៉ូនកែប្រែកម្រិតខ្ពស់នៅក្នុង MAGs របស់ពួកគេដែលមិនត្រូវបានសំយោគដោយស្ត្រី។
MAG និង LRT ញី (រួមទាំង atria, seminal vesicles និង parovarium) ត្រូវបានវះកាត់ចេញពីឈ្មោលព្រហ្មចារីអាយុ 4 ថ្ងៃ (អាយុ 4 ថ្ងៃ) និងញីព្រហ្មចារី និងបានរួមរ័ក (0.5, 3, និង 12 hpm)។ Ecdysone នៅក្នុងជាលិកាទាំងនេះត្រូវបានវិភាគដោយ HPLC-MS/MS (មធ្យម ± sem; ការធ្វើតេស្ត t ដែលមិនមានគូ ទ្វេភាគី អត្រារកឃើញមិនពិត (FDR) ត្រូវបានកែតម្រូវ; NS មិនសំខាន់; *P < 0.05, **P < 0.01 ។ 3D20E: 3 ម៉ោង ទល់នឹង 0.5 ម៉ោង, P = 0.035; 12 ម៉ោង ទល់នឹង 3 ម៉ោង, P = 0.0015; 12 ម៉ោង ទល់នឹង 0.5 ម៉ោង, P = 0.030 ។ 3D20E22P: 3 ម៉ោង ទល់នឹង 0.5 ម៉ោង, P = 0.25; 12 ម៉ោង ទល់នឹង 3 ម៉ោង, P = ០,០០៣២; ១២ ម៉ោង ទល់នឹង ០,៥ ម៉ោង, P = ០,០១៥)។ ទិន្នន័យគឺមកពីការចម្លងជីវសាស្រ្តចំនួនបី។ ផ្ទៃកំពូលសម្រាប់អេកឌីសូននីមួយៗដែលចាប់អារម្មណ៍ត្រូវបានគណនា និងធ្វើឱ្យមានលក្ខណៈធម្មតាដោយចំនួនមូស។ អេកឌីសូនត្រូវបានតំណាងដោយពណ៌ដូចខាងក្រោម៖ E ពណ៌បៃតង; 20E ពណ៌ទឹកក្រូច; 20E22P ពណ៌ស្វាយ; 3D20E ពណ៌ខៀវ; 3D20E22P ពណ៌ផ្កាឈូក។ រូបភាពបញ្ចូលបង្កើនមាត្រដ្ឋាននៅលើអ័ក្ស y ដើម្បីបង្ហាញកម្រិតអេកឌីសូនទាប។
ដើម្បីស៊ើបអង្កេតថាតើ 3D20E22P និង 3D20E ត្រូវបានផ្ទេរក្នុងអំឡុងពេលរួមរ័កឬអត់ យើងបានវិភាគ LRT ញីនៅចំណុចពេលវេលាផ្សេងៗគ្នាបន្ទាប់ពីការរួមរ័ក។ ទោះបីជាអេឌីសូនមិនត្រូវបានរកឃើញនៅក្នុងសត្វព្រហ្មចារីក៏ដោយ យើងបានសង្កេតឃើញបរិមាណច្រើននៃ 3D20E22P នៅក្នុង LRT ភ្លាមៗបន្ទាប់ពីការរួមរ័ក (0.5 ម៉ោងបន្ទាប់ពីការរួមរ័ក, hpm) ដែលថយចុះតាមពេលវេលា ខណៈពេលដែលកម្រិត 3D20E បានកើនឡើងគួរឱ្យកត់សម្គាល់ (រូបភាពទី 1)។ ដោយប្រើ 3D20E សំយោគគីមីជាស្តង់ដារ យើងបានកំណត់ថាកម្រិតនៃអរម៉ូនស្តេរ៉ូអ៊ីតនេះនៅក្នុង LRT រួមរ័កមានយ៉ាងហោចណាស់ 100 ដងខ្ពស់ជាង 20E (តារាងទិន្នន័យបន្ថែមទី 1)។ ដូច្នេះ 3D20E22P គឺជាអេឌីសូនឈ្មោលដ៏សំខាន់ដែលត្រូវបានផ្ទេរទៅ LRT ញីក្នុងអំឡុងពេលរួមរ័ក ហើយទម្រង់ dephosphorylated របស់វា 3D20E ក្លាយជាមានច្រើនក្រៃលែងភ្លាមៗបន្ទាប់ពីការរួមរ័ក។ នេះបង្ហាញពីតួនាទីសំខាន់សម្រាប់អេឌីសូនចុងក្រោយនៅក្នុងជីវវិទ្យាក្រោយការរួមរ័កញី។
បន្ទាប់ពីបង្កើតសំណុំទិន្នន័យ RNA sequencing (RNA-seq) ថ្មី (រូបភាពទី 2a) ដោយប្រើបំពង់ជីវព័ត៌មានវិទ្យាដែលបង្កើតឡើងតាមតម្រូវការ យើងបានស្វែងរក ecdysone kinase (EcK) ecdysone oxidase (EO) និង ecdysone ដែលអ៊ិនកូដហ្សែន phosphatase កែប្រែ 20E។ EPP) ត្រូវបានបង្ហាញនៅក្នុងជាលិកាបន្តពូជ។ យើងបានកំណត់អត្តសញ្ញាណហ្សែន EPP បេក្ខជនមួយ និងហ្សែន EcK សក្តានុពលពីរ (EcK1 និង EcK2) ប៉ុន្តែមិនអាចរកឃើញហ្សែន EO បេក្ខជនល្អបានទេ។ ជាពិសេស ហ្សែន EPP នីមួយៗត្រូវបានបង្ហាញនៅកម្រិតខ្ពស់ (98.9th percentile) នៅក្នុង Gambian MAGs ប៉ុន្តែមិនមែននៅក្នុង LRTs ស្រីទេ (រូបភាពទី 2b) ផ្ទុយពីការរំពឹងទុករបស់យើង ចាប់តាំងពី dephosphorylation នៃ 3D20E22P បានកើតឡើងនៅក្នុងជាលិកាស្រីនេះ។ ដូច្នេះ យើងជឿថា EPP ប្រុសអាចត្រូវបានផ្ទេរក្នុងអំឡុងពេលរួមរ័ក។ ជាការពិតណាស់ យើងបានប្រើការដាក់ស្លាកអ៊ីសូតូបស្ថេរភាពនៅក្នុង vivo ដើម្បីបិទបាំងប្រូតេអ៊ីនស្រីបន្ទាប់ពីការរួមរ័ក ដែលជាអង់ស៊ីមដែលត្រូវបានកំណត់ដោយ MS នៅក្នុង atrium ស្រី (រូបភាពទី 2c និង តារាងបន្ថែមទី 1)។ វត្តមានរបស់ EPP នៅក្នុង MAG និង LRT ញីដែលបានផ្គូផ្គង (ប៉ុន្តែមិនមែនជាព្រហ្មចារី) ក៏ត្រូវបានបញ្ជាក់ដោយប្រើអង្គបដិប្រាណជាក់លាក់ផងដែរ (រូបភាពទី 2d)។
ក, បំពង់ជីវព័ត៌មានវិទ្យាដែលបង្កើតឡើងតាមតម្រូវការ ដើម្បីស្វែងរកជាលិកាបន្តពូជនៃភេទនីមួយៗ សម្រាប់ហ្សែនដែលអ៊ិនកូដ EcKs, EOs និង EPPs។ លេខនៅជាប់នឹងព្រួញបង្ហាញពីចំនួនបេក្ខជនបុរស និងស្ត្រីនៅជំហាននីមួយៗ។ ការវិភាគនេះបានកំណត់អត្តសញ្ញាណហ្សែន EPP មួយ (EPP) និងហ្សែន EcK មួយ (EcK1) ដែលត្រូវបានបង្ហាញជាបុរស និងហ្សែន EcK មួយ (EcK2) ដែលត្រូវបានបង្ហាញជាភេទទាំងពីរ ប៉ុន្តែមិនផ្តល់ហ្សែន EO បេក្ខជនទេ។ ខ, ផែនទីកំដៅប្រៀបធៀបការបញ្ចេញហ្សែនបេក្ខជននៅក្នុងជាលិកា Anopheles gambiae និង Anopheles albicans ព្រហ្មចារី (V) និងមិត្តរួម (M)។ Spca, ការបង្កកំណើត; MAGs, ក្រពេញបន្ថែមនៅក្នុងបុរស; ផ្នែកផ្សេងទៀតនៃរាងកាយ រួមទាំងសុដន់ ស្លាប ជើង ខ្លាញ់ និងសរីរាង្គខាងក្នុងចំពោះភេទទាំងពីរ និងអូវែរចំពោះស្ត្រី។ EcK2 ត្រូវបានបង្ហាញយ៉ាងខ្លាំងនៅក្នុង MAG និង atria នៃប្រទេសហ្គាំប៊ី ចំណែកឯ EPP ត្រូវបានរកឃើញតែនៅក្នុង MAG ប៉ុណ្ណោះ។ c ការវិភាគប្រូតេអូមិចនៃការផ្លាស់ទីក្រុមទឹកកាមរបស់បុរសចូលទៅក្នុង atria របស់ស្ត្រីនៅ 3, 12 និង 24 hpm ដែលបង្ហាញពីប្រូតេអ៊ីនច្រើនបំផុតចំនួន 67 ។ ស្ត្រីត្រូវបានចិញ្ចឹមដោយរបបអាហារដែលមានផ្ទុក 15N ដើម្បីដាក់ស្លាក (និងបិទបាំង) ប្រូតេអ៊ីនទាំងអស់។ បុរសដែលមិនបានដាក់ស្លាកត្រូវបានផ្គូផ្គងជាមួយស្ត្រីដែលមានស្លាក ហើយស្ត្រី LRT ត្រូវបានវះកាត់នៅ 3, 12 និង 24 hpm សម្រាប់ការវិភាគប្រូតេអូមិច (សូមមើលតារាងបន្ថែមទី 1 សម្រាប់បញ្ជីពេញលេញនៃប្រូតេអ៊ីនទឹកកាម)។ ការបញ្ចូល EPP, Eck1 និង EcK2 ត្រូវបានរកឃើញនៅក្នុង MAG របស់បុរសព្រហ្មចារីដោយការវិភាគប្រូតេអូមិចនៃជាលិកាទាំងនេះ។ d, EPP ត្រូវបានរកឃើញដោយ Western blot នៅក្នុង MAG និង LRT នៃស្ត្រីដែលបានផ្គូផ្គង ប៉ុន្តែមិនមែននៅក្នុងស្ត្រីព្រហ្មចារី ឬបុរស ឬផ្នែកដែលនៅសល់នៃរាងកាយរបស់ស្ត្រីនោះទេ។ ភ្នាសត្រូវបានក្នុងពេលដំណាលគ្នា ត្រូវបានស៊ើបអង្កេតដោយប្រើអង្គបដិប្រាណ anti-actin (ការគ្រប់គ្រងការផ្ទុក) និង anti-EPP។ ឈ្មោលទាំងអស់គឺជាព្រហ្មចារី។ សូមមើលរូបភាពបន្ថែមទី 1 សម្រាប់ទិន្នន័យប្រភពជែល។ ការធ្វើ Western blots ត្រូវបានអនុវត្តពីរដងជាមួយនឹងលទ្ធផលស្រដៀងគ្នា។
សកម្មភាព​អេកឌីស្តេរ៉ូអ៊ីត ផូស្វ័រផូស្វាតាស​របស់ EPP ត្រូវបានផ្ទៀងផ្ទាត់បន្ទាប់ពីការភ្ញាស់ដោយ HPLC-MS/MS ជាមួយ 3D20E22P ដែលញែកចេញពី MAG (រូបភាពទិន្នន័យបន្ថែម 2a)។ លើសពីនេះ នៅពេលដែលយើងបំបិទ EPP ដោយការជ្រៀតជ្រែកដែលសម្របសម្រួលដោយ RNA (RNAi) យើងបានរកឃើញការថយចុះយ៉ាងខ្លាំងនៃសកម្មភាពផូស្វាតាសនៅក្នុងជាលិកាបន្តពូជរបស់មូសឈ្មោលទាំងនេះ (រូបភាពទី 3a) ហើយមូសញីដែលផ្គូផ្គងជាមួយមូសឈ្មោលដែលបំបិទ EPP បានបង្ហាញពីសមាមាត្រទាបនៃ 3D20E ដែលបាត់បង់ផូស្វ័រ (រូបភាពទី 3b) ទោះបីជាមានការបំបិទហ្សែនដោយផ្នែកក៏ដោយ (រូបភាពទិន្នន័យបន្ថែម 2b,c)។ ផ្ទុយទៅវិញ យើងមិនបានរកឃើញការផ្លាស់ប្តូរគួរឱ្យកត់សម្គាល់នៅក្នុងសមាមាត្រ 20E22P/20E នៅក្នុងមូសដូចគ្នានោះទេ ដែលអាចបង្ហាញថាអង់ស៊ីមនេះមានលក្ខណៈជាក់លាក់សម្រាប់ 3D20E22P (រូបភាពទី 3b)។
ក, សកម្មភាពផូស្វាតាសថយចុះនៅក្នុង MAG ដែលបណ្តាលមកពីការបិទសំឡេង EPP ដោយប្រើ EPP RNA ខ្សែពីរ (dsEPP) ឬការគ្រប់គ្រង GFP RNA ខ្សែពីរ (dsGFP)។ អាង MAG ចំនួនម្ភៃត្រូវបានប្រើនៅក្នុងការចម្លងនីមួយៗ (P = 0.0046, paired t-test, two-sided) ដែលតំណាងដោយចំណុចដាច់ដោយឡែកពីគ្នា។ខ, ញីដែលបានផ្គូផ្គងជាមួយឈ្មោលដែលបានបិទសំឡេង EPP មានសមាមាត្រទាបជាងគួរឱ្យកត់សម្គាល់នៃ dephosphorylated 3D20E នៅ 3 hpm (P = 0.0043, unpaired t-test, two-sided) ចំណែកឯកម្រិត 20E មិនត្រូវបានប៉ះពាល់ទេ (P = 0.063, unpaired)។ តេស្ត t ទ្វេភាគី)។ ទិន្នន័យត្រូវបានបង្ហាញជាមធ្យម ± sem ពីអាងចិញ្ចឹមត្រីចំនួនបី ដែលមានស្រីចំនួន 13, 16 និង 19 ក្បាលក្នុងមួយក្បាល។ គ, ស្រីដែលបានផ្គូផ្គងជាមួយបុរសដែលបិទ EPP មានអត្រានៃការរួមរ័កឡើងវិញខ្ពស់ជាង (P = 0.0002, តេស្តពិតប្រាកដរបស់ Fisher, ទ្វេភាគី)។ ស្រីត្រូវបានបង្ខំឱ្យរួមរ័កជាមុនសិន ដើម្បីធានាបាននូវស្ថានភាពរួមរ័ករបស់ពួកវា។ ២ថ្ងៃក្រោយមក ពួកគេត្រូវបានទាក់ទងជាមួយមេជីវិតឈ្មោលដទៃទៀតដែលមានមេជីវិតឈ្មោលប្តូរហ្សែន ដើម្បីវាយតម្លៃអត្រានៃការរួមរ័កឡើងវិញដោយការរកឃើញ PCR បរិមាណនៃ transgene។ ញីដែលចិញ្ចឹមដោយឈាម ដែលបានរួមរ័កជាមួយឈ្មោលដែលត្រូវបាន EPP បិទសំឡេង មានការថយចុះគួរឱ្យកត់សម្គាល់នៃការមានកូន (P < 0.0001; តេស្ត Mann-Whitney ទ្វេភាគី) និងចំនួនស៊ុតថយចុះបន្តិច (P = 0.088, តេស្ត Mann-Whitney ទ្វេភាគី) ខណៈពេលដែលអត្រាពងកូនមិនត្រូវបានប៉ះពាល់ទេ (P = 0.94, តេស្ត Fisher's exact ទ្វេភាគី)។ នៅក្នុងបន្ទះទាំងអស់ n តំណាងឱ្យចំនួនគំរូមូសឯករាជ្យខាងជីវសាស្រ្ត។ NS មិនសំខាន់ទេ។ *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001។
បន្ទាប់មក យើងបានវាយតម្លៃថាតើការថយចុះផូស្វ័រអេកឌីសូនមានសារៈសំខាន់សម្រាប់ការបង្កភាពធន់នឹងការរួមរ័កចំពោះស្ត្រីដែរឬទេ។ ជាពិសេស ស្ត្រីដែលរួមរ័កជាមួយបុរសដែលបាត់បង់ EPP បានរួមរ័កឡើងវិញក្នុងប្រេកង់ខ្ពស់ជាង (44.9%) ជាងស្ត្រីត្រួតពិនិត្យ (10.4%) នៅពេលដែលប៉ះពាល់នឹងបុរសបន្ថែម (ប្តូរហ្សែន) (រូបភាពទី 3c)។ យើងក៏បានសង្កេតឃើញការថយចុះគួរឱ្យកត់សម្គាល់នៃការមានកូន (រូបភាពទី 3d ខាងឆ្វេង) និងការថយចុះបន្តិចបន្តួចនៃចំនួនស៊ុតដែលដាក់ដោយស្ត្រីទាំងនេះ (រូបភាពទី 3d កណ្តាល) ខណៈពេលដែលភាគរយនៃស៊ុតដែលដាក់ដោយស្ត្រី (ការឆ្លើយតបមួយផ្សេងទៀតដែលបណ្តាលមកពីការរួមរ័ក)) មិនត្រូវបានប៉ះពាល់ទេ (រូបភាពទី 3d ខាងស្តាំ)។ ដោយផ្តល់នូវភាពជាក់លាក់ដែលសង្កេតឃើញនៃ EPP សម្រាប់ 3D20E22P លទ្ធផលទាំងនេះបង្ហាញថាការធ្វើឱ្យសកម្មនៃ 3D20E ដោយ EPP ដែលបានផ្ទេរក្នុងអំឡុងពេលរួមរ័កអាចមានតួនាទីសំខាន់ក្នុងការបិទការទទួលយករបស់ស្ត្រីចំពោះការរួមរ័កបន្ថែមទៀត ដែលជាឥរិយាបថដែលពីមុនត្រូវបានសន្មតថាជាការផ្ទេរផ្លូវភេទរបស់ 20E។ ដូច្នេះ អរម៉ូនជាក់លាក់របស់បុរសនេះក៏ប៉ះពាល់យ៉ាងខ្លាំងដល់ការមានកូនរបស់ស្ត្រីផងដែរ។
បន្ទាប់មក យើងបានប្រៀបធៀបសកម្មភាពរបស់ 20E និង 3D20E នៅក្នុងការពិសោធន៍ចាក់ថ្នាំលើស្ត្រីព្រហ្មចារីពេញវ័យដោយប្រើ 3D20E ដែលសំយោគដោយគីមី (រូបភាពទី 4a-c) និង 20E ដែលមានលក់នៅលើទីផ្សារ។ យើងបានសង្កេតឃើញថា 3D20E មានប្រសិទ្ធភាពជាង 20E យ៉ាងខ្លាំងក្នុងការបិទភាពរសើបរបស់ស្ត្រីចំពោះការរួមរ័កនៅកំហាប់ទាំងពីរ (រូបភាពទី 4d)។ ជាពិសេស ពាក់កណ្តាលនៃកម្រិតសរីរវិទ្យានៃ 3D20E នៅក្នុង LRT (1,066 pg ក្រោយពេលចាក់ ធៀបនឹង 2,022 pg ក្រោយពេលរួមរ័ក) បានបង្កឱ្យមានសមាមាត្រនៃស្ត្រីដែលធន់នឹងការព្យាបាលដែលខ្ពស់ជាង 20 ដងនៃកម្រិតសរីរវិទ្យានៃ 20E (361 pg ក្រោយពេលចាក់) 24 ម៉ោងបន្ទាប់ពីការចាក់នៅកំហាប់ខ្ពស់បំផុត 18 pg ក្រោយពេលរួមរ័ក; តារាងទិន្នន័យបន្ថែមទី 1)។ លទ្ធផលនេះគឺស្របនឹងគំនិតដែលថាការផ្ទេរផ្លូវភេទនៃ 20E មិនបណ្តាលឱ្យមានរយៈពេលមិនប្រក្រតីនៃការរួមរ័កនោះទេ ហើយចង្អុលបង្ហាញបន្ថែមទៀតថា 3D20E ជាកត្តាចម្បងក្នុងការធានាទំនាក់ទំនងឪពុកម្តាយ-កូន។ 3D20E ក៏សកម្មជាង 20E គួរឱ្យកត់សម្គាល់នៅក្នុងការវាយតម្លៃពងមាន់ចំពោះស្ត្រីព្រហ្មចារី (រូបភាពទី 4e) ដែលបង្ហាញថាអត្រាពងមាន់ធម្មតាដែលយើងបានសង្កេតឃើញបន្ទាប់ពីការបិទ EPP ដោយផ្នែកគឺដោយសារតែវត្តមាននៃសកម្មភាព 3D20E ដែលនៅសេសសល់ដែលនៅតែផលិតដោយកត្តាញីដែលបង្កឡើងដោយការរួមរ័ក។
(ក,ខ) 3D20E ត្រូវបានសំយោគដោយគីមីពី 20E (ក) ជាមួយនឹងការបំលែង/ប្រសិទ្ធភាពខ្ពស់ខ្លាំង (ទិន្នន័យបង្ហាញជាមធ្យម ± sem ពីប្រតិកម្មសំយោគឯករាជ្យចំនួនបី) (ខ).គ, វិសាលគមម៉ាស់ (ពាក់កណ្តាលខាងក្រោម) ត្រូវគ្នាយ៉ាងពិតប្រាកដជាមួយអេកឌីសូនដែលត្រូវបានរកឃើញនៅក្នុង LRT ញីដែលបានផ្គូផ្គង (ពាក់កណ្តាលខាងលើ)។ឃ, បើប្រៀបធៀបជាមួយ 20E (0.63 µg, P = 0.02; 0.21 µg, P < 0.0001; ការធ្វើតេស្តពិតប្រាកដរបស់ Fisher ទ្វេភាគី) និងអេតាណុល 10% (0.63 µg, P < 0.0001; 0.21 µg, P < 0.0001; ការធ្វើតេស្តពិតប្រាកដរបស់ Fisher ទ្វេភាគី) ខណៈពេលដែល 20E គឺខ្ពស់ជាងការគ្រប់គ្រងយ៉ាងខ្លាំងតែនៅកម្រិតខ្ពស់ជាង (0.63 µg, P = 0.0002; 0.21 µg, P = 0.54; ការធ្វើតេស្តពិតប្រាកដរបស់ Fisher, 2-ជ្រុង)។e, ការចាក់ 3D20E បានបង្កឱ្យមានអត្រាពងកូនខ្ពស់ជាងគួរឱ្យកត់សម្គាល់ចំពោះស្ត្រីព្រហ្មចារីជាងក្រុមត្រួតពិនិត្យអេតាណុល 10% (0.21 µg, P < 0.0001; 0.13 µg, P = 0.0003; ការធ្វើតេស្តពិតប្រាកដរបស់ Fisher ទ្វេភាគី) ខណៈពេលដែល 20E បើប្រៀបធៀបទៅនឹងក្រុមត្រួតពិនិត្យ មានតែនៅកម្រិតខ្ពស់ជាង (0.21 µg, P = 0.022; 0.13 µg, P = 0.0823; ការធ្វើតេស្តពិតប្រាកដរបស់ Fisher ទ្វេភាគី)។3D20E បានបង្កឱ្យមានអត្រាពងកូនខ្ពស់ជាង 20E គួរឱ្យកត់សម្គាល់នៅកម្រិតខ្ពស់ជាង (0.21 µg, P = 0.0019; 0.13 µg, P = 0.075; ការធ្វើតេស្តពិតប្រាកដរបស់ Fisher ទ្វេភាគី)។នៅក្នុងបន្ទះទាំងអស់ n តំណាងឱ្យចំនួនគំរូមូសឯករាជ្យខាងជីវសាស្រ្ត។NS មិនសំខាន់ទេ។*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001។ ទិន្នន័យគឺមកពីការចម្លងចំនួនបី។
នៅក្នុងការសិក្សាពីមុនៗ យើងបានកំណត់ថា ការផ្ទេរអរម៉ូនស្តេរ៉ូអ៊ីតផ្លូវភេទបង្កឱ្យមានការបញ្ចេញមតិរបស់ MISO (Mating-Induced Induced Stimulator of Oogenesis 11) ដែលជាហ្សែនបន្តពូជស្ត្រីដែលការពារស្ត្រី A. gambiae ពីការឆ្លងមេរោគ P. falciparum។ ការចំណាយលើសុខភាពដែលបណ្តាលមកពី 13 ដែលជាប៉ារ៉ាស៊ីតគ្រុនចាញ់របស់មនុស្សដែលសាហាវបំផុត។ ដោយសារសារៈសំខាន់នៃ MISO ចំពោះសុខភាពបន្តពូជរបស់សត្វ Anopheles នៅក្នុងតំបន់ដែលមានជំងឺគ្រុនចាញ់ច្រើន យើងបានសម្រេចចិត្តកំណត់ថាតើអរម៉ូន 3D20E ឬ 20E មួយណាដែលបង្កឱ្យមានការបញ្ចេញមតិនៃហ្សែននេះ។ យើងបានរកឃើញថា ខណៈពេលដែលការចាក់ 20E បង្កឱ្យមានអ្នកទទួលអរម៉ូននុយក្លេអ៊ែរ (HR) មួយចំនួនជាពិសេស ឬខ្លាំងក្លាជាងនេះ ដូចជា HR3 និង HR4 និងគោលដៅស្តេរ៉ូអ៊ីតខាងក្រោមធម្មតា ដូចជាហ្សែន yolkogenic Vg14, 15, 16 MISO ត្រូវបានបង្កឡើងយ៉ាងខ្លាំងដោយ 3D20E (Extended Data Fig. 3)។ ដូច្នេះ ការផ្ទេរអរម៉ូនស្តេរ៉ូអ៊ីត androgenic ផ្លូវភេទនេះហាក់ដូចជាបង្កឱ្យមានយន្តការដែលការពារស្ត្រីពីការចំណាយដែលបង្កឡើងដោយការឆ្លងមេរោគប៉ារ៉ាស៊ីត។ លើសពីនេះ 3D20E ប៉ះពាល់ខុសគ្នាទាំង... អ៊ីសូហ្វមនៃអង់ស៊ីម EcR ដែលបង្កើត EcR-A និងបង្ក្រាប EcR-B និងជំរុញហ្សែនដែលបង្កើតការរួមរ័កផ្សេងទៀតយ៉ាងខ្លាំង រួមទាំង HPX15 ដែលប៉ះពាល់ដល់ការមានកូនរបស់ស្ត្រី។ នេះអាចពន្យល់ពីភាពគ្មានកូនដ៏សំខាន់ដែលសង្កេតឃើញចំពោះស្ត្រីដែលបានរួមរ័កជាមួយបុរសដែលត្រូវបានបិទ EPP (ទិន្នន័យបន្ថែមរូបភាពទី 3)។ ទិន្នន័យទាំងនេះបង្ហាញពីអត្ថិភាពនៃផ្លូវចុះក្រោមដែលត្រូវបានធ្វើឱ្យសកម្មដោយអរម៉ូនអេឌីសុនពីរដែលអាចជាមូលដ្ឋាននៃមុខងារជាក់លាក់នៃភេទ។
បន្ទាប់មក យើងបានសាកល្បងមុខងាររបស់ហ្សែន EcK ពីរដែលត្រូវបានកំណត់នៅក្នុងបំពង់ជីវព័ត៌មានវិទ្យារបស់យើង។ ការបិទ EcK1 ឬ EcK2 បណ្តាលឱ្យមានអត្រាមរណភាពគួរឱ្យកត់សម្គាល់ចំពោះបុរស (ទិន្នន័យបន្ថែមរូបភាពទី 4a) ដែលបង្ហាញថាការផូស្វ័រអេកឌីសូន ហើយដូច្នេះការធ្វើឱ្យអសកម្ម គឺមានសារៈសំខាន់សម្រាប់ការរស់រានមានជីវិត។ ដោយសារតែ EcK2 ត្រូវបានបង្ហាញនៅកម្រិតខ្ពស់ជាង EcK1 ហើយត្រូវបានរកឃើញនៅក្នុង MAGs ដោយប្រូតេអូមិច (រូបភាពទី 2b,c និងតារាងបន្ថែមទី 2) យើងបានផ្ទៀងផ្ទាត់សកម្មភាពគីណាសអេកឌីស្តេរ៉ូអ៊ីតរបស់វាដោយការភ្ញាស់វាជាមួយ 20E ដែលបណ្តាលឱ្យមានការផូស្វ័រ 20E22P (ទិន្នន័យបន្ថែមរូបភាពទី 2)។4b)។ នៅពេលប្រើ 3D20E ជាស្រទាប់ខាងក្រោម យើងមិនអាចរកឃើញផលិតផលផូស្វ័រ 3D20E22P បានទេ (ទិន្នន័យបន្ថែមរូបភាពទី 4c) ដែលបង្ហាញថា 20E ជាជាង 3D20E អាចជាគោលដៅដែលពេញចិត្តរបស់ EcK2។
យោងតាមការវិភាគ RNA-seq របស់យើង EcK2 ក៏ត្រូវបានបង្ហាញយ៉ាងខ្លាំងនៅក្នុង LRT របស់សត្វញីព្រហ្មចារី ដែលវាត្រូវបានបិទបន្ទាប់ពីការរួមរ័ក (រូបភាពទី 2b)។ យើងបានបញ្ជាក់ពីទិន្នន័យទាំងនេះ ហើយបានកំណត់ថាការបញ្ចេញមតិ EcK2 មិនត្រូវបានប៉ះពាល់ដោយការបញ្ចូលឈាមទេ (ទិន្នន័យបន្ថែម រូបភាពទី 5a)។ ដោយពង្រីកការពិសោធន៍ MS ដំបូងរបស់យើង យើងបានកំណត់ថាកំពូលនៃ 20E22P មានទំនាក់ទំនងយ៉ាងជិតស្និទ្ធទៅនឹងកំពូលនៃ 20E (22-26 ម៉ោងបន្ទាប់ពីអាហារឈាម; ទិន្នន័យបន្ថែម រូបភាពទី 5b)។ ការបិទ EcK2 ចំពោះសត្វញីព្រហ្មចារីបានបណ្តាលឱ្យមានការកើនឡើង 3 ដងនៃសមាមាត្រដែលទាក់ទងនៃ 20E ទៅ 20E22P នៅ 26 ម៉ោងបន្ទាប់ពីអាហារឈាម (រូបភាពទី 2c និង 5c) ដែលបញ្ជាក់ថា EcK2 ក៏មានផូស្វ័រ 20E ចំពោះសត្វញីផងដែរ។ ជាពិសេស សត្វព្រហ្មចារីដែលបាត់បង់ EcK2 រក្សាបាននូវភាពងាយទទួលផ្លូវភេទពេញលេញ (ទិន្នន័យបន្ថែម រូបភាពទី 5d,e) ដែលបង្ហាញបន្ថែមទៀតថាការផលិត 20E របស់ស្ត្រីមិនបង្កឱ្យមានរយៈពេលមិនអត់ធ្មត់ក្នុងការរួមរ័កទេ។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ សត្វញីទាំងនេះមាន អត្រា​ពង​កូន​កើនឡើង​គួរ​ឲ្យ​កត់សម្គាល់​បើ​ធៀប​នឹង​ក្រុម​ត្រួតពិនិត្យ ដោយ​មាន​ស្ត្រី​ព្រហ្មចារី​ជាង 30% ពង​កូន (រូបភាព​ទិន្នន័យ​បន្ថែម 5f)។ ប្រសិនបើ​ការ​ចាក់​អង់ស៊ីម Eck2 RNA (dsEcK2) ខ្សែ​ពីរ​ខ្សែ​ត្រូវ​បាន​ធ្វើ​ឡើង​បន្ទាប់​ពី​ការ​បឺត​ឈាម ការ​ពង​កូន​មិន​បាន​កើត​ឡើង​ទេ ដែល​ចំណុច​កំពូល 20E ដោយសារ​ការ​បឺត​ឈាម​បាន​ធ្លាក់​ចុះ។ ជារួម លទ្ធផល​ទាំងនេះ​គាំទ្រ​គំរូ​មួយ​ដែល​ថា 20E ដែល​ផលិត​បន្ទាប់​ពី​ការ​បឺត​ឈាម​អាច​បង្ក​ឲ្យ​មាន​ការ​ពង​កូន ប៉ុន្តែ​លុះត្រា​តែ​ការ​ទប់ស្កាត់​ការ​ពង​កូន (EcK2 និង​កត្តា​ផ្សេង​ទៀត) ត្រូវ​បាន​បិទ​ដោយ​ការ​រួម​ភេទ។ ទាំង​ការ​ចាក់​អង់ស៊ីម 20E និង 3D20E មិន​បាន​រារាំង​ការ​បញ្ចេញ​មតិ EcK2 ចំពោះ​ស្ត្រី​ព្រហ្មចារី​ទេ (រូបភាព​ទិន្នន័យ​បន្ថែម 5g) ដែល​បង្ហាញ​ថា​កត្តា​ផ្សេង​ទៀត​សម្របសម្រួល​ការ​រារាំង​គីណាស​នេះ។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ កម្រិត 20E បន្ទាប់​ពី​ការ​បឺត​ឈាម​មិន​គ្រប់គ្រាន់​ដើម្បី​បង្ក​ឲ្យ​មាន​ភាព​មិន​ស្រួល​ក្នុង​ការ​រួម​ភេទ​នោះ​ទេ ប៉ុន្តែ​ត្រូវ​បាន​បង្ក​ឡើង​ដោយ​កម្រិត​ខ្ពស់​នៃ 3D20E ដែល​បាន​ផ្ទេរ​ផ្លូវភេទ។
លទ្ធផលរបស់យើងផ្តល់នូវការយល់ដឹងសំខាន់ៗអំពីយន្តការដែលគ្រប់គ្រងភាពជោគជ័យនៃការបន្តពូជរបស់ A. gambiae។ គំរូមួយបានលេចចេញជារូបរាង ដែលបុរសបានវិវត្តន៍ដើម្បីសំយោគកម្រិតខ្ពស់នៃ 3D20E ដែលជាអេឌីសុនដែលបានកែប្រែជាក់លាក់ចំពោះបុរស ដែលធានានូវភាពជាឪពុកម្តាយដោយធ្វើឱ្យស្ត្រីមានភាពរសើបចំពោះការរួមភេទបន្ថែមទៀត។ ក្នុងពេលជាមួយគ្នានេះ វ៉ិចទ័រជំងឺគ្រុនចាញ់ទាំងនេះក៏បានវិវត្តន៍ប្រព័ន្ធដ៏មានប្រសិទ្ធភាពមួយដើម្បីធ្វើឱ្យ 3D20E សកម្មចំពោះស្ត្រី ដើម្បីឆ្លើយតបទៅនឹងការផ្ទេរផ្លូវភេទនៃ EPP ជាក់លាក់ចំពោះបុរស។ តាមចំណេះដឹងរបស់យើង នេះគឺជាឧទាហរណ៍ដំបូងនៃប្រព័ន្ធអរម៉ូនស្តេរ៉ូអ៊ីតដែលគ្របដណ្ដប់ដោយបុរស និងស្ត្រី ដែលអនុវត្តមុខងារពិសេស និងសំខាន់នៅក្នុងសត្វល្អិត។ មុខងារអេឌីសុនជាក់លាក់ចំពោះបុរសត្រូវបានសន្មត់ ប៉ុន្តែមិនត្រូវបានបង្ហាញឱ្យច្បាស់លាស់ទេ។ ឧទាហរណ៍ សម្មតិកម្មដែលត្រូវបានបដិសេធយ៉ាងទូលំទូលាយ 18 គឺថាមុខងារទាំងនេះអាចត្រូវបានអនុវត្តដោយបុព្វបទ 20E E1។ វាត្រូវបានគេដឹងយ៉ាងច្បាស់ថានៅក្នុង Drosophila ម៉ូណាន់ឌ្រីត្រូវបានបង្កឡើងដោយការផ្ទេរផ្លូវភេទនៃប៉ិបទីតផ្លូវភេទតូចៗ 19,20 ដែលមានអន្តរកម្មជាមួយណឺរ៉ូនដែលរំញោចប្រព័ន្ធបន្តពូជស្ត្រីតាមរយៈអ្នកទទួលប៉ិបទីតផ្លូវភេទជាក់លាក់ 21,22។ ការងារបន្ថែមទៀតត្រូវបានទាមទារដើម្បីកំណត់ផ្នែកខាងក្រោម ការបង្កើតជាខ្សែទឹកសញ្ញាដែលគ្រប់គ្រងដោយ 3D20E ចំពោះសត្វមូសញី A. gambiae និងដើម្បីកំណត់ថាតើខ្សែទឹកទាំងនេះអាចត្រូវបានអភិរក្សរវាងមូស និង Drosophila ដែរឬទេ។
ដោយសារតួនាទីដ៏សំខាន់របស់ 3D20E លើការមានកូន និងឥរិយាបថរបស់ស្ត្រីដែលបានកំណត់នៅក្នុងការសិក្សារបស់យើង ផ្លូវដែលនាំទៅដល់ការសំយោគ និងការធ្វើឱ្យសកម្មរបស់ 3D20E ផ្តល់នូវឱកាសថ្មីៗសម្រាប់យុទ្ធសាស្ត្រគ្រប់គ្រងមូសនាពេលអនាគត ដូចជាការបង្កើតមូសឈ្មោលគ្មានកូនប្រកួតប្រជែងក្នុងយុទ្ធសាស្ត្របច្ចេកវិទ្យាសត្វល្អិតគ្មានកូន ប្រើសម្រាប់ការដោះលែងព្រៃ ឬដើម្បីធ្វើត្រាប់តាម 3D20E ក្នុងការលេងព្រហ្មចារី។ មុខងារជាក់លាក់របស់បុរសរបស់ 3D20E អាចបានវិវត្តនៅពេលដែល A. gambiae និងប្រភេទ Cellia ផ្សេងទៀតទទួលបានសមត្ថភាពក្នុងការកកទឹកកាមរបស់ពួកគេចូលទៅក្នុងឌុយរួមរ័ក ព្រោះវាអនុញ្ញាតឱ្យមានការផ្ទេរអរម៉ូន និងអង់ស៊ីមធ្វើឱ្យអរម៉ូនសកម្មមួយចំនួនធំប្រកបដោយប្រសិទ្ធភាព។ ជាថ្នូរវិញ ការវិវត្តន៍របស់ 3D20E ដែលអនុវត្ត monandry ផ្តល់នូវយន្តការសម្រាប់ស្ត្រី (តាមរយៈការបញ្ចេញមតិខ្ពស់នៃ MISO) ដើម្បីពេញចិត្តនឹងសុខភាពបន្តពូជរបស់ពួកគេនៅក្នុងតំបន់ដែលមានអត្រារីករាលដាលនៃជំងឺគ្រុនចាញ់ខ្ពស់ ដែលរួមចំណែកដោយប្រយោលដល់ការចម្លង Plasmodium។ ដោយសារមូសញី 20E ត្រូវបានបង្ហាញថាមានឥទ្ធិពលយ៉ាងខ្លាំងទៅលើការរស់រានមានជីវិត និងការលូតលាស់របស់ P. falciparum នៅក្នុងមូស Anopheles ញី24 ផ្លូវអរម៉ូនស្តេរ៉ូអ៊ីតទាំងឈ្មោល និងញីឥឡូវនេះគឺជាទិដ្ឋភាពសំខាន់នៃអន្តរកម្មរវាងមូស និងប៉ារ៉ាស៊ីត។
ពូជ G3 របស់ A. gambiae ត្រូវបានចិញ្ចឹមក្រោមលក្ខខណ្ឌសត្វល្អិតស្តង់ដារ (26-28°C, សំណើមទាក់ទង 65-80%, រយៈពេលពន្លឺ 12:12 ម៉ោង ក្នុងពន្លឺថ្ងៃ/ងងឹត)។ ដង្កូវត្រូវបានផ្តល់ចំណីត្រីម្សៅ (TetraMin Tropical Flakes, Koi Pellets និង Tetra Pond Sticks ក្នុងសមាមាត្រ 7:7:2)។ មូសពេញវ័យត្រូវបានផ្តល់ដំណោះស្រាយ dextrose 10% និងឈាមមនុស្សប្រចាំសប្តាហ៍ (សមាសធាតុឈាមសិក្សា)។ មូសព្រហ្មចារីត្រូវបានទទួលដោយការបំបែកភេទនៅដំណាក់កាលដង្កូវបន្ទាប់ពីពិនិត្យចុងដោយមីក្រូទស្សន៍។ មូសឈ្មោលដែលមានហ្សែន DsRed ត្រូវបានពិពណ៌នាពីមុន។
ការពិសោធន៍រួមរ័កដោយបង្ខំត្រូវបានអនុវត្តតាមពិធីការដែលបានពិពណ៌នាពីមុន។ សម្រាប់ការរួមរ័កដោយធម្មជាតិ ញីព្រហ្មចារីអាយុ 4 ថ្ងៃត្រូវបានរក្សាទុកក្នុងសមាមាត្រ 1:3 ជាមួយឈ្មោលព្រហ្មចារីពេញវ័យរយៈពេលពីរយប់។ ចំពោះការពិសោធន៍ដែលឈ្មោលត្រូវបានចាក់ dsEPP ការដាក់ក្នុងទ្រុងរួមគ្នាស្របគ្នានឹងថ្ងៃទី 3-4 បន្ទាប់ពីការចាក់ថ្នាំ នៅពេលដែលសកម្មភាពផូស្វាតាសត្រូវបានបិទសំឡេងអតិបរមា (ទិន្នន័យបន្ថែមរូបភាពទី 2b)។
ជាលិកាមូស សាកសពដែលនៅសល់ (ផ្នែកដែលនៅសល់នៃរាងកាយ) ឬរាងកាយទាំងមូលត្រូវបានកាត់ចូលទៅក្នុងមេតាណុល 100% ហើយធ្វើឱ្យដូចគ្នាជាមួយនឹងឧបករណ៍លាយ (អង្កាំកញ្ចក់ 2 ម.ម, 2,400 rpm, 90 វិនាទី)។ បរិមាណជាលិកា និងបរិមាណមេតាណុលមានដូចខាងក្រោម៖ ផ្នែកដែលនៅសល់នៃរាងកាយ 50 ក្នុង 1,000 µl; MAG, 50–100 80 µl; ញី LRT, 25–50 80 µl។ ទឹកភ្លៀងត្រូវបានទទួលរងនូវការស្រង់ចេញមេតាណុលលើកទីពីរជាមួយនឹងបរិមាណមេតាណុលដូចគ្នា។ កំទេចកំទីកោសិកាត្រូវបានយកចេញដោយការបង្វិល។ មេតាណុលពីការស្រង់ចេញទាំងពីរត្រូវបានផ្សំ និងសម្ងួតក្រោមលំហូរអាសូត បន្ទាប់មកត្រូវបានរំលាយឡើងវិញក្នុងបរិមាណដូចខាងក្រោមនៃមេតាណុល 80% ក្នុងទឹក៖ ផ្នែកដែលនៅសល់នៃរាងកាយ 50 µl; MAGs និងញី LRT, 30 µl។
គំរូត្រូវបានវិភាគលើម៉ាស៊ីនវាស់ម៉ាស (ID-X, Thermo Fisher) ដែលភ្ជាប់ទៅនឹងឧបករណ៍ LC (Vanquish, Thermo Fisher)។ គំរូ 5 µl ត្រូវបានចាក់ចូលទៅក្នុងជួរឈរទំហំ 3 µm ទំហំ 100 × 4.6 mm (Inspire C8, Dikma) ដែលរក្សានៅសីតុណ្ហភាព 25°C។ ដំណាក់កាលចល័តសម្រាប់ LC គឺ A (ទឹក អាស៊ីតហ្វមិក 0.1%) និង B (អាសេតូនីទ្រីល អាស៊ីតហ្វមិក 0.1%)។ ជម្រាល LC មានដូចខាងក្រោម៖ 5% B រយៈពេល 1 នាទី បន្ទាប់មកកើនឡើងដល់ 100% B ក្នុងរយៈពេល 11 នាទី។ បន្ទាប់ពី 8 នាទីនៅ 100% ធ្វើឱ្យជួរឈរមានតុល្យភាពឡើងវិញនៅ 5% B រយៈពេល 4 នាទី។ អត្រាលំហូរគឺ 0.3 ml/នាទី-1។ អ៊ីយ៉ូដនីយកម្មនៅក្នុងប្រភព MS ត្រូវបានសម្រេចដោយអ៊ីយ៉ូដនីយកម្មអេឡិចត្រូស្ព្រាយដែលមានកំដៅក្នុងរបៀបវិជ្ជមាន និងអវិជ្ជមាន។
ម៉ាស្សស្ពិចត្រូម៉ែត្រវាស់ទិន្នន័យក្នុងជួរ m/z ពី 350 ដល់ 680 ក្នុងគុណភាពបង្ហាញ 60,000 ក្នុងរបៀប MS ពេញលេញ។ ទិន្នន័យ MS/MS ត្រូវបានទទួលលើ [M + H]+ (គោលដៅទាំងអស់), [M - H2O + H]+ (គោលដៅទាំងអស់), និង [M - H]- (គោលដៅផូស្វ័រ)។ ទិន្នន័យ MS/MS ត្រូវបានប្រើដើម្បីបញ្ជាក់ពីលក្ខណៈសម្បត្តិអេកឌីសូននៃគោលដៅដែលគ្មានស្តង់ដារ។ ដើម្បីកំណត់អត្តសញ្ញាណអេកឌីស្តេរ៉ូអ៊ីតដែលមិនមែនជាគោលដៅ ទិន្នន័យ MS/MS សម្រាប់កំពូល HPLC ទាំងអស់ដែលមានបរិមាណទាក់ទង >15% ត្រូវបានវិភាគ។ វាស់បរិមាណដោយប្រើខ្សែកោងស្តង់ដារដែលបង្កើតចេញពីស្តង់ដារសុទ្ធ (20E, 3D20E) ដើម្បីគណនាបរិមាណដាច់ខាត ឬការពនលាយនៃគំរូជាក់លាក់មួយ (គោលដៅផ្សេងទៀតទាំងអស់) ដើម្បីគណនាសមមូលរបស់វាទៅនឹងបរិមាណដែលរកឃើញនៅក្នុងបុរសម្នាក់។ សម្រាប់ 3D20E ការវាស់បរិមាណត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើផលបូកនៃសារធាតុបន្ថែមដូចខាងក្រោម៖ [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-។ទិន្នន័យត្រូវបានស្រង់ចេញ និងវាស់វែងដោយប្រើ Tracefinder (កំណែ 4.1)។ទិន្នន័យ MS/MS ត្រូវបានវិភាគដោយប្រើ Xcalibur (កំណែ 4.4)។វិសាលគម MS នៃ E, 20E និង 3D20E ត្រូវបានប្រៀបធៀបទៅនឹងស្តង់ដាររៀងៗខ្លួន។3D20E22P ត្រូវបានវិភាគដោយដេរីវ៉ាទីស្យុងជាមួយនឹងសារធាតុប្រតិកម្មរបស់ Girard។20E22P ត្រូវបានវិភាគដោយសមាមាត្រ m/z។
3D20E22P ត្រូវបានបន្សុទ្ធពី MAG។ ការបន្សុទ្ធត្រូវបានអនុវត្តលើមាត្រដ្ឋានវិភាគដោយប្រើក្រូម៉ាតូក្រាហ្វីរាវដែលមានដំណើរការខ្ពស់ (Acquity, Waters) ជាមួយនឹងឧបករណ៍ចាប់សញ្ញាដែលមានមូលដ្ឋានលើម៉ាស់ quadrupole (QDa, Acquity, Waters) ក្រោមលក្ខខណ្ឌ LC ដូចគ្នានឹងការវិភាគ HPLC-MS/MS។ ការប្រមូលប្រភាគត្រូវបានកេះនៅពេលដែល m/z ដែលត្រូវគ្នានឹង 3D20E22P ត្រូវបានរកឃើញនៅពេលរក្សាទុកដូចគ្នានឹងការកំណត់ពីមុន។ ភាពបរិសុទ្ធនៃសមាសធាតុដែលបានស្រង់ចេញត្រូវបានត្រួតពិនិត្យដោយ HPLC-MS/MS ដូចដែលបានពិពណ៌នាខាងលើ។
RNA សរុបត្រូវបានស្រង់ចេញពីជាលិកាបន្តពូជចំនួន 10-12 ឬផ្នែកផ្សេងទៀតនៃរាងកាយ (គ្មានក្បាល) ដោយប្រើសារធាតុ TRI (Thermo Fisher) ដោយអនុវត្តតាមការណែនាំរបស់អ្នកផលិត។ RNA ត្រូវបានព្យាបាលដោយ TURBO DNase (Thermo Fisher)។ cDNA ត្រូវបានសំយោគដោយប្រើ Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase (M-MLV RT; Thermo Fisher) ដោយអនុវត្តតាមការណែនាំរបស់អ្នកផលិត។ ប្រាយមឺរសម្រាប់ការចម្លងបរិមាណ PCR បញ្ច្រាស (RT-qPCR; តារាងទិន្នន័យពង្រីក 2) ត្រូវបានបោះពុម្ពផ្សាយពីមុន24 ឬរចនាដោយប្រើ Primer-BLAST26 ដោយមានអាទិភាពត្រូវបានផ្តល់ទៅឱ្យផលិតផលដែលមានទំហំ 70-150 bp និងលាតសន្ធឹង exon-exon junctions ឬប្រាយមឺរគូប្រាយមឺរបំបែក exons។ គំរូ cDNA ពីចម្លងជីវសាស្រ្តបីទៅបួនត្រូវបានពនលាយបួនដងក្នុងទឹកសម្រាប់ RT-qPCR។ ការវាស់បរិមាណត្រូវបានអនុវត្តក្នុងប្រតិកម្មចម្លង 15 µl ដែលមាន 1× PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher) ប្រាយមឺរ និង 5 µl នៃ cDNA ពនលាយ។ ប្រតិកម្មត្រូវបានដំណើរការលើ ប្រព័ន្ធ PCR ពេលវេលាជាក់ស្តែង QuantStudio 6 Pro (Thermo Fisher) និងទិន្នន័យត្រូវបានប្រមូល និងវិភាគដោយប្រើការរចនា និងការវិភាគ (កំណែ 2.4.3)។ ដូចដែលបានបង្ហាញនៅក្នុងការសិក្សានេះ បរិមាណដែលទាក់ទងត្រូវបានធ្វើឱ្យមានលក្ខណៈធម្មតាទៅនឹងហ្សែនរីបូសូម RpL19 (AGAP004422) ដែលការបញ្ចេញមតិរបស់វាមិនបានផ្លាស់ប្តូរគួរឱ្យកត់សម្គាល់ជាមួយនឹងការផ្តល់ឈាម 27 ឬការរួមរ័ក 3។
គុណភាព RNA ត្រូវបានត្រួតពិនិត្យដោយប្រើ Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer (Agilent)។ បណ្ណាល័យ Illumina paired-end ត្រូវបានរៀបចំ និងដំណើរការនៅវិទ្យាស្ថាន Broad Institute នៃ MIT និង Harvard។ ការអានលំដាប់ត្រូវបានតម្រឹមទៅនឹងហ្សែន A. gambiae (ពូជ PEST កំណែ 4.12) ដោយប្រើ HISAT2 (កំណែ 2.0.5) ជាមួយប៉ារ៉ាម៉ែត្រលំនាំដើម។ ការអានដែលមានពិន្ទុគុណភាពគូសផែនទី (MAPQ) <30 ត្រូវបានដកចេញដោយប្រើ Samtools (កំណែ 1.3.1)។ ចំនួននៃការអានដែលបានគូសផែនទីទៅកាន់ហ្សែនត្រូវបានរាប់ដោយប្រើ htseq-count (កំណែ 0.9.1) ជាមួយប៉ារ៉ាម៉ែត្រលំនាំដើម។ ចំនួនការអានដែលបានធ្វើឱ្យមានលក្ខណៈធម្មតាត្រូវបានគណនា និងការបញ្ចេញហ្សែនឌីផេរ៉ង់ស្យែលត្រូវបានវិភាគដោយប្រើកញ្ចប់ DESeq2 (កំណែ 1.28.1) នៅក្នុង R (កំណែ 4.0.3)។
បេក្ខជនហ្សែនកែប្រែ Ecdysone ត្រូវបានកំណត់អត្តសញ្ញាណដោយការស្វែងរកហ្សែន A. gambiae ជាមុនសិនដោយប្រើក្បួនដោះស្រាយ PSI-BLAST (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/) ដោយប្រើតម្លៃលំនាំដើម ប៉ារ៉ាម៉ែត្រជាមួយនឹងលំដាប់ប្រូតេអ៊ីនសំណួរដូចខាងក្រោម៖ ពី Bombyx mori (លេខចូល NP_001038956.1), Musca domestica (លេខចូល XP_005182020.1, XP_005175332.1 និង XP_011294434.1) និង Microplitis demolitor (លេខចូល XP_008552646.1 និង XP_008552645.1) EcK ពី B. mori (លេខចូល NP_001036900), Drosophila melanogaster (លេខចូល NP_651202), Apis mellifera (លេខចូលជាធរមាន XP_394838) និង Acyrthosiphon pisum (លេខចូលជាធរមាន XP_001947166); និង EPP ពី B. mori (លេខចូលជាធរមាន XP_001947166) NP_001177919.1 និង NP_001243996.1) និង EO នៃ D. melanogaster (លេខចូលជាធរមាន NP_572986.1) (ជំហានទី 1)។ បន្ទាប់មក ត្រងចំនួនលទ្ធផលដោយផ្អែកលើការបញ្ចេញមតិ mRNA ខ្ពស់ (>100 បំណែក/គីឡូបេស exons ក្នុងមួយលានការអានដែលបានគូសផែនទី (FPKM) ឬ >85%) នៅក្នុងជាលិកាបន្តពូជ (LRT ឬ MAG ញី) នៅក្នុងប្រទេសហ្គាំប៊ី (ជំហានទី 2)។ ដើម្បីកែលម្អភាពជាក់លាក់ យើងបានជ្រើសរើសអង់ស៊ីមបេក្ខជនដែលត្រូវបានបង្ហាញនៅក្នុងជាលិកាបន្តពូជរបស់ A. albimanus ដែលជាប្រភេទសត្វអាណូហ្វេលដែលមិនសំយោគ ឬផ្ទេរអេកឌីសូនអំឡុងពេលរួមរ័ក។ ហ្សែនបេក្ខជនត្រូវបានត្រងដោយផ្អែកលើការបញ្ចេញមតិទាប (<100 FPKM ឬ <85th percentile) នៅក្នុងជាលិកាបន្តពូជរបស់ A. albimanus (ជំហានទី 3)។ ក្នុងនាមជាតម្រងចុងក្រោយ (ជំហានទី 4) ហ្សែនបេក្ខជនត្រូវបំពេញយ៉ាងហោចណាស់មួយក្នុងចំណោមចំណុចខាងក្រោម៖ (1) កើនឡើងគួរឱ្យកត់សម្គាល់បន្ទាប់ពីការរួមរ័ក (P < 0.05) យោងទៅតាមការវិភាគនៃហ្សែនដែលបានបង្ហាញខុសគ្នា និង (2) នៅក្នុងជាលិកាមិនបន្តពូជ (< 85 % ឬ <100 FPKM)។
យើងបានកែប្រែវិធីសាស្ត្រដែលបានពិពណ៌នាពីមុន 28, 29, 30 ដើម្បីសម្រេចបាននូវការដាក់ស្លាកអ៊ីសូតូបលើសារពាង្គកាយទាំងមូល។ សរុបមក Saccharomyces cerevisiae ប្រភេទ II (YSC2, Sigma) ប្រភេទព្រៃត្រូវបានសាកល្បងនៅក្នុងមូលដ្ឋានអាសូតដំបែ (BD Difco, DF0335) ដែលមាន (wt/vol) គ្លុយកូស 2% (G7528, Sigma) គ្មានអាស៊ីតអាមីណូ 1.7% និងអាម៉ូញ៉ូមស៊ុលហ្វាត។ ឧបករណ៍ផ្ទុកវប្បធម៌) និងអាម៉ូញ៉ូមស៊ុលហ្វាត 15N 5% (NLM-713, >99%, Cambridge Isotope Laboratories) ជាប្រភពអាសូតតែមួយគត់។ ដំបែត្រូវបានសង្គ្រោះដោយការបង្វិល ហើយដង្កូវមូសត្រូវបានផ្តល់ចំណីរហូតដល់ការលូតលាស់។ ការបំពេញបន្ថែមជាមួយម្សៅត្រី (0.5 មីលីក្រាមក្នុងដង្កូវ 300) ដើម្បីការពារការស្លាប់ដំណាក់កាលទីបួន។ មានតែញីប៉ុណ្ណោះដែលត្រូវបានប្រើក្នុងការពិសោធន៍រួមរ័កជាមួយឈ្មោលដែលមិនមានស្លាកដើម្បីវិភាគប្រូតេអូមឈ្មោលដែលបានផ្ទេរក្នុងអំឡុងពេលរួមរ័ក។
ស្រីព្រហ្មចារីអាយុ ៤-៦ ថ្ងៃដែលមានស្លាក 15N ត្រូវបានបង្ខំឱ្យរួមរ័កជាមួយប្រុសព្រហ្មចារីដែលមានអាយុដូចគ្នា។ ការរួមរ័កដោយជោគជ័យត្រូវបានផ្ទៀងផ្ទាត់ដោយការរកឃើញឌុយរួមរ័កក្រោមមីក្រូទស្សន៍អេពីហ្វ្លុយអូរីស។ នៅល្បឿន 3, 12, និង 24 hpm បន្ទប់ទទួលភ្ញៀវរបស់ស្រីព្រហ្មចារីចំនួន ៤៥-៥៥ ក្បាលត្រូវបានកាត់ចូលទៅក្នុងសារធាតុអាម៉ូញ៉ូមប៊ីកាបូណាតកម្រិត 50 µl (pH 7.8) ហើយត្រូវបានធ្វើឱ្យដូចគ្នាជាមួយឧបករណ៍ចោះ។ សារធាតុ homogenate ត្រូវបានបង្វិលក្នុងម៉ាស៊ីន centrifuge ហើយសារធាតុ supernatant លាយជាមួយ RapiGest 0.1% (186001860, Waters) កម្រិត 50 µl ក្នុងអាម៉ូញ៉ូមប៊ីកាបូណាតកម្រិត 50 mM។ សារធាតុ supernatant និងគ្រាប់ពីគំរូនីមួយៗត្រូវបានកកលើទឹកកកស្ងួត ហើយដឹកជញ្ជូនពេញមួយយប់ទៅកាន់មន្ទីរពិសោធន៍ MacCoss នៅសាកលវិទ្យាល័យ Washington ជាកន្លែងដែលការរៀបចំគំរូសម្រាប់ LC-MS/MS ត្រូវបានបញ្ចប់។ រំលាយគ្រាប់ឡើងវិញក្នុង RapiGest 0.1% កម្រិត 50 µl ក្នុងអាម៉ូញ៉ូម 50 mM។ ប៊ីកាបូណាត និងសូនីតក្នុងអាងងូតទឹក។ កំហាប់ប្រូតេអ៊ីននៃគ្រាប់ និងសារធាតុរាវខាងលើត្រូវបានវាស់ដោយការវិភាគ BCA គំរូត្រូវបានកាត់បន្ថយជាមួយ 5 mM dithiothreitol (DTT; Sigma) អាល់គីលជាមួយ 15 mM iodoacetamide (Sigma) ហើយភ្ញាស់នៅសីតុណ្ហភាព 37 °C (1:0 50) រយៈពេល 1 ម៉ោងជាមួយនឹងសមាមាត្រ trypsinization: trypsin:substrate)។ RapiGest ត្រូវបានរំលាយដោយការបន្ថែម 200 mM HCl បន្ទាប់មកដោយការភ្ញាស់នៅសីតុណ្ហភាព 37 °C រយៈពេល 45 នាទី និងការបង្វិលកណ្តាលនៅ 14,000 rpm រយៈពេល 10 នាទីនៅសីតុណ្ហភាព 4 °C ដើម្បីយកកំទេចកំទីចេញ។ គំរូត្រូវបានលាងសម្អាតដោយការស្រង់ចេញដំណាក់កាលរឹងពីររបៀប (ប្រអប់ព្រីនធឺរ Oasis MCX, Waters) ហើយរលាយឡើងវិញក្នុងអាស៊ីត formic 0.1% សម្រាប់កំហាប់ប្រូតេអ៊ីនចុងក្រោយ 0.33 µg µl-1។ ប្រូតេអូម MAG ដែលមិនមានស្លាកត្រូវបានវិភាគស្រដៀងគ្នាពីបុរសព្រហ្មចារី។ ច្បាប់ចម្លងវិភាគពីរ ត្រូវបានវិភាគសម្រាប់គំរូនីមួយៗ។ បន្ទាប់មក 1 µg នៃគំរូនីមួយៗត្រូវបានវិភាគដោយប្រើជួរឈរ fused silica ទំហំ 25 សង់ទីម៉ែត្រ កម្រាស់ 75 μm ជាមួយនឹងអន្ទាក់ frit Kasil1 (PQ) ទំហំ 4 សង់ទីម៉ែត្រ ដែលខ្ចប់ដោយជ័រ Jupiter C12 reversed-phase (Phenomenex) និង chromatography រាវរយៈពេល 180 នាទី។ ការរំលាយគំរូ – MS/MS ត្រូវបានដំណើរការលើម៉ាស៊ីនវាស់ម៉ាស HF Q-Exactive (Thermo Fisher) ជាមួយប្រព័ន្ធ nanoACQUITY UPLC (Waters)។ ទិន្នន័យដែលទទួលបានទាក់ទងនឹងទិន្នន័យដែលបង្កើតសម្រាប់ការដំណើរការនីមួយៗត្រូវបានបម្លែងទៅជាទម្រង់ mzML ដោយប្រើ Proteowizard (កំណែ 3.0.20287) និងប្រើ Comet31 (កំណែ 3.2) ទល់នឹងមូលដ្ឋានទិន្នន័យ FASTA ដែលមានលំដាប់ប្រូតេអ៊ីនពី Anopheles gambiae (VectorBase កំណែ 54), Anopheles coluzzi។ ការស្វែងរកត្រូវបានអនុវត្តលើ Mali-NIH (VectorBase កំណែ 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, ខែមីនា ឆ្នាំ 2021), A. gambiae RNA-seq និងការបកប្រែបីហ្វ្រេមនៃសារធាតុបំពុលរបស់មនុស្សដែលគេស្គាល់។ FDRs ដែលត្រូវគ្នានឹងផែនទី Peptide ត្រូវបានកំណត់ដោយប្រើ Percolator32 (កំណែ 3.05) ជាមួយនឹងកម្រិត 0.01 ហើយ peptides ត្រូវបានផ្គុំទៅជាការកំណត់អត្តសញ្ញាណប្រូតេអ៊ីនដោយប្រើប្រូតេអ៊ីន parsimony នៅក្នុង Limelight33 (កំណែ ២.២.០)។ ភាពសម្បូរបែបនៃប្រូតេអ៊ីនដែលទាក់ទងត្រូវបានប៉ាន់ប្រមាណដោយប្រើកត្តាភាពសម្បូរបែបនៃវិសាលគមធម្មតា (NSAF) ដែលបានគណនាសម្រាប់ប្រូតេអ៊ីននីមួយៗនៅក្នុងការរត់នីមួយៗដូចដែលបានពិពណ៌នាពីមុន។ NSAF ទាក់ទងទៅនឹងប្រូតេអ៊ីននីមួយៗត្រូវបានគណនាជាមធ្យមនៅទូទាំងគំរូពីការចម្លងជីវសាស្រ្តពីរផ្សេងគ្នា។ ការដាក់ស្លាក 15N បានបិទបាំងប្រូតេអូមញីដោយជោគជ័យ ទោះបីជាប្រូតេអ៊ីនដែលមិនមានស្លាកមួយចំនួនតូចអាចត្រូវបានរកឃើញពីព្រហ្មចារីដែលមានស្លាកក៏ដោយ។ យើងបានកត់ត្រាការរកឃើញការថយចុះប្រូតេអ៊ីនឈ្មោល (1-5 វិសាលគម) នៅក្នុងគំរូឆៅញីតែនៅក្នុងការរត់បច្ចេកទេសប៉ុណ្ណោះ ដែលគំរូឆៅត្រូវបានរត់បន្ទាប់ពីគំរូឈ្មោល/គូ ដែលជាលទ្ធផលនៃ HPLC "បន្ត"។ ប្រូតេអ៊ីនម្តងម្កាលដែលត្រូវបានរកឃើញថាជា 'សារធាតុចម្លង' ពីព្រហ្មចារីដែលមានស្លាកត្រូវបានរាយក្នុងតារាងបន្ថែមទី 1។
ប៉ិបទីតអង់ទីហ្សែនពីរគឺ QTTDRVAPAPDQQQ (ក្នុងអ៊ីសូទីប PA) និង MESDGTTPSGDSEQ (ក្នុងអ៊ីសូទីប PA និង PB) នៅក្នុង Genscript។ ប៉ិបទីតទាំងពីរត្រូវបានផ្សំ បន្ទាប់មកភ្ជាប់ទៅនឹងប្រូតេអ៊ីនផ្ទុក KLH ហើយចាក់ចូលទៅក្នុងទន្សាយនូវែលសេឡង់។ ទន្សាយត្រូវបានសម្លាប់បន្ទាប់ពីការចាក់លើកទីបួន ហើយ IgG សរុបត្រូវបានញែកចេញដោយការបន្សុទ្ធ។ IgG ពីទន្សាយដែលមាន EPP ជាក់លាក់បំផុតត្រូវបានប្រើសម្រាប់ការបឺតឈាមបន្ថែម។
ចំពោះ​ស្នាម​ភាគ​ខាងលិច MAG (n = 10 ដែល n តំណាងឱ្យចំនួនសំណាកមូសឯករាជ្យខាងជីវសាស្រ្ត) និង LRT ញី (n = 30) ពីមូសឈ្មោលព្រហ្មចារីអាយុ 4 ថ្ងៃ និងមូសញីព្រហ្មចារី ឬបង្កាត់ពូជដោយបង្ខំ (<10 ក្រោយការបង្កាត់ពូជ) សារធាតុ​ស្រង់​ប្រូតេអ៊ីន (50 mM Tris, pH 8.0; 1% NP-40; 0.25% sodium deoxycholate; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1× protease inhibitor cocktail (Roche)) ត្រូវបានបន្ថែមដោយឡែកពីគ្នា។ សំណាកត្រូវបានធ្វើឱ្យដូចគ្នាភ្លាមៗបន្ទាប់ពីការវះកាត់ជាមួយ beader (អង្កាំកញ្ចក់ 2 mm, 2,400 rpm, 90 វិនាទី)។ កំទេចកំទីដែលមិនរលាយត្រូវបានយកចេញដោយការបង្វិលកណ្តាលនៅ 20,000 g នៅ 4 °C។ ប្រូតេអ៊ីនត្រូវបានវាស់បរិមាណដោយ Bradford assay (Bio-Rad)។ បន្ទាប់មក ប្រូតេអ៊ីន MAG 20 µg ប្រូតេអ៊ីន LRT 40 µg និងប្រូតេអ៊ីនភាគច្រើនដែលនៅសល់ 20 µg ត្រូវបាន ត្រូវបានបំបែក និងបំបែកដោយ Bis-Tris NuPAGE 10% ដោយប្រើសារធាតុ MOPS buffer។ ប្រូតេអ៊ីនត្រូវបានផ្ទេរទៅភ្នាស polyvinylidene fluoride ដោយប្រើប្រព័ន្ធផ្ទេរ iBlot2 (Thermo Fisher)។ ភ្នាសត្រូវបានលាងសម្អាតពីរដងក្នុង 1× PBS-T (0.1% Tween-20 ក្នុង PBS) ហើយបន្ទាប់មកត្រូវបានរារាំងក្នុងសារធាតុ Odyssey blocking blocking blocking blocking buffer (Li-Cor) រយៈពេល 1 ម៉ោងនៅសីតុណ្ហភាព 22°C។ ភ្នាសត្រូវបានអង្រួនពេញមួយយប់នៅសីតុណ្ហភាព 4°C ជាមួយនឹងអង្គបដិប្រាណបឋម polyclonal ប្រឆាំង EPP របស់ទន្សាយផ្ទាល់ខ្លួន (1:700 ក្នុងសារធាតុ blocking ... រយៈពេល 1 ម៉ោង នៅសីតុណ្ហភាព 22°C។ ភ្នាសត្រូវបានលាងសម្អាតជាមួយ PBS-T ហើយថតរូបភាពដោយម៉ាស៊ីនស្កេន Odyssey CLx។ រូបភាពត្រូវបានប្រមូល និងដំណើរការនៅក្នុង Image Studio (កំណែ 5.2)។ ក្រុមជាក់លាក់មួយដែលត្រូវគ្នានឹងអ៊ីសូហ្វម EPP-RA (82 kDa) មិនត្រូវបានរកឃើញទេ។
តំបន់សរសេរកូដរបស់ EPP (ជាអ៊ីសូហ្វម AGAP002463-RB ដែលមានដូមេន histidine phosphatase ការស្វែងរកដូមេនអភិរក្ស NCBI 34) និង EcK2 (AGAP002181) ត្រូវបានក្លូនចូលទៅក្នុងប្លាស្មីត pET-21a(+) (Novagen Millipore Sigma); ប្រាយមឺរត្រូវបានរាយបញ្ជីនៅក្នុងតារាងទិន្នន័យបន្ថែមទី 2។ ឧបករណ៍ភ្ជាប់ GS4 ចំនួនប្រាំបី (ជាប់គ្នា) ត្រូវបានបញ្ចូលមុនស្លាក C-terminal 6xHis នៃសំណង់ pET-21a(+)-EcK2។ ប្រូតេអ៊ីនផ្សំឡើងវិញត្រូវបានផលិតដោយប្រើប្រតិកម្មសំយោគប្រូតេអ៊ីន E. coli ដែលគ្មានកោសិកា NEBExpress (New England BioLabs)។ ប្រូតេអ៊ីនផ្សំឡើងវិញត្រូវបានបន្សុទ្ធដោយប្រើជួរឈរបង្វិល NEBExpress Ni (New England BioLabs)។ ប្រូតេអ៊ីនត្រួតពិនិត្យ Dihydrofolate reductase (DHFR) ត្រូវបានផលិតដោយប្រើគំរូ DNA ពីឧបករណ៍សំយោគប្រូតេអ៊ីន E. coli ដែលគ្មានកោសិកា NEBExpress។ ប្រូតេអ៊ីនត្រូវបានរក្សាទុកក្នុងគ្លីសេរ៉ុល 50% ក្នុង PBS នៅសីតុណ្ហភាព -20 °C រហូតដល់ 3 ខែ។
សកម្មភាពផូស្វាតាសនៃ EPP និងសារធាតុចម្រាញ់ចេញពីជាលិកាត្រូវបានវាស់ដោយប្រើ 4-nitrophenyl phosphate (pNPP; Sigma-Aldrich)។ សារធាតុសតិបណ្ដោះប្រតិកម្មមានផ្ទុក 25 mM Tris, 50 mM អាស៊ីតអាសេទិក, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA និង 1 mM DTT។ ជាលិកាត្រូវបានធ្វើឱ្យដូចគ្នានៅក្នុងសារធាតុសតិបណ្ដោះប្រតិកម្ម ហើយកំទេចកំទីកោសិកាត្រូវបានយកចេញដោយការបង្វិល។ ចាប់ផ្តើមប្រតិកម្មដោយបន្ថែមអង់ស៊ីម ឬសារធាតុចម្រាញ់ចេញពីជាលិកាទៅក្នុងសារធាតុសតិបណ្ដោះប្រតិកម្មដែលមាន 2.5 mg ml-1 pNPP។ ល្បាយប្រតិកម្មត្រូវបានភ្ញាស់នៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់ក្នុងទីងងឹត ហើយបរិមាណ pNP ដែលបានបំប្លែងពី pNPP ត្រូវបានវាស់បរិមាណដោយវាស់ការស្រូបយកនៅ 405 nm នៅពេលវេលាផ្សេងៗគ្នា។
ចំពោះសកម្មភាព EcK ក្នុងវីត្រូ ប្រូតេអ៊ីនត្រូវបានភ្ញាស់ជាមួយ 0.2 mg 20E ឬ 3D20E ក្នុងសារធាតុរាវ 200 µl (pH 7.5) ដែលមានផ្ទុក 10 mM HEPES–NaOH, 0.1% BSA, 2 mM ATP និង 10 mM MgCl2 រយៈពេល 2 ម៉ោងនៅសីតុណ្ហភាព 27°C។ ប្រតិកម្មត្រូវបានបញ្ឈប់ដោយបន្ថែមមេតាណុល 800 µl បន្ទាប់មកធ្វើឱ្យត្រជាក់នៅសីតុណ្ហភាព -20°C រយៈពេល 1 ម៉ោង បន្ទាប់មកបង្វិលនៅ 20,000 g រយៈពេល 10 នាទីនៅសីតុណ្ហភាព 4°C។ បន្ទាប់មកសារធាតុរាវខាងលើត្រូវបានវិភាគដោយ HPLC-MS/MS។ ដើម្បីកំដៅប្រូតេអ៊ីនដែលប្រើក្នុងក្រុមត្រួតពិនិត្យឱ្យអសកម្ម ប្រូតេអ៊ីនត្រូវបានភ្ញាស់ក្នុងគ្លីសេរ៉ុល 50% ក្នុង PBS រយៈពេល 20 នាទីនៅសីតុណ្ហភាព 95°C។
ចំពោះសកម្មភាព EPP ក្នុងវីត្រូ ប្រូតេអ៊ីនត្រូវបានភ្ញាស់ជាមួយ 3D20E22P (ស្មើនឹងបរិមាណដែលរកឃើញនៅក្នុង MAG ចំនួន 18 គូ ដែលត្រូវបានបន្សុទ្ធដោយ HPLC-MS/MS) ក្នុងសារធាតុរាវ 100 µl (pH 7.5) ដែលមានផ្ទុក Tris 25 mM, អាស៊ីតអាសេទិក 50 mM, Bis-Tris 25 mM, NaCl 150 mM, EDTA 0.1 mM និង DTT 1 mM រយៈពេល 3 ម៉ោងនៅសីតុណ្ហភាព 27°C។ ប្រតិកម្មត្រូវបានបញ្ឈប់ដោយបន្ថែមមេតាណុល 400 µl ហើយធ្វើឱ្យត្រជាក់នៅសីតុណ្ហភាព -20°C រយៈពេល 1 ម៉ោង បន្ទាប់មកបង្វិលនៅ 20,000 g រយៈពេល 10 នាទីនៅសីតុណ្ហភាព 4°C។ សារធាតុរាវខាងលើត្រូវបានវិភាគដោយ HPLC-MS/MS។
បំណែក PCR សម្រាប់ EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) និង EcK2 (556 bp) ត្រូវបានពង្រីកពី cDNA ដែលរៀបចំពីសាកសពមូសគ្មានក្បាលភេទចម្រុះ។ បំណែក PCR នៃការគ្រប់គ្រង eGFP (495 bp) ត្រូវបានពង្រីកពី pCR2.1-eGFP ដែលបានពិពណ៌នាពីមុន; ប្រាយមឺរ PCR ត្រូវបានរាយបញ្ជីនៅក្នុងតារាងទិន្នន័យបន្ថែម 2។ បំណែក PCR ត្រូវបានបញ្ចូលរវាងប្រូម៉ូទ័រ T7 ដែលដាក់បញ្ច្រាសនៅលើប្លាស្មីត pL4440។ រចនាសម្ព័ន្ធប្លាស្មីតត្រូវបានរកឃើញពី E. coli ដែលមានសមត្ថភាព NEB 5-α (New England Biolabs) ហើយត្រូវបានផ្ទៀងផ្ទាត់ដោយការធ្វើលំដាប់ DNA មុនពេលប្រើ (សូមមើលទិន្នន័យបន្ថែម 1 សម្រាប់លំដាប់បញ្ចូល)។ ប្រាយមឺរដែលត្រូវគ្នានឹងប្រូម៉ូទ័រ T7 (តារាងទិន្នន័យបន្ថែម 2) ត្រូវបានប្រើដើម្បីពង្រីកការបញ្ចូលពីប្លាស្មីតដែលមានមូលដ្ឋានលើ pL4440។ ទំហំផលិតផល PCR ត្រូវបានបញ្ជាក់ដោយអេឡិចត្រូផូរីស៊ីសជែល agarose។ dsRNA ត្រូវបានចម្លងពីគំរូ PCR ដោយប្រើឧបករណ៍ Megascript T7 Transcription Kit (Thermo Fisher) ហើយត្រូវបានបន្សុទ្ធតាមការណែនាំរបស់អ្នកផលិតជាមួយនឹងការកែប្រែដែលបានពិពណ៌នាពីមុន។
សម្រាប់ការចាក់ dsRNA ចំនួន 1,380 ng នៃ dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) ត្រូវបានចាក់ក្នុងកំហាប់ 10 ng nl-1 ចូលទៅក្នុងទ្រូងរបស់បុរស ឬស្ត្រីពេញវ័យ (Nanoject III, Drummond) ក្នុងរយៈពេល 1 ថ្ងៃបន្ទាប់ពីការបិទជិត។ កម្រិតនៃការបំផ្លាញហ្សែនត្រូវបានកំណត់នៅក្នុងការចម្លងជីវសាស្រ្តយ៉ាងហោចណាស់បីដោយការស្រង់ចេញ RNA ការសំយោគ cDNA និង RT-qPCR។ សម្រាប់ការចាក់ ecdysone សេះញីព្រហ្មចារីអាយុ 4 ថ្ងៃ ឬសេះញីព្រហ្មចារីអាយុ 6 ថ្ងៃដែលចិញ្ចឹមដោយឈាមត្រូវបានចាក់ 0.13, 0.21 ឬ 0.63 µg នៃ 20E ឬ 3D20E (Nanoject III, Drummond) ក្នុងកំហាប់ 1.3, 2.1 រៀងគ្នា អាស្រ័យលើការរចនាពិសោធន៍ ឬ 6.3 ng nl-1។ ចាក់អេតាណុល 10% (vol/vol) ចំនួន 100 nl ក្នុងទឹក។ 100 nl នៃ 3D20E22P ក្នុងអេតាណុល 10% (ស្មើនឹង 75% នៃបរិមាណដែលរកឃើញនៅក្នុង MAGs មួយគូ)។ មូសត្រូវបានចាត់ថ្នាក់ដោយចៃដន្យទៅក្នុងក្រុមចាក់។
ចំពោះការធ្វើតេស្តពងកូន មូសញីអាយុ 3 ថ្ងៃត្រូវបានផ្តល់ចំណីតាមអំពើចិត្តលើឈាមមនុស្ស។ យកមូសដែលស៊ីចំណីខ្លះ ឬមិនទាន់ស៊ីចំណីចេញ។ អាស្រ័យលើការព្យាបាល មូសញីត្រូវបានដាក់ក្នុងពែងពងកូនដាច់ដោយឡែកពីគ្នារយៈពេលបួនយប់យ៉ាងហោចណាស់ 48 ម៉ោងបន្ទាប់ពីស៊ីឈាម។ ស៊ុតត្រូវបានរាប់ក្រោមស្តេរ៉េអូស្កុប (Stemi 508, Zeiss); ចំពោះមូសញីដែលរួមរ័ក ស៊ុតដែលញាស់ជាដង្កូវត្រូវបានចាត់ទុកថាមានកូន។
សម្រាប់ការសាកល្បងរួមរ័ក សត្វញីត្រូវបានអនុញ្ញាតឱ្យស្នាក់នៅយ៉ាងហោចណាស់ 2 ថ្ងៃអាស្រ័យលើការព្យាបាលដើម្បីបង្កើតភាពធន់នឹងការរួមរ័ក ហើយសត្វឈ្មោលព្រៃដែលមានអាយុដូចគ្នាត្រូវបានបញ្ចូលទៅក្នុងទ្រុងដូចគ្នា។ ពីរយប់ក្រោយមក ពងបែកញីដែលមានជីជាតិត្រូវបានវះកាត់ ហើយ DNA ហ្សែនត្រូវបានបញ្ចេញដោយការកក-រលាយ និង sonication នៅក្នុងសារធាតុ buffer ដែលមាន 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA និង 25 mM NaCl (pH 8.2)។ គំរូត្រូវបានភ្ញាស់ជាមួយ Proteinase K (0.86 µg µl-1) រយៈពេល 15 នាទីនៅសីតុណ្ហភាព 55°C បន្ទាប់មក 10 នាទីនៅសីតុណ្ហភាព 95°C។ ការរៀបចំ DNA ហ្សែនឆៅត្រូវបានពនលាយ 10 ដង និងទទួលរងនូវការរកឃើញ qPCR នៃលំដាប់ក្រូម៉ូសូម Y; ប្រាយម័រត្រូវបានរាយក្នុងតារាងទិន្នន័យបន្ថែម 2។ អវត្តមាននៃលំដាប់ក្រូម៉ូសូម Y បង្ហាញពីការមិនរួមរ័ក។
ចំពោះការវិភាគរកការរួមរ័កឡើងវិញ សត្វញីដែលត្រូវបានបង្ខំឱ្យរួមរ័កត្រូវបានពិនិត្យរកមើលវត្តមាននៃដោតរួមរ័កដើម្បីបញ្ជាក់ពីស្ថានភាពរួមរ័ក ហើយបានអនុញ្ញាតឱ្យរយៈពេល 2 ថ្ងៃដើម្បីវិវត្តទៅជាភាពធន់នឹងការរួមរ័កក្នុងករណីដែលគ្មានសត្វឈ្មោល ដូចដែលបានពិពណ៌នាពីមុន 36។ សត្វឈ្មោលដែលមានមេជីវិតឈ្មោលប្តូរហ្សែន DsRed ត្រូវបានបញ្ចូលទៅក្នុងទ្រុងសត្វញី។ ពីរយប់ក្រោយមក ពពុះបង្កកំណើតត្រូវបានកាត់ចេញពីសត្វញី ហើយ DNA ហ្សែនត្រូវបានរៀបចំដូចដែលបានពិពណ៌នាខាងលើ និងទទួលរងនូវការរកឃើញ qPCR នៃហ្សែនប្តូរហ្សែន DsRed; ប្រាយម័រត្រូវបានរាយក្នុងតារាងទិន្នន័យបន្ថែម 2។ អវត្តមាននៃហ្សែនប្តូរហ្សែន DsRed បានបង្ហាញថាមិនមានការរួមរ័កឡើងវិញកើតឡើងទេ។
3D20E ត្រូវបានសំយោគដូចដែលបានពិពណ៌នាពីមុន 37។ សរុបមក 20E (Sigma-Aldrich) ចំនួន 10 មីលីក្រាម ត្រូវបានរំលាយក្នុងទឹក 10 មីលីលីត្រ បន្ទាប់មកបន្ថែមផ្លាទីនខ្មៅចំនួន 30 មីលីក្រាម (ក្នុងទម្រង់ជាម្សៅ Sigma-Aldrich)។ ស្ទ្រីមអុកស៊ីសែនស្រាលៗត្រូវបានពពុះជាបន្តបន្ទាប់ចូលទៅក្នុងល្បាយប្រតិកម្ម ដែលត្រូវបានកូរនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។ បន្ទាប់ពី 6 ម៉ោង មេតាណុលចំនួន 30 មីលីលីត្រ ត្រូវបានបន្ថែមដើម្បីបញ្ឈប់ប្រតិកម្ម។ ល្បាយនេះត្រូវបានបង្វិលដើម្បីយកភាគល្អិតកាតាលីករចេញ។ សារធាតុរាវខាងលើត្រូវបានហួតរហូតដល់ស្ងួតក្នុងកន្លែងទំនេរនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។ ផលិតផលប្រតិកម្មស្ងួតត្រូវបានរំលាយក្នុងអេតាណុល និងមេតាណុល 10% សម្រាប់ចាក់សម្រាប់ការវិភាគ HPLC-MS/MS។ អត្រាបំលែង (ពី 20E ដល់ 3D20E) គឺប្រហែល 97% (រូបភាពទី 4b) ហើយវិសាលគម MS នៃ 3D20E សំយោគត្រូវគ្នានឹងអ្វីដែលមាននៅក្នុងញីដែលរួមរ័ក (រូបភាពទី 4c)។
រឿងព្រេងនិទានមានព័ត៌មានលម្អិតជាក់លាក់នៃការធ្វើតេស្តស្ថិតិដែលបានអនុវត្ត។ GraphPad (កំណែ 9.0) ត្រូវបានប្រើដើម្បីអនុវត្តការធ្វើតេស្តពិតប្រាកដរបស់ Fisher ការធ្វើតេស្ត Mantel-Cox និងការធ្វើតេស្ត t របស់សិស្ស។ ការធ្វើតេស្ត Cochran-Mantel-Haenszel ត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើស្គ្រីប R ផ្ទាល់ខ្លួន (មាននៅ https://github.com/duopeng/mantelhaen.test)។ ការចែកចាយទិន្នន័យត្រូវបានសាកល្បងសម្រាប់ភាពធម្មតាដោយប្រើការធ្វើតេស្ត Shapiro-Wilk ជាមួយនឹងកម្រិតសារៈសំខាន់ 0.05។ នៅពេលដែលទិន្នន័យបរាជ័យក្នុងការធ្វើតេស្តភាពធម្មតា ការធ្វើតេស្ត Mann-Whitney ត្រូវបានអនុវត្ត។ ទិន្នន័យរស់រានមានជីវិតត្រូវបានវិភាគដោយប្រើការធ្វើតេស្ត Mantel-Cox។ កញ្ចប់ DESeq2 (កំណែ 1.28.1) ត្រូវបានប្រើដើម្បីអនុវត្តការវិភាគការបញ្ចេញមតិឌីផេរ៉ង់ស្យែលកម្រិតហ្សែន RNA-seq។ របារផ្ដេកនៅលើក្រាហ្វតំណាងឱ្យមេឌីយ៉ាន។ តម្លៃសារៈសំខាន់នៃ P = 0.05 ត្រូវបានប្រើជាកម្រិតសម្រាប់ការធ្វើតេស្តទាំងអស់។
សម្រាប់ព័ត៌មានបន្ថែមអំពីការរចនាការសិក្សា សូមមើលសេចក្តីសង្ខេបនៃរបាយការណ៍ស្រាវជ្រាវធម្មជាតិដែលភ្ជាប់ទៅនឹងអត្ថបទនេះ។
ទិន្នន័យ​ប្រូតេអូមិច MS ត្រូវ​បាន​ដាក់​បញ្ចូល​ទៅ​ក្នុង ProteomeXchange Consortium (http://proteomecentral.proteomexchange.org) តាមរយៈ PRIDE Partner Repository (https://www.ebi.ac.uk/pride/) ជាមួយ​នឹង​ឧបករណ៍​កំណត់​អត្តសញ្ញាណ​សំណុំ​ទិន្នន័យ PXD032157។
សំណុំទិន្នន័យ RNA-seq ត្រូវបានរក្សាទុកនៅក្នុង Gene Expression Comprehensive Library (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) ក្រោមកំណត់ត្រាស៊េរី GSE198665។
សំណុំទិន្នន័យបន្ថែមដែលបង្កើត និង/ឬវិភាគក្នុងអំឡុងពេលសិក្សាបច្ចុប្បន្នអាចទទួលបានពីអ្នកនិពន្ធដែលត្រូវគ្នាតាមការស្នើសុំសមហេតុផល។ អត្ថបទនេះផ្តល់នូវទិន្នន័យប្រភព។
ដឺ លូហ្វ, អេ. អេកឌីស្តេរ៉ូអ៊ីត៖ ស្តេរ៉ូអ៊ីត​ផ្លូវភេទ​របស់​សត្វល្អិត​ដែល​ត្រូវ​បាន​គេ​មិន​អើពើ? ឈ្មោល៖ ប្រអប់ខ្មៅ។ វិទ្យាសាស្ត្រ​សត្វល្អិត។ ១៣, ៣២៥–៣៣៨ (២០០៦)។
Redfern, CPF 20-hydroxyecdysone និងការវិវត្តនៃអូវែរនៅក្នុងសត្វ Anopheles stephens.J. Insect Physiology.28, 97–109 (1982).