សារធាតុរំលាយប្រព័ន្ធភាពស៊ាំគឺជាលក្ខណៈសំខាន់នៃមីក្រូបរិស្ថានដុំសាច់ (TME) ប៉ុន្តែលើកលែងតែមួយចំនួន អត្តសញ្ញាណរបស់វាភាគច្រើននៅតែមិនស្គាល់។ នៅទីនេះ យើងបានវិភាគដុំសាច់ និងកោសិកា T ពីដុំសាច់ និងទឹកក្នុងក្រពះរបស់អ្នកជំងឺដែលមានជំងឺមហារីកសេរ៉ូមកម្រិតខ្ពស់ (HGSC) ដើម្បីបង្ហាញពីសារធាតុរំលាយនៃផ្នែក TME ផ្សេងៗគ្នាទាំងនេះ។ ទឹកក្នុងក្រពះ និងកោសិកាដុំសាច់មានភាពខុសគ្នាយ៉ាងទូលំទូលាយនៃសារធាតុរំលាយ។ បើប្រៀបធៀបទៅនឹងទឹកក្នុងក្រពះ កោសិកា T ដែលជ្រៀតចូលដុំសាច់ត្រូវបានបង្កើនយ៉ាងខ្លាំងនៅក្នុង 1-methylnicotinamide (MNA)។ ទោះបីជាកម្រិតនៃ MNA នៅក្នុងកោសិកា T ត្រូវបានកើនឡើងក៏ដោយ ការបញ្ចេញមតិរបស់ nicotinamide N-methyltransferase (អង់ស៊ីមដែលជំរុញការផ្ទេរក្រុមមេទីលពី S-adenosylmethionine ទៅ nicotinamide) ត្រូវបានកំណត់ចំពោះ fibroblasts និងកោសិកាដុំសាច់។ មុខងារ MNA ជំរុញកោសិកា T ឱ្យបញ្ចេញ cytokine tumor necrosis factor alpha ដែលជំរុញដុំសាច់។ ដូច្នេះ MNA ដែលមានប្រភពមកពី TME រួមចំណែកដល់ការគ្រប់គ្រងភាពស៊ាំនៃកោសិកា T និងតំណាងឱ្យគោលដៅព្យាបាលភាពស៊ាំដ៏មានសក្តានុពលសម្រាប់ការព្យាបាលជំងឺមហារីករបស់មនុស្ស។
សារធាតុរំលាយដែលមានប្រភពមកពីដុំសាច់អាចមានឥទ្ធិពលរារាំងយ៉ាងខ្លាំងទៅលើភាពស៊ាំប្រឆាំងនឹងដុំសាច់ ហើយភស្តុតាងកាន់តែច្រើនបង្ហាញថា ពួកវាក៏អាចបម្រើជាកម្លាំងជំរុញដ៏សំខាន់សម្រាប់ការវិវត្តនៃជំងឺផងដែរ (1)។ បន្ថែមពីលើឥទ្ធិពល Warburg ការងារថ្មីៗបានចាប់ផ្តើមកំណត់លក្ខណៈស្ថានភាពមេតាបូលីសនៃកោសិកាដុំសាច់ និងទំនាក់ទំនងរបស់វាជាមួយនឹងស្ថានភាពភាពស៊ាំនៃមីក្រូបរិស្ថានដុំសាច់ (TME)។ ការសិក្សាលើគំរូកណ្ដុរ និងកោសិកា T របស់មនុស្សបានបង្ហាញថា ការរំលាយអាហារ glutamine (2) ការរំលាយអាហារអុកស៊ីតកម្ម (3) និងការរំលាយអាហារគ្លុយកូស (4) អាចធ្វើសកម្មភាពដោយឯករាជ្យលើក្រុមរងកោសិកាភាពស៊ាំផ្សេងៗ។ សារធាតុរំលាយមួយចំនួននៅក្នុងផ្លូវទាំងនេះរារាំងមុខងារប្រឆាំងនឹងដុំសាច់របស់កោសិកា T។ វាត្រូវបានបង្ហាញថា ការរារាំងនៃ coenzyme tetrahydrobiopterin (BH4) អាចបំផ្លាញការរីកសាយនៃកោសិកា T ហើយការកើនឡើងនៃ BH4 នៅក្នុងរាងកាយអាចបង្កើនការឆ្លើយតបនៃប្រព័ន្ធភាពស៊ាំប្រឆាំងនឹងដុំសាច់ដែលសម្របសម្រួលដោយ CD4 និង CD8។ លើសពីនេះ ប្រសិទ្ធភាពបង្ក្រាបភាពស៊ាំរបស់ kynurenine អាចត្រូវបានជួយសង្គ្រោះដោយការគ្រប់គ្រង BH4 (5)។ នៅក្នុង glioblastoma ដែលមានការផ្លាស់ប្តូរហ្សែន isocitrate dehydrogenase (IDH) ការបញ្ចេញ enantiometabolic (R)-2-hydroxyglutarate (R-2-HG) រារាំងសកម្មភាពកោសិកា T ការរីកសាយ និងសកម្មភាព cytolysis (6)។ ថ្មីៗនេះ វាត្រូវបានបង្ហាញថា methylglyoxal ដែលជាផលិតផលរងនៃ glycolysis ត្រូវបានផលិតដោយកោសិកាទប់ស្កាត់ដែលមានប្រភពដើម myeloid ហើយការផ្ទេរ methylglyoxal ដោយកោសិកា T អាចរារាំងមុខងារកោសិកា T effector។ នៅក្នុងការព្យាបាល ការបន្សាប methylglyoxal អាចយកឈ្នះលើសកម្មភាពរបស់កោសិកាទប់ស្កាត់ដែលមានប្រភពមកពី myeloid (MDSC) និងបង្កើនការព្យាបាលទប់ស្កាត់ចំណុចត្រួតពិនិត្យដោយសហការគ្នានៅក្នុងគំរូកណ្ដុរ (7)។ ការសិក្សាទាំងនេះរួមគ្នាសង្កត់ធ្ងន់លើតួនាទីសំខាន់នៃសារធាតុរំលាយអាហារដែលមានប្រភពមកពី TME ក្នុងការគ្រប់គ្រងមុខងារ និងសកម្មភាពកោសិកា T។
ភាពមិនប្រក្រតីនៃកោសិកា T ត្រូវបានរាយការណ៍យ៉ាងទូលំទូលាយនៅក្នុងជំងឺមហារីកអូវែរ (8)។ នេះគឺដោយសារតែលក្ខណៈមេតាបូលីសដែលមាននៅក្នុងកង្វះអុកស៊ីសែន និងសរសៃឈាមដុំសាច់មិនប្រក្រតី (9) ដែលបណ្តាលឱ្យមានការបំប្លែងជាតិស្ករ និងទ្រីបតូហ្វានទៅជាផលិតផលរងដូចជាអាស៊ីតឡាក់ទិក និងគីនូរ៉េនីន។ ឡាក់តេតក្រៅកោសិកាច្រើនពេកកាត់បន្ថយការផលិតអ៊ីនធឺហ្វេរ៉ុន-γ (IFN-γ) និងជំរុញភាពខុសគ្នានៃក្រុមរង myelosuppressive (10, 11)។ ការប្រើប្រាស់ទ្រីបតូហ្វានរារាំងដោយផ្ទាល់នូវការរីកសាយកោសិកា T និងរារាំងសញ្ញារបស់អ្នកទទួលកោសិកា T (12-14)។ បើទោះបីជាមានការសង្កេតទាំងនេះក៏ដោយ ការងារជាច្រើនដែលទាក់ទងនឹងការរំលាយអាហារភាពស៊ាំត្រូវបានអនុវត្តនៅក្នុងវីត្រូ ការដាំដុះកោសិកា T ដោយប្រើមេឌៀដែលបានធ្វើឱ្យប្រសើរឡើង ឬកំណត់ចំពោះគំរូកណ្ដុរដូចគ្នានៅក្នុងវីវ៉ូ ដែលមិនឆ្លុះបញ្ចាំងយ៉ាងពេញលេញពីភាពខុសគ្នានៃជំងឺមហារីករបស់មនុស្ស និងបរិស្ថានម៉ាក្រូ និងមីក្រូសរីរវិទ្យា។
លក្ខណៈទូទៅមួយនៃជំងឺមហារីកអូវែរគឺការរីករាលដាលនៃពោះ និងរូបរាងនៃទឹកក្នុងពោះ។ ការប្រមូលផ្តុំសារធាតុរាវកោសិកានៅក្នុងទឹកក្នុងពោះត្រូវបានផ្សារភ្ជាប់ជាមួយនឹងជំងឺកម្រិតខ្ពស់ និងការព្យាករណ៍មិនល្អ (15)។ យោងតាមរបាយការណ៍ ផ្នែកពិសេសនេះមានកម្រិតអុកស៊ីសែនទាប មានកម្រិតខ្ពស់នៃកត្តាលូតលាស់នៃសរសៃឈាម endothelial (VEGF) និង indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) ហើយត្រូវបានជ្រៀតចូលដោយកោសិកា T និយតកម្ម និងកោសិកា myeloid inhibitory (15-18)។ បរិស្ថានមេតាបូលីសនៃទឹកក្នុងពោះអាចខុសពីដុំសាច់ខ្លួនឯង ដូច្នេះការសរសេរកម្មវិធីឡើងវិញនៃកោសិកា T នៅក្នុងលំហពោះគឺមិនច្បាស់លាស់ទេ។ លើសពីនេះ ភាពខុសគ្នាសំខាន់ៗ និងភាពមិនដូចគ្នារវាងទឹកក្នុងពោះ និងសារធាតុរំលាយអាហារដែលមាននៅក្នុងបរិស្ថានដុំសាច់អាចរារាំងការជ្រៀតចូលនៃកោសិកាភាពស៊ាំ និងមុខងាររបស់វាលើដុំសាច់ ហើយការស្រាវជ្រាវបន្ថែមគឺត្រូវការ។
ដើម្បីដោះស្រាយបញ្ហាទាំងនេះ យើងបានរចនាវិធីសាស្ត្របំបែកកោសិកាដែលងាយប្រតិកម្ម និងក្រូម៉ាតូក្រាហ្វីរាវ tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) ដើម្បីសិក្សាពីប្រភេទកោសិកាផ្សេងៗគ្នា (រួមទាំងកោសិកា T CD4 + និង CD8 +) ក៏ដូចជានៅក្នុង និងរវាងដុំសាច់។ សារធាតុរំលាយអាហាររបស់វាលាតសន្ធឹងលើកោសិកានៅក្នុងទឹកក្នុងពោះ និងបរិយាកាសដុំសាច់ដូចគ្នារបស់អ្នកជំងឺ។ យើងប្រើវិធីសាស្ត្រនេះរួមគ្នាជាមួយនឹងស៊ីតូម៉ែត្រីលំហូរវិមាត្រខ្ពស់ និងលំដាប់ RNA កោសិកាតែមួយ (scRNA-seq) ដើម្បីផ្តល់នូវរូបភាពដែលមានគុណភាពបង្ហាញខ្ពស់នៃស្ថានភាពមេតាបូលីសនៃចំនួនប្រជាជនសំខាន់ៗទាំងនេះ។ វិធីសាស្ត្រនេះបានបង្ហាញពីការកើនឡើងគួរឱ្យកត់សម្គាល់នៃកម្រិត 1-methylnicotinamide (MNA) នៅក្នុងកោសិកា T ដុំសាច់ ហើយការពិសោធន៍នៅក្នុងវីត្រូបានបង្ហាញថា ឥទ្ធិពលនៃប្រព័ន្ធភាពស៊ាំរបស់ MNA លើមុខងារកោសិកា T មិនធ្លាប់មានពីមុនមកទេ។ ជាទូទៅ វិធីសាស្ត្រនេះបង្ហាញពីអន្តរកម្មមេតាបូលីសទៅវិញទៅមករវាងដុំសាច់ និងកោសិកាភាពស៊ាំ និងផ្តល់នូវការយល់ដឹងពិសេសអំពីសារធាតុរំលាយអាហារបទប្បញ្ញត្តិភាពស៊ាំ ដែលអាចមានប្រយោជន៍សម្រាប់ការព្យាបាលជំងឺមហារីកអូវែរដែលមានមូលដ្ឋានលើកោសិកា T។ ឱកាសព្យាបាល។
យើងបានប្រើស៊ីតូម៉ែត្រីលំហូរវិមាត្រខ្ពស់ ដើម្បីវាស់បរិមាណនៃការទទួលយកជាតិស្ករក្នុងពេលដំណាលគ្នា [2-(N-(7-nitrophenyl-2-oxa-1,3-diaza-4-yl)amino)-2-deoxyglucose (2-NBDG) និងសកម្មភាពមីតូខនឌ្រី [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) គឺជាសញ្ញាសម្គាល់ធម្មតាដែលសម្គាល់កោសិកាភាពស៊ាំ និងចំនួនកោសិកាដុំសាច់ (តារាង S2 និងរូបភាព S1A)។ ការវិភាគនេះបានបង្ហាញថា បើប្រៀបធៀបទៅនឹងកោសិកា T ទឹកក្នុងពោះ និងកោសិកាដុំសាច់មានកម្រិតទទួលយកជាតិស្ករខ្ពស់ជាង ប៉ុន្តែមានភាពខុសគ្នាតិចជាងនៅក្នុងសកម្មភាពមីតូខនឌ្រី។ ការទទួលយកជាតិស្ករជាមធ្យមរបស់កោសិកាដុំសាច់ [CD45-EpCAM (EpCAM)+] គឺបីទៅបួនដងនៃកោសិកា T ហើយការទទួលយកជាតិស្ករជាមធ្យមរបស់កោសិកា CD4 + T គឺ 1.2 ដងនៃកោសិកា CD8 + T ដែលបង្ហាញថាកោសិកាឡាំហ្វូស៊ីតជ្រៀតចូលដុំសាច់ (TIL) មានតម្រូវការមេតាបូលីសខុសគ្នា សូម្បីតែនៅក្នុង TME ដូចគ្នា (រូបភាពទី 1A)។ ផ្ទុយទៅវិញ សកម្មភាពមីតូខនឌ្រីនៅក្នុងកោសិកាដុំសាច់គឺស្រដៀងគ្នាទៅនឹងកោសិកា CD4 + T ហើយសកម្មភាពមីតូខនឌ្រីនៃកោសិកាទាំងពីរប្រភេទគឺខ្ពស់ជាងកោសិកា CD8 + T (រូបភាពទី 1B)។ ជាទូទៅ លទ្ធផលទាំងនេះបង្ហាញពីកម្រិតមេតាបូលីស។ សកម្មភាពមេតាបូលីសរបស់កោសិកាដុំសាច់គឺខ្ពស់ជាងកោសិកា CD4 + T ហើយសកម្មភាពមេតាបូលីសរបស់កោសិកា CD4 + T គឺខ្ពស់ជាងកោសិកា CD8 + T។ ទោះបីជាមានឥទ្ធិពលទាំងនេះនៅទូទាំងប្រភេទកោសិកាក៏ដោយ ក៏មិនមានភាពខុសគ្នាជាប់លាប់នៅក្នុងស្ថានភាពមេតាបូលីសរបស់កោសិកា CD4 + និង CD8 + T ឬសមាមាត្រដែលទាក់ទងរបស់វានៅក្នុងទឹកក្នុងពោះបើប្រៀបធៀបទៅនឹងដុំសាច់ (រូបភាពទី 1C)។ ផ្ទុយទៅវិញ នៅក្នុងប្រភាគកោសិកា CD45 សមាមាត្រនៃកោសិកា EpCAM+ នៅក្នុងដុំសាច់បានកើនឡើងបើប្រៀបធៀបទៅនឹងទឹកក្នុងពោះ (រូបភាពទី 1D)។ យើងក៏បានសង្កេតឃើញភាពខុសគ្នានៃការមេតាបូលីសច្បាស់លាស់រវាងសមាសធាតុកោសិកា EpCAM+ និង EpCAM-។ កោសិកា EpCAM+ (ដុំសាច់) មានការស្រូបយកជាតិស្ករ និងសកម្មភាពមីតូខនឌ្រីខ្ពស់ជាងកោសិកា EpCAM- ដែលខ្ពស់ជាងសកម្មភាពមេតាបូលីសរបស់សរសៃជាលិកានៅក្នុងកោសិកាដុំសាច់នៅក្នុង TME (រូបភាពទី 1, E និង F)។
(A និង B) អាំងតង់ស៊ីតេពន្លឺមធ្យម (MFI) នៃការទទួលយកជាតិស្ករ (2-NBDG) (A) និងសកម្មភាពមីតូខនឌ្រីនៃកោសិកា CD4 + T (MitoTracker ពណ៌ក្រហមចាស់) (B) ក្រាហ្វតំណាង (ឆ្វេង) និងទិន្នន័យតារាង (ស្តាំ) កោសិកា CD8 + T និងកោសិកា EpCAM + CD45-ដុំសាច់ពីទឹកក្នុងក្រពះ និងដុំសាច់។ (C) សមាមាត្រនៃកោសិកា CD4 + និង CD8 + (នៃកោសិកា CD3 + T) នៅក្នុងទឹកក្នុងក្រពះ និងដុំសាច់។ (D) សមាមាត្រនៃកោសិកា EpCAM + ដុំសាច់នៅក្នុងទឹកក្នុងក្រពះ និងដុំសាច់ (CD45−)។ (E និង F) ការទទួលយកជាតិស្ករ EpCAM + CD45-ដុំសាច់ និងម៉ាទ្រីស EpCAM-CD45 (2-NBDG) (E) និងសកម្មភាពមីតូខនឌ្រី (MitoTracker ពណ៌ក្រហមចាស់) (F) ក្រាហ្វតំណាង (ឆ្វេង) និងទិន្នន័យតារាង (ស្តាំ) ទឹកក្នុងក្រពះ និងកោសិកាដុំសាច់។ (G) ក្រាហ្វតំណាងនៃការបញ្ចេញមតិ CD25, CD137 និង PD1 ដោយលំហូរស៊ីតូមេទ្រី។ (H និង I) ការបញ្ចេញមតិ CD25, CD137 និង PD1 លើកោសិកា CD4 + T (H) និងកោសិកា CD8 + T (I)។ (J និង K) លក្ខណៈសាមញ្ញនៃអង្គចងចាំកណ្តាល (Tcm) អង្គបដិប្រាណ (Teff) និងអង្គចងចាំអង្គបដិប្រាណ (Tem) ដោយផ្អែកលើការបញ្ចេញមតិរបស់ CCR7 និង CD45RO។ រូបភាពតំណាង (ឆ្វេង) និងទិន្នន័យតារាង (ស្តាំ) នៃកោសិកា CD4 + T (J) និងកោសិកា CD8 + T (K) នៅក្នុងទឹកក្នុងពោះ និងដុំសាច់។ តម្លៃ P កំណត់ដោយការធ្វើតេស្ត t-test ផ្គូផ្គង (*P<0.05, **P<0.01 និង ***P<0.001)។ បន្ទាត់តំណាងឱ្យអ្នកជំងឺដែលត្រូវគ្នា (n = 6)។ FMO ពន្លឺបញ្ចេញពន្លឺដកមួយ; MFI អាំងតង់ស៊ីតេពន្លឺបញ្ចេញពន្លឺមធ្យម។
ការវិភាគបន្ថែមបានបង្ហាញពីភាពខុសគ្នាសំខាន់ៗផ្សេងទៀតរវាងស្ថានភាព phenotype កោសិកា T ដែលត្រូវបានដោះស្រាយខ្ពស់។ កោសិកាដែលបានធ្វើឱ្យសកម្ម (រូបភាពទី 1, G ដល់ I) និងអង្គចងចាំ effector (រូបភាពទី 1, J និង K) នៅក្នុងដុំសាច់គឺកើតមានញឹកញាប់ជាង ascites (សមាមាត្រនៃកោសិកា CD3 + T)។ ស្រដៀងគ្នានេះដែរ ការវិភាគ phenotype ដោយការបញ្ចេញមតិនៃសញ្ញាសម្គាល់ការធ្វើឱ្យសកម្ម (CD25 និង CD137) និងសញ្ញាសម្គាល់ការថយចុះ [ប្រូតេអ៊ីនស្លាប់កោសិកាដែលបានកម្មវិធី 1 (PD1)] បានបង្ហាញថា ទោះបីជាលក្ខណៈមេតាបូលីសនៃចំនួនប្រជាជនទាំងនេះខុសគ្នាក៏ដោយ (រូបភាព S1, B ដល់ E) ប៉ុន្តែមិនមានភាពខុសគ្នាគួរឱ្យកត់សម្គាល់នៃការរំលាយអាហារត្រូវបានគេសង្កេតឃើញជាប់លាប់រវាងសំណុំរង naive, effector ឬអង្គចងចាំ (រូបភាព S1, F ដល់ I)។ លទ្ធផលទាំងនេះត្រូវបានបញ្ជាក់ដោយប្រើវិធីសាស្រ្តរៀនម៉ាស៊ីនដើម្បីកំណត់ phenotype កោសិកាដោយស្វ័យប្រវត្តិ (21) ដែលបានបង្ហាញបន្ថែមទៀតអំពីវត្តមាននៃកោសិកាខួរឆ្អឹងមួយចំនួនធំ (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) នៅក្នុង ascites របស់អ្នកជំងឺ (រូបភាព S2A)។ ក្នុងចំណោមប្រភេទកោសិកាទាំងអស់ដែលបានកំណត់អត្តសញ្ញាណ ចំនួនកោសិកាមីអ៊ីឡូអ៊ីតនេះបានបង្ហាញពីការស្រូបយកជាតិស្ករ និងសកម្មភាពមីតូខនឌ្រីខ្ពស់បំផុត (រូបភាព S2, B ដល់ G)។ លទ្ធផលទាំងនេះបង្ហាញពីភាពខុសគ្នាខ្លាំងនៃការរំលាយអាហាររវាងកោសិកាច្រើនប្រភេទដែលត្រូវបានរកឃើញនៅក្នុងទឹកក្នុងពោះ និងដុំសាច់ចំពោះអ្នកជំងឺ HGSC។
បញ្ហាប្រឈមចម្បងក្នុងការយល់ដឹងអំពីលក្ខណៈមេតាបូណូមិករបស់ TIL គឺតម្រូវការក្នុងការញែកសំណាកកោសិកា T ដែលមានទំហំ គុណភាព និងបរិមាណគ្រប់គ្រាន់ចេញពីដុំសាច់។ ការសិក្សាថ្មីៗបានបង្ហាញថា វិធីសាស្ត្រតម្រៀប និងបង្កើនបរិមាណអង្កាំដោយផ្អែកលើលំហូរស៊ីតូម៉ែត្រីអាចនាំឱ្យមានការផ្លាស់ប្តូរទម្រង់មេតាបូលីតកោសិកា (22-24)។ ដើម្បីជម្នះបញ្ហានេះ យើងបានធ្វើឱ្យប្រសើរឡើងនូវវិធីសាស្ត្របង្កើនបរិមាណអង្កាំដើម្បីញែក និងញែក TIL ចេញពីជំងឺមហារីកអូវែររបស់មនុស្សដែលត្រូវបានវះកាត់មុនពេលវិភាគដោយ LC-MS/MS (សូមមើលសម្ភារៈ និងវិធីសាស្រ្ត; រូបភាពទី 2A)។ ដើម្បីវាយតម្លៃផលប៉ះពាល់រួមនៃពិធីការនេះលើការផ្លាស់ប្តូរមេតាបូលីត យើងបានប្រៀបធៀបទម្រង់មេតាបូលីតនៃកោសិកា T ដែលបានធ្វើឱ្យសកម្មដោយអ្នកបរិច្ចាគដែលមានសុខភាពល្អបន្ទាប់ពីជំហានបំបែកអង្កាំខាងលើជាមួយកោសិកាដែលមិនត្រូវបានបំបែកអង្កាំប៉ុន្តែនៅតែស្ថិតនៅលើទឹកកក។ ការវិភាគត្រួតពិនិត្យគុណភាពនេះបានរកឃើញថា មានទំនាក់ទំនងខ្ពស់រវាងលក្ខខណ្ឌទាំងពីរនេះ (r = 0.77) ហើយភាពអាចធ្វើម្តងទៀតបានតាមបច្ចេកទេសនៃក្រុមមេតាបូលីតចំនួន 86 មានភាពអាចធ្វើម្តងទៀតបានខ្ពស់ (រូបភាពទី 2B)។ ដូច្នេះ វិធីសាស្ត្រទាំងនេះអាចអនុវត្តការវិភាគមេតាបូលីតបានត្រឹមត្រូវនៅក្នុងកោសិកាដែលកំពុងឆ្លងកាត់ការបង្កើនប្រភេទកោសិកា ដោយហេតុនេះផ្តល់នូវវេទិកាដែលមានគុណភាពបង្ហាញខ្ពស់ដំបូងគេសម្រាប់កំណត់អត្តសញ្ញាណមេតាបូលីតជាក់លាក់នៅក្នុង HGSC ដោយហេតុនេះអាចឱ្យមនុស្សទទួលបានការយល់ដឹងកាន់តែស៊ីជម្រៅអំពីភាពជាក់លាក់នៃកោសិកា កម្មវិធីមេតាបូលីតផ្លូវភេទ។
(ក) ដ្យាក្រាមគ្រោងការណ៍នៃការបង្កើនបរិមាណម៉ាញេទិក។ មុនពេលវិភាគដោយ LC-MS/MS កោសិកានឹងឆ្លងកាត់ការបង្កើនបរិមាណម៉ាញេទិកបីជុំជាប់ៗគ្នា ឬនៅតែស្ថិតនៅលើទឹកកក។ (ខ) ឥទ្ធិពលនៃប្រភេទបង្កើនបរិមាណលើភាពសម្បូរបែបនៃសារធាតុរំលាយអាហារ។ មធ្យមភាគនៃការវាស់វែងបីសម្រាប់ប្រភេទបង្កើនបរិមាណនីមួយៗ ± SE។ ខ្សែពណ៌ប្រផេះតំណាងឱ្យទំនាក់ទំនង 1:1។ សហសម្ព័ន្ធអន្តរថ្នាក់ (ICC) នៃការវាស់វែងម្តងហើយម្តងទៀតដែលបង្ហាញក្នុងស្លាកអ័ក្ស។ NAD, nicotinamide adenine dinucleotide។ (គ) ដ្យាក្រាមគ្រោងការណ៍នៃលំហូរការងារនៃការវិភាគសារធាតុរំលាយអាហាររបស់អ្នកជំងឺ។ ទឹកក្នុងក្រពះ ឬដុំសាច់ត្រូវបានប្រមូលពីអ្នកជំងឺ ហើយរក្សាទុកក្នុងសីតុណ្ហភាពត្រជាក់។ ផ្នែកតូចមួយនៃគំរូនីមួយៗត្រូវបានវិភាគដោយលំហូរស៊ីតូម៉ែត្រី ខណៈពេលដែលគំរូដែលនៅសល់បានឆ្លងកាត់ការបង្កើនបរិមាណបីជុំសម្រាប់កោសិកា CD4+, CD8+ និង CD45-។ ប្រភាគកោសិកាទាំងនេះត្រូវបានវិភាគដោយប្រើ LC-MS/MS។ (ឃ) ផែនទីកំដៅនៃភាពសម្បូរបែបនៃសារធាតុរំលាយអាហារស្តង់ដារ។ ដេនដ្រូក្រាមតំណាងឱ្យការដាក់ជាក្រុមរបស់ Ward នៃចម្ងាយ Euclidean រវាងគំរូ។ (ង) ការវិភាគសមាសភាគចម្បង (PCA) នៃផែនទីមេតាបូលីតគំរូ ដែលបង្ហាញពីច្បាប់ចម្លងចំនួនបីនៃគំរូនីមួយៗ គំរូពីអ្នកជំងឺដូចគ្នាត្រូវបានភ្ជាប់ដោយបន្ទាត់មួយ។ (ច) PCA នៃទម្រង់មេតាបូលីតនៃគំរូដែលត្រូវបានកំណត់លក្ខខណ្ឌលើអ្នកជំងឺ (ឧ. ការប្រើប្រាស់ភាពលើសលប់ដោយផ្នែក); ប្រភេទគំរូត្រូវបានកំណត់ដោយសំបកប៉ោង។ PC1 សមាសភាគសំខាន់ទី 1; PC2 សមាសភាគសំខាន់ទី 2។
បន្ទាប់មក យើងបានអនុវត្តវិធីសាស្ត្របង្កើនប្រសិទ្ធភាពនេះដើម្បីវិភាគសារធាតុរំលាយអាហារចំនួន 99 នៅក្នុងប្រភាគកោសិកា CD4+, CD8+ និង CD45 នៅក្នុងទឹកក្នុងពោះបឋម និងដុំសាច់របស់អ្នកជំងឺ HGSC ចំនួនប្រាំមួយនាក់ (រូបភាពទី 2C រូបភាព S3A និងតារាង S3 និង S4)។ ចំនួនប្រជាជនដែលចាប់អារម្មណ៍មានចំនួនពី 2% ទៅ 70% នៃគំរូធំដើមនៃកោសិការស់ ហើយសមាមាត្រនៃកោសិកាមានភាពខុសគ្នាយ៉ាងខ្លាំងរវាងអ្នកជំងឺ។ បន្ទាប់ពីបំបែកអង្កាំ ប្រភាគដែលចាប់អារម្មណ៍ដែលបង្កើនប្រសិទ្ធភាព (CD4+, CD8+ ឬ CD45-) មានចំនួនជាង 85% នៃកោសិការស់ទាំងអស់នៅក្នុងគំរូជាមធ្យម។ វិធីសាស្ត្របង្កើនប្រសិទ្ធភាពនេះអនុញ្ញាតឱ្យយើងវិភាគចំនួនប្រជាជនកោសិកាពីការរំលាយអាហារជាលិកាដុំសាច់របស់មនុស្ស ដែលមិនអាចធ្វើបានពីគំរូធំៗ។ ដោយប្រើពិធីការនេះ យើងបានកំណត់ថា l-kynurenine និង adenosine ដែលជាសារធាតុរំលាយអាហារទប់ស្កាត់ប្រព័ន្ធភាពស៊ាំពីរប្រភេទនេះ ដែលត្រូវបានកំណត់លក្ខណៈយ៉ាងល្អ ត្រូវបានកើនឡើងនៅក្នុងកោសិកា T ដុំសាច់ ឬកោសិកាដុំសាច់ (រូបភាព S3, B និង C)។ ដូច្នេះ លទ្ធផលទាំងនេះបង្ហាញពីភាពស្មោះត្រង់ និងសមត្ថភាពនៃបច្ចេកវិទ្យាបំបែកកោសិកា និងម៉ាសស្ពិចត្រូម៉ែត្រីរបស់យើង ដើម្បីស្វែងរកសារធាតុរំលាយអាហារសំខាន់ៗខាងជីវសាស្រ្តនៅក្នុងជាលិកាអ្នកជំងឺ។
ការវិភាគរបស់យើងក៏បានបង្ហាញពីការបំបែកមេតាបូលីសយ៉ាងខ្លាំងនៃប្រភេទកោសិកានៅក្នុង និងរវាងអ្នកជំងឺ (រូបភាពទី 2D និងរូបភាព S4A)។ ជាពិសេស បើប្រៀបធៀបជាមួយអ្នកជំងឺដទៃទៀត អ្នកជំងឺទី 70 បានបង្ហាញពីលក្ខណៈមេតាបូលីសខុសៗគ្នា (រូបភាពទី 2E និងរូបភាព S4B) ដែលបង្ហាញថាអាចមានភាពខុសគ្នានៃមេតាបូលីសយ៉ាងច្រើនរវាងអ្នកជំងឺ។ គួរកត់សម្គាល់ថា បើប្រៀបធៀបជាមួយអ្នកជំងឺដទៃទៀត (1.2 ទៅ 2 លីត្រ; តារាង S1) បរិមាណសរុបនៃទឹកក្នុងពោះដែលប្រមូលបានក្នុងអ្នកជំងឺទី 70 (80 មីលីលីត្រ) គឺតូចជាង។ ការគ្រប់គ្រងភាពខុសគ្នារវាងអ្នកជំងឺម្នាក់ៗក្នុងអំឡុងពេលវិភាគសមាសធាតុចម្បង (ឧទាហរណ៍ ការប្រើប្រាស់ការវិភាគលើសដោយផ្នែក) បង្ហាញពីការផ្លាស់ប្តូរជាប់លាប់រវាងប្រភេទកោសិកា ហើយប្រភេទកោសិកា និង/ឬមីក្រូបរិស្ថានត្រូវបានប្រមូលផ្តុំយ៉ាងច្បាស់ទៅតាមទម្រង់មេតាបូលីត (រូបភាពទី 2F)។ ការវិភាគមេតាបូលីតតែមួយបានសង្កត់ធ្ងន់លើផលប៉ះពាល់ទាំងនេះ និងបានបង្ហាញពីភាពខុសគ្នាគួរឱ្យកត់សម្គាល់រវាងប្រភេទកោសិកា និងមីក្រូបរិស្ថាន។ គួរកត់សម្គាល់ថាភាពខុសគ្នាខ្លាំងបំផុតដែលសង្កេតឃើញគឺ MNA ដែលជាធម្មតាសម្បូរទៅដោយកោសិកា CD45- និងកោសិកា CD4+ និង CD8+ ដែលជ្រៀតចូលទៅក្នុងដុំសាច់ (រូបភាពទី 3A)។ ចំពោះកោសិកា CD4+ ឥទ្ធិពលនេះគឺជាក់ស្តែងបំផុត ហើយ MNA នៅក្នុងកោសិកា CD8+ ក៏ហាក់ដូចជារងផលប៉ះពាល់យ៉ាងខ្លាំងពីបរិស្ថានផងដែរ។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ នេះមិនសំខាន់ទេ ពីព្រោះមានតែអ្នកជំងឺបីនាក់ក្នុងចំណោមអ្នកជំងឺប្រាំមួយនាក់ប៉ុណ្ណោះដែលអាចត្រូវបានវាយតម្លៃសម្រាប់ពិន្ទុ CD8+ ដុំសាច់។ បន្ថែមពីលើ MNA នៅក្នុងប្រភេទកោសិកាផ្សេងៗគ្នានៅក្នុងទឹកក្នុងពោះ និងដុំសាច់ សារធាតុរំលាយផ្សេងទៀតដែលត្រូវបានកំណត់លក្ខណៈមិនល្អនៅក្នុង TIL ក៏មានភាពសម្បូរបែបខុសៗគ្នាផងដែរ (រូបភាព S3 និង S4)។ ដូច្នេះ ទិន្នន័យទាំងនេះបង្ហាញពីសំណុំនៃសារធាតុរំលាយប្រព័ន្ធភាពស៊ាំដ៏ជោគជ័យសម្រាប់ការស្រាវជ្រាវបន្ថែម។
(ក) មាតិកា MNA ដែលមានលក្ខណៈធម្មតានៅក្នុងកោសិកា CD4+, CD8+ និង CD45- ពីទឹកក្នុងក្រពះ និងដុំសាច់។ គ្រោងប្រអប់បង្ហាញមេឌីយ៉ាន (បន្ទាត់) ជួរអន្តរក្វាទីល (ហ៊ីងស៊ុម) និងជួរទិន្នន័យ រហូតដល់ 1.5 ដងនៃជួរអន្តរក្វាទីល (ស្វីស្កឺរស៊ុម)។ ដូចដែលបានពិពណ៌នានៅក្នុងសម្ភារៈ និងវិធីសាស្ត្ររបស់អ្នកជំងឺ សូមប្រើតម្លៃ limma របស់អ្នកជំងឺដើម្បីកំណត់តម្លៃ P (*P<0.05 និង **P<0.01)។ (ខ) ដ្យាក្រាមគ្រោងការណ៍នៃការរំលាយអាហារ MNA (60)។ មេតាបូលីត៖ S-adenosyl-1-methionine; SAH, S-adenosine-1-homocysteine; NA, nicotinamide; MNA, 1-methylnicotinamide; 2-PY, 1-methyl-2-pyridone-5-carboxamide; 4-PY, 1-methyl-4-pyridone-5-carboxamide; NR, nicotinamide ribose; NMN, nicotinamide mononucleotide។ អង់ស៊ីម (ពណ៌បៃតង): NNMT, nicotinamide N-methyltransferase; SIRT, sirtuins; NAMPT, nicotinamide phosphoribosyl transferase; AOX1, aldehyde oxidase 1; NRK, nicotinamide riboside kinase; NMNAT, nicotinamide mono Nucleotide adenylate transferase; Pnp1, purine nucleoside phosphorylase។ (គ) t-SNE នៃ scRNA-seq នៃ ascites (ពណ៌ប្រផេះ) និងដុំសាច់ (ក្រហម; n = 3 អ្នកជំងឺ)។ (ឃ) ការបញ្ចេញមតិ NNMT នៅក្នុងចំនួនប្រជាជនកោសិកាផ្សេងៗគ្នាដែលត្រូវបានកំណត់ដោយប្រើ scRNA-seq។ (ង) ការបញ្ចេញមតិរបស់ NNMT និង AOX1 នៅក្នុង SK-OV-3, តម្រងនោមអំប្រ៊ីយ៉ុងមនុស្ស (HEK) 293T, កោសិកា T និងកោសិកា T ដែលព្យាបាលដោយ MNA។ ការបញ្ចេញមតិបត់ត្រូវបានបង្ហាញទាក់ទងទៅនឹង SK-OV-3។ លំនាំការបញ្ចេញមតិជាមួយ SEM ត្រូវបានបង្ហាញ (n = 6 អ្នកបរិច្ចាគដែលមានសុខភាពល្អ)។ តម្លៃ Ct ធំជាង 35 ត្រូវបានចាត់ទុកថាមិនអាចរកឃើញ (UD)។ (ច) ការបញ្ចេញមតិរបស់ SLC22A1 និង SLC22A2 នៅក្នុងកោសិកា SK-OV-3, HEK293T, កោសិកា T និងកោសិកា T ដែលត្រូវបានព្យាបាលដោយ MNA 8mM។ ការបញ្ចេញមតិដែលបត់ត្រូវបានបង្ហាញទាក់ទងទៅនឹង SK-OV-3។ គំរូការបញ្ចេញមតិជាមួយ SEM ត្រូវបានបង្ហាញ (n = អ្នកបរិច្ចាគដែលមានសុខភាពល្អ 6 នាក់)។ តម្លៃ Ct ធំជាង 35 ត្រូវបានចាត់ទុកថាមិនអាចរកឃើញ (UD)។ (ឆ) មាតិកា MNA កោសិកានៅក្នុងកោសិកា T អ្នកបរិច្ចាគដែលមានសុខភាពល្អដែលបានធ្វើឱ្យសកម្មបន្ទាប់ពីការភ្ញាស់ជាមួយ MNA រយៈពេល 72 ម៉ោង។ គំរូការបញ្ចេញមតិជាមួយ SEM ត្រូវបានបង្ហាញ (n = អ្នកបរិច្ចាគដែលមានសុខភាពល្អ 4 នាក់)។
MNA ត្រូវបានផលិតឡើងដោយការផ្ទេរក្រុមមេទីលពី S-adenosyl-1-methionine (SAM) ទៅ nicotinamide (NA) ដោយ nicotinamide N-methyltransferase (NNMT; រូបភាពទី 3B)។ NNMT ត្រូវបានបង្ហាញច្រើនពេកនៅក្នុងជំងឺមហារីករបស់មនុស្សជាច្រើនប្រភេទ ហើយត្រូវបានផ្សារភ្ជាប់ជាមួយនឹងការរីកសាយ ការឈ្លានពាន និងការរីករាលដាល (25-27)។ ដើម្បីយល់កាន់តែច្បាស់អំពីប្រភពនៃ MNA នៅក្នុងកោសិកា T នៅក្នុង TME យើងបានប្រើ scRNA-seq ដើម្បីកំណត់លក្ខណៈនៃការបញ្ចេញមតិរបស់ NNMT នៅទូទាំងប្រភេទកោសិកានៅក្នុងទឹកក្នុងក្រពះ និងដុំសាច់របស់អ្នកជំងឺ HGSC បីនាក់ (តារាង S5)។ ការវិភាគលើកោសិកាប្រហែល 6,500 បានបង្ហាញថានៅក្នុងទឹកក្នុងក្រពះ និងបរិស្ថានដុំសាច់ ការបញ្ចេញមតិ NNMT ត្រូវបានកំណត់ចំពោះចំនួនប្រជាជនកោសិកា fibroblast និងដុំសាច់ដែលសន្មត់ (រូបភាពទី 3, C និង D)។ គួរកត់សម្គាល់ថាមិនមានការបញ្ចេញមតិ NNMT ជាក់ស្តែងនៅក្នុងចំនួនប្រជាជនណាមួយដែលបញ្ចេញមតិ PTPRC (CD45 +) (រូបភាពទី 3D និងរូបភាព S5A) ដែលបង្ហាញថា MNA ដែលត្រូវបានរកឃើញនៅក្នុងវិសាលគមមេតាបូលីតត្រូវបានបញ្ចូលទៅក្នុងកោសិកា T។ ការបញ្ចេញមតិរបស់អាល់ដេអ៊ីតអុកស៊ីដេស 1 (AOX1) បំលែង MNA ទៅជា 1-មេទីល-2-ពីរីដូន-5-កាបូសាមីដ (2-PYR) ឬ 1-មេទីល-4-ពីរីដូន-5-កាបូសាមីដ (4-PYR); រូបភាពទី 3B) ក៏ត្រូវបានកំណត់ចំពោះចំនួនប្រជាជននៃជាលិកាភ្ជាប់ដែលបញ្ចេញមតិ COL1A1 (រូបភាព S5A) ដែលបង្ហាញថាកោសិកា T ខ្វះសមត្ថភាពនៃការរំលាយអាហារ MNA ធម្មតា។ គំរូនៃការបញ្ចេញមតិនៃហ្សែនដែលទាក់ទងនឹង MNA ទាំងនេះត្រូវបានផ្ទៀងផ្ទាត់ដោយប្រើសំណុំទិន្នន័យកោសិកាឯករាជ្យទីពីរពីទឹកក្នុងក្រពះពីអ្នកជំងឺ HGSC (រូបភាព S5B; n = 6) (16)។ លើសពីនេះ ការវិភាគប្រតិកម្មខ្សែសង្វាក់ប៉ូលីមែររ៉ាសបរិមាណ (qPCR) នៃកោសិកា T អ្នកបរិច្ចាគដែលមានសុខភាពល្អដែលត្រូវបានព្យាបាលដោយ MNA បានបង្ហាញថាបើប្រៀបធៀបទៅនឹងកោសិកាដុំសាច់អូវែរ SK-OV-3 ត្រួតពិនិត្យ NNMT ឬ AOX1 ស្ទើរតែមិនត្រូវបានបញ្ចេញមតិទេ (រូបភាពទី 3E)។ លទ្ធផលដែលមិននឹកស្មានដល់ទាំងនេះបង្ហាញថា MNA អាចត្រូវបានបញ្ចេញចេញពីជាលិកាភ្ជាប់ ឬដុំសាច់ចូលទៅក្នុងកោសិកា T ដែលនៅជាប់គ្នានៅក្នុង TME។
ទោះបីជាបេក្ខជនរួមមានក្រុមគ្រួសារនៃអ្នកដឹកជញ្ជូនកាតាយុងសរីរាង្គ 1 ដល់ 3 (OCT1, OCT2 និង OCT3) ដែលត្រូវបានអ៊ិនកូដដោយក្រុមគ្រួសារអ្នកដឹកជញ្ជូនរលាយ 22 (SLC22) (SLC22A1, SLC22A2 និង SLC22A3) ក៏ដោយ អ្នកដឹកជញ្ជូនដែលមានសក្តានុពលនៃ MNA នៅតែមិនទាន់ត្រូវបានកំណត់ (28)។ QPCR នៃ mRNA ពីកោសិកា T donor ដែលមានសុខភាពល្អបានបង្ហាញកម្រិតនៃការបញ្ចេញមតិទាបនៃ SLC22A1 ប៉ុន្តែកម្រិតនៃ SLC22A2 មិនអាចរកឃើញ ដែលបញ្ជាក់ថាវាត្រូវបានរាយការណ៍ពីមុននៅក្នុងអក្សរសិល្ប៍ (រូបភាពទី 3F) (29)។ ផ្ទុយទៅវិញ ខ្សែកោសិកាដុំសាច់អូវែរ SK-OV-3 បានបញ្ចេញមតិកម្រិតខ្ពស់នៃអ្នកដឹកជញ្ជូនទាំងពីរ (រូបភាពទី 3F)។
ដើម្បីសាកល្បងលទ្ធភាពដែលកោសិកា T មានសមត្ថភាពស្រូបយក MNA បរទេស កោសិកា T របស់អ្នកបរិច្ចាគដែលមានសុខភាពល្អត្រូវបានដាំដុះរយៈពេល 72 ម៉ោងនៅក្នុងវត្តមាននៃកំហាប់ MNA ផ្សេងៗគ្នា។ ក្នុងករណីដែលគ្មាន MNA ខាងក្រៅ មាតិកាកោសិកានៃ MNA មិនអាចត្រូវបានរកឃើញទេ (រូបភាពទី 3G)។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ កោសិកា T ដែលបានធ្វើឱ្យសកម្មដែលត្រូវបានព្យាបាលដោយ MNA ខាងក្រៅបានបង្ហាញពីការកើនឡើងអាស្រ័យលើកម្រិតថ្នាំនៃមាតិកា MNA នៅក្នុងកោសិកា រហូតដល់ 6 mM MNA (រូបភាពទី 3G)។ លទ្ធផលនេះបង្ហាញថា ទោះបីជាមានកម្រិតទាបនៃការបញ្ចេញមតិអ្នកដឹកជញ្ជូន និងកង្វះអង់ស៊ីមសំខាន់ដែលទទួលខុសត្រូវចំពោះការរំលាយអាហារ MNA ក្នុងកោសិកាក៏ដោយ TIL នៅតែអាចទទួលយក MNA បាន។
វិសាលគមនៃសារធាតុរំលាយអាហារនៅក្នុងកោសិកា T របស់អ្នកជំងឺ និងការពិសោធន៍ស្រូបយក MNA ក្នុងវីត្រូ បង្កើនលទ្ធភាពដែលកោសិកា fibroblast ដែលទាក់ទងនឹងជំងឺមហារីក (CAF) បញ្ចេញ MNA ហើយកោសិកាដុំសាច់អាចគ្រប់គ្រង phenotype និងមុខងាររបស់ TIL។ ដើម្បីកំណត់ឥទ្ធិពលរបស់ MNA លើកោសិកា T កោសិកាអ្នកបរិច្ចាគ T ដែលមានសុខភាពល្អត្រូវបានធ្វើឱ្យសកម្មនៅក្នុងវីត្រូនៅក្នុងវត្តមាន ឬអវត្តមាននៃ MNA ហើយការរីកសាយ និងការផលិត cytokine របស់វាត្រូវបានវាយតម្លៃ។ បន្ទាប់ពី 7 ថ្ងៃនៃការបន្ថែម MNA ក្នុងកម្រិតខ្ពស់បំផុត ចំនួនប្រជាជនកើនឡើងទ្វេដងត្រូវបានកាត់បន្ថយមធ្យម ខណៈពេលដែលភាពរឹងមាំត្រូវបានរក្សានៅគ្រប់កម្រិតទាំងអស់ (រូបភាពទី 4A)។ លើសពីនេះ ការព្យាបាល MNA ពីខាងក្រៅបានបណ្តាលឱ្យមានការកើនឡើងនៃសមាមាត្រនៃកោសិកា CD4 + និង CD8 + T ដែលបង្ហាញពីកត្តា necrosis tumor-α (TNFα; រូបភាពទី 4B)។ ផ្ទុយទៅវិញ ការផលិត IFN-γ ក្នុងកោសិកាត្រូវបានកាត់បន្ថយគួរឱ្យកត់សម្គាល់នៅក្នុងកោសិកា CD4 + T ប៉ុន្តែមិនមែននៅក្នុងកោសិកា CD8 + T ទេ ហើយមិនមានការផ្លាស់ប្តូរគួរឱ្យកត់សម្គាល់នៅក្នុង interleukin 2 (IL-2; រូបភាពទី 4, C និង D)។ ដូច្នេះ ការវិភាគអង់ស៊ីមភ្ជាប់ភាពស៊ាំ (ELISA) នៃសារធាតុរាវខាងលើពីការដាំដុះកោសិកា T ដែលបានព្យាបាលដោយ MNA ទាំងនេះបានបង្ហាញពីការកើនឡើងគួរឱ្យកត់សម្គាល់នៃ TNFα ការថយចុះនៃ IFN-γ និងគ្មានការផ្លាស់ប្តូរនៅក្នុង IL-2 (រូបភាពទី 4 ពី E ដល់ G)។ ការថយចុះនៃ IFN-γ បង្ហាញថា MNA អាចដើរតួនាទីក្នុងការរារាំងសកម្មភាពប្រឆាំងនឹងដុំសាច់របស់កោសិកា T។ ដើម្បីក្លែងធ្វើឥទ្ធិពលរបស់ MNA លើជាតិពុលកោសិកាដែលសម្របសម្រួលដោយកោសិកា T កោសិកា T ដែលទទួលអង់ទីហ្សែន chimeric (FRα-CAR-T) ដែលកំណត់គោលដៅលើអ្នកទទួល folate α និងកោសិកា CAR-T (GFP) ដែលគ្រប់គ្រងដោយកោសិកាប្រូតេអ៊ីន fluorescent ពណ៌បៃតង (GFP-CAR-T) ត្រូវបានផលិតដោយកោសិកា mononuclear ឈាមអ្នកបរិច្ចាគដែលមានសុខភាពល្អ (PBMC)។ កោសិកា CAR-T ត្រូវបានដាំដុះរយៈពេល 24 ម៉ោងនៅក្នុងវត្តមានរបស់ MNA ហើយបន្ទាប់មកត្រូវបានដាំដុះរួមគ្នាជាមួយកោសិកាដុំសាច់អូវែរ SK-OV-3 របស់មនុស្សដែលបង្ហាញអ្នកទទួល folate α ក្នុងសមាមាត្រ effector ទៅគោលដៅ 10:1។ ការព្យាបាលដោយ MNA បានបណ្តាលឱ្យមានការថយចុះគួរឱ្យកត់សម្គាល់នៃសកម្មភាពសម្លាប់កោសិកា FRα-CAR-T ដែលស្រដៀងគ្នាទៅនឹងកោសិកា FRα-CAR-T ដែលត្រូវបានព្យាបាលដោយ adenosine (រូបភាពទី 4H)។
(ក) ចំនួនកោសិកាសរុបដែលអាចរស់បាន និងការកើនឡើងទ្វេដងនៃចំនួនប្រជាជន (PD) ដោយផ្ទាល់ពីការដាំដុះនៅថ្ងៃទី 7។ ក្រាហ្វរបារតំណាងឱ្យមធ្យមភាគ + SEM នៃអ្នកបរិច្ចាគដែលមានសុខភាពល្អចំនួនប្រាំមួយ។ តំណាងឱ្យទិន្នន័យពីការពិសោធន៍ឯករាជ្យយ៉ាងហោចណាស់ n = 3។ (ខ ដល់ ឃ) CD3/CD28 និង IL-2 ត្រូវបានប្រើដើម្បីធ្វើឱ្យកោសិកា T សកម្មនៅកំហាប់ MNA រៀងៗខ្លួនរយៈពេល 7 ថ្ងៃ។ មុនពេលវិភាគ កោសិកាត្រូវបានជំរុញដោយ PMA/ionomycin ជាមួយ GolgiStop រយៈពេល 4 ម៉ោង។ ការបញ្ចេញមតិ TNFα (ខ) នៅក្នុងកោសិកា T។ រូបភាពឧទាហរណ៍ (ឆ្វេង) និងទិន្នន័យតារាង (ស្តាំ) នៃការបញ្ចេញមតិ TNFα នៅក្នុងកោសិការស់។ ការបញ្ចេញមតិ IFN-γ (គ) និង IL-2 (ឃ) នៅក្នុងកោសិកា T។ ការបញ្ចេញមតិនៃ cytokines ត្រូវបានវាស់ដោយ flow cytometry។ ក្រាហ្វរបារតំណាងឱ្យមធ្យមភាគ (n = អ្នកបរិច្ចាគដែលមានសុខភាពល្អ 6 នាក់) + SEM។ ប្រើការវិភាគតែមួយផ្លូវនៃភាពខុសគ្នា និងវិធានការម្តងហើយម្តងទៀត (*P<0.05 និង **P<0.01) ដើម្បីកំណត់តម្លៃ P។ តំណាងឱ្យទិន្នន័យពីការពិសោធន៍ឯករាជ្យយ៉ាងហោចណាស់ n = 3។ (E ដល់ G) CD3/CD28 និង IL-2 ត្រូវបានប្រើដើម្បីធ្វើឱ្យកោសិកា T សកម្មនៅកំហាប់ MNA រៀងៗខ្លួនរយៈពេល 7 ថ្ងៃ។ ឧបករណ៍ផ្ទុកត្រូវបានប្រមូលមុន និងក្រោយការរំញោច PMA/ionomycin រយៈពេល 4 ម៉ោង។ កំហាប់នៃ TNFα (E), IFN-γ (F) និង IL-2 (G) ត្រូវបានវាស់ដោយ ELISA។ ក្រាហ្វរបារតំណាងឱ្យមធ្យមភាគ (n = អ្នកបរិច្ចាគដែលមានសុខភាពល្អ 5 នាក់) + SEM។ តម្លៃ P កំណត់ដោយប្រើការវិភាគវ៉ារ្យង់តែមួយផ្លូវ និងការវាស់វែងម្តងហើយម្តងទៀត (*P<0.05)។ បន្ទាត់ចំនុចបង្ហាញពីដែនកំណត់នៃការរកឃើញនៃការរកឃើញ។ (H) ការវិភាគបំបែកកោសិកា។ កោសិកា FRα-CAR-T ឬ GFP-CAR-T ត្រូវបានកែតម្រូវជាមួយ adenosine (250μM) ឬ MNA (10 mM) រយៈពេល 24 ម៉ោង ឬទុកចោលដោយមិនបានព្យាបាល (Ctrl)។ ភាគរយនៃការសម្លាប់កោសិកា SK-OV-3 ត្រូវបានវាស់។ តម្លៃ P កំណត់ដោយការធ្វើតេស្ត Welch t (*P<0.5 និង **P<0.01)។
ដើម្បីទទួលបានការយល់ដឹងអំពីយន្តការនៃបទប្បញ្ញត្តិនៃការបញ្ចេញមតិ TNFα ដែលពឹងផ្អែកលើ MNA ការផ្លាស់ប្តូរនៅក្នុង mRNA TNFα នៃកោសិកា T ដែលព្យាបាលដោយ MNA ត្រូវបានវាយតម្លៃ (រូបភាពទី 5A)។ កោសិកា T បរិច្ចាគដែលមានសុខភាពល្អដែលត្រូវបានព្យាបាលដោយ MNA បានបង្ហាញពីការកើនឡើងទ្វេដងនៃកម្រិតចម្លង TNFα ដែលបង្ហាញថា MNA ពឹងផ្អែកលើបទប្បញ្ញត្តិចម្លង TNFα។ ដើម្បីស៊ើបអង្កេតយន្តការនិយតកម្មដែលអាចធ្វើទៅបាននេះ កត្តាចម្លងពីរដែលគេស្គាល់ដែលគ្រប់គ្រង TNFα គឺកត្តានុយក្លេអ៊ែរកោសិកា T ដែលបានធ្វើឱ្យសកម្ម (NFAT) និងប្រូតេអ៊ីនជាក់លាក់ 1 (Sp1) ត្រូវបានវាយតម្លៃជាការឆ្លើយតបទៅនឹងការភ្ជាប់ MNA ទៅនឹងប្រូម៉ូទ័រ TNFα ជិត (30)។ ប្រូម៉ូទ័រ TNFα មានកន្លែងភ្ជាប់ NFAT ដែលបានកំណត់អត្តសញ្ញាណចំនួន 6 និងកន្លែងភ្ជាប់ Sp1 ចំនួន 2 ដែលត្រួតស៊ីគ្នានៅកន្លែងមួយ [-55 គូមូលដ្ឋាន (bp) ពី 5'cap] (30)។ ភាពស៊ាំនឹងក្រូម៉ាទីន (ChIP) បានបង្ហាញថានៅពេលដែលព្យាបាលដោយ MNA ការភ្ជាប់ Sp1 ទៅនឹងប្រូម៉ូទ័រ TNFα បានកើនឡើងបីដង។ ការដាក់បញ្ចូល NFAT ក៏កើនឡើង និងខិតជិតសារៈសំខាន់ផងដែរ (រូបភាពទី 5B)។ ទិន្នន័យទាំងនេះបង្ហាញថា MNA គ្រប់គ្រងការបញ្ចេញមតិរបស់ TNFα តាមរយៈការចម្លង Sp1 និងក្នុងកម្រិតតិចជាងនេះ គ្រប់គ្រងការបញ្ចេញមតិរបស់ NFAT។
(ក) បើប្រៀបធៀបជាមួយកោសិកា T ដែលដាំដុះដោយគ្មាន MNA ការផ្លាស់ប្តូរផ្នត់នៃការបញ្ចេញមតិ TNFα នៅក្នុងកោសិកា T ដែលបានព្យាបាលដោយ MNA។ គំរូការបញ្ចេញមតិជាមួយ SEM ត្រូវបានបង្ហាញ (n = 5 អ្នកបរិច្ចាគដែលមានសុខភាពល្អ)។ តំណាងឱ្យទិន្នន័យពីការពិសោធន៍ឯករាជ្យយ៉ាងហោចណាស់ n = 3។ (ខ) ប្រូម៉ូទ័រ TNFα នៃកោសិកា T ដែលបានព្យាបាលដោយមាន ឬគ្មាន 8 mM MNA បន្ទាប់ពី NFAT និង Sp1 ត្រូវបានផ្សំជាមួយនឹងការរំញោច (Ctrl) និងការរំញោច PMA/ionomycin រយៈពេល 4 ម៉ោង។ Immunoglobulin G (IgG) និង H3 ត្រូវបានប្រើជាការគ្រប់គ្រងអវិជ្ជមាន និងវិជ្ជមានសម្រាប់ការตกตะกอนភាពស៊ាំរៀងៗខ្លួន។ ការវាស់វែងនៃ ChIP បានបង្ហាញថាការភ្ជាប់នៃ Sp1 និង NFAT ទៅនឹងប្រូម៉ូទ័រ TNFα នៅក្នុងកោសិកាដែលបានព្យាបាលដោយ MNA បានកើនឡើងច្រើនដងបើប្រៀបធៀបជាមួយការគ្រប់គ្រង។ តំណាងឱ្យទិន្នន័យពីការពិសោធន៍ឯករាជ្យយ៉ាងហោចណាស់ n = 3។ តម្លៃ P ដែលកំណត់ដោយការធ្វើតេស្ត t ច្រើន (*** P <0.01)។ (គ) បើប្រៀបធៀបទៅនឹង ascites នៃ HGSC កោសិកា T (មិនពុលកោសិកា) បានបង្ហាញពីការកើនឡើងនៃការបញ្ចេញមតិនៃ TNF នៅក្នុងដុំសាច់។ ពណ៌តំណាងឱ្យអ្នកជំងឺផ្សេងៗគ្នា។ កោសិកាដែលបានបង្ហាញត្រូវបានយកសំណាកដោយចៃដន្យដល់ 300 ហើយញ័រដើម្បីកំណត់ការអូសលើស (** Padj = 0.0076)។ (D) គំរូដែលបានស្នើឡើងនៃ MNA សម្រាប់ជំងឺមហារីកអូវែរ។ MNA ត្រូវបានផលិតនៅក្នុងកោសិកាដុំសាច់ និង fibroblasts នៅក្នុង TME ហើយត្រូវបានស្រូបយកដោយកោសិកា T។ MNA បង្កើនការភ្ជាប់ Sp1 ទៅនឹងប្រូម៉ូទ័រ TNFα ដែលនាំឱ្យមានការកើនឡើងនៃការចម្លង TNFα និងការផលិត cytokine TNFα។ MNA ក៏បណ្តាលឱ្យមានការថយចុះនៃ IFN-γ ផងដែរ។ ការរារាំងមុខងារកោសិកា T នាំឱ្យមានការថយចុះសមត្ថភាពសម្លាប់ និងបង្កើនល្បឿនការលូតលាស់ដុំសាច់។
យោងតាមរបាយការណ៍ TNFα មានឥទ្ធិពលប្រឆាំងនឹងដុំសាច់ និងប្រឆាំងនឹងដុំសាច់ដែលពឹងផ្អែកលើផ្នែកខាងមុខ និងខាងក្រោយ ប៉ុន្តែវាមានតួនាទីដែលគេស្គាល់យ៉ាងច្បាស់ក្នុងការជំរុញការលូតលាស់ និងការរីករាលដាលនៃជំងឺមហារីកអូវែរ (31-33)។ យោងតាមរបាយការណ៍ កំហាប់ TNFα នៅក្នុងទឹកក្នុងពោះ និងជាលិកាដុំសាច់ចំពោះអ្នកជំងឺដែលមានជំងឺមហារីកអូវែរគឺខ្ពស់ជាងនៅក្នុងជាលិកាស្លូត (34-36)។ ទាក់ទងនឹងយន្តការ TNFα អាចគ្រប់គ្រងការធ្វើឱ្យសកម្ម មុខងារ និងការរីកសាយនៃកោសិកាឈាមស និងផ្លាស់ប្តូរលក្ខណៈនៃកោសិកាមហារីក (37, 38)។ ស្របជាមួយនឹងការរកឃើញទាំងនេះ ការវិភាគការបញ្ចេញហ្សែនឌីផេរ៉ង់ស្យែលបានបង្ហាញថា TNF ត្រូវបានគ្រប់គ្រងកើនឡើងគួរឱ្យកត់សម្គាល់នៅក្នុងកោសិកា T នៅក្នុងជាលិកាដុំសាច់បើប្រៀបធៀបទៅនឹងទឹកក្នុងពោះ (រូបភាពទី 5C)។ ការកើនឡើងនៃការបញ្ចេញមតិ TNF គឺជាក់ស្តែងតែនៅក្នុងចំនួនប្រជាជនកោសិកា T ដែលមានលក្ខណៈមិនពុលកោសិកា (រូបភាព S5A)។ សរុបមក ទិន្នន័យទាំងនេះគាំទ្រទស្សនៈដែលថា MNA មានឥទ្ធិពលបង្ក្រាបភាពស៊ាំ និងជំរុញដុំសាច់ពីរនៅក្នុង HGSC។
ការដាក់ស្លាក fluorescent ដោយផ្អែកលើលំហូរ cytometry បានក្លាយជាវិធីសាស្ត្រសំខាន់សម្រាប់សិក្សាពីការរំលាយអាហារ TIL ។ ការសិក្សាទាំងនេះបានបង្ហាញថាបើប្រៀបធៀបទៅនឹង lymphocytes ឈាមគ្រឿងកុំព្យូទ័រ ឬកោសិកា T ពីសរីរាង្គ lymphoid បន្ទាប់បន្សំ TIL កណ្ដុរ និងមនុស្សមានទំនោរខ្ពស់ជាងក្នុងការទទួលយកជាតិស្ករ (4, 39) និងការបាត់បង់បន្តិចម្តងៗនៃមុខងារមីតូខនឌ្រី (19, 40)។ ទោះបីជាយើងបានសង្កេតឃើញលទ្ធផលស្រដៀងគ្នានៅក្នុងការសិក្សានេះក៏ដោយ ការអភិវឌ្ឍដ៏សំខាន់គឺការប្រៀបធៀបការរំលាយអាហាររបស់កោសិកាដុំសាច់ និង TIL ពីជាលិកាដុំសាច់ដែលត្រូវបានកាត់ផ្តាច់ដូចគ្នា។ ស្របនឹងរបាយការណ៍មុនៗមួយចំនួនទាំងនេះ កោសិកាដុំសាច់ (CD45-EpCAM +) ពី ascites និងដុំសាច់មានការទទួលយកជាតិស្ករខ្ពស់ជាងកោសិកា CD8 + និង CD4 + T ដែលគាំទ្រថាការទទួលយកជាតិស្ករខ្ពស់នៃកោសិកាដុំសាច់អាចត្រូវបានប្រៀបធៀបជាមួយកោសិកា T ។ គំនិតនៃការប្រកួតប្រជែងកោសិកា T ។ TME ។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ សកម្មភាពមីតូខនឌ្រីនៃកោសិកាដុំសាច់គឺខ្ពស់ជាងកោសិកា CD8 + T ប៉ុន្តែសកម្មភាពមីតូខនឌ្រីគឺស្រដៀងគ្នាទៅនឹងកោសិកា CD4 + T ។ លទ្ធផលទាំងនេះពង្រឹងប្រធានបទដែលកំពុងលេចចេញថាការរំលាយអាហារអុកស៊ីតកម្មគឺសំខាន់សម្រាប់កោសិកាដុំសាច់ (41, 42)។ ពួកគេក៏បានណែនាំផងដែរថា កោសិកា CD8 + T អាចងាយនឹងកើតជំងឺអុកស៊ីតកម្មជាងកោសិកា CD4 + T ឬថាកោសិកា CD4 + T អាចប្រើប្រភពកាបូនក្រៅពីគ្លុយកូសដើម្បីរក្សាសកម្មភាពមីតូខនឌ្រី (43, 44)។ គួរកត់សម្គាល់ថា យើងមិនសង្កេតឃើញភាពខុសគ្នានៃការទទួលយកគ្លុយកូស ឬសកម្មភាពមីតូខនឌ្រីរវាងកោសិកា CD4 + T effector កោសិកាចងចាំ T effector និងកោសិកាចងចាំកណ្តាល T នៅក្នុងទឹកក្នុងទឹកក្នុងពោះនោះទេ។ ស្រដៀងគ្នានេះដែរ ស្ថានភាពខុសគ្នានៃកោសិកា CD8 + T នៅក្នុងដុំសាច់មិនមានអ្វីទាក់ទងនឹងការផ្លាស់ប្តូរនៃការទទួលយកគ្លុយកូសនោះទេ ដោយបង្ហាញពីភាពខុសគ្នាគួរឱ្យកត់សម្គាល់រវាងកោសិកា T ដែលដាំដុះនៅក្នុងវីត្រូ និងកោសិកា TIL របស់មនុស្សនៅក្នុងវីវ៉ូ (22)។ ការសង្កេតទាំងនេះក៏ត្រូវបានបញ្ជាក់ដោយការប្រើប្រាស់ការបែងចែកចំនួនប្រជាជនកោសិកាដោយស្វ័យប្រវត្តិដែលមិនលំអៀង ដែលបានបង្ហាញបន្ថែមទៀតថា កោសិកា CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + ជាមួយនឹងការទទួលយកគ្លុយកូសខ្ពស់ជាង និងសកម្មភាពមីតូខនឌ្រីជាងកោសិកាដុំសាច់គឺមានច្រើន ប៉ុន្តែមានចំនួនប្រជាជនកោសិកាសកម្មមេតាបូលីក។ ចំនួនប្រជាជននេះអាចតំណាងឱ្យចំនួនប្រជាជនរងនៃកោសិកាទប់ស្កាត់ myeloid ឬកោសិកា dendritic plasmacytoid ដែលត្រូវបានកំណត់នៅក្នុងការវិភាគ scRNA-seq។ ទោះបីជាទាំងពីរនេះត្រូវបានរាយការណ៍ថាមាននៅក្នុងដុំសាច់អូវែររបស់មនុស្ស [45] ក៏ដោយ ក៏ពួកវានៅតែត្រូវការការងារបន្ថែមទៀតដើម្បីពិពណ៌នាអំពីក្រុមរង myeloid នេះ។
ទោះបីជាវិធីសាស្ត្រដែលមានមូលដ្ឋានលើលំហូរស៊ីតូម៉ែត្រីអាចបញ្ជាក់ពីភាពខុសគ្នាទូទៅនៃការរំលាយអាហារគ្លុយកូស និងអុកស៊ីតកម្មរវាងប្រភេទកោសិកាក៏ដោយ ក៏សារធាតុរំលាយអាហារជាក់លាក់ដែលផលិតដោយគ្លុយកូស ឬប្រភពកាបូនផ្សេងទៀតសម្រាប់ការរំលាយអាហារមីតូខនឌ្រីនៅក្នុង TME មិនទាន់ត្រូវបានកំណត់នៅឡើយទេ។ ការកំណត់វត្តមាន ឬអវត្តមាននៃសារធាតុរំលាយអាហារទៅកាន់សំណុំរង TIL ដែលបានផ្តល់ឱ្យ តម្រូវឱ្យមានការបន្សុទ្ធចំនួនប្រជាជនកោសិកាពីជាលិកាដែលត្រូវបានកាត់ចេញ។ ដូច្នេះ វិធីសាស្ត្របង្កើនកោសិការបស់យើងរួមផ្សំជាមួយនឹងម៉ាសស្ពិចត្រូម៉ែត្រីអាចផ្តល់នូវការយល់ដឹងអំពីសារធាតុរំលាយអាហារដែលបង្កើនភាពខុសគ្នានៅក្នុងកោសិកា T និងចំនួនប្រជាជនកោសិកាដុំសាច់នៅក្នុងគំរូអ្នកជំងឺដែលត្រូវគ្នា។ ទោះបីជាវិធីសាស្ត្រនេះមានគុណសម្បត្តិជាងការតម្រៀបកោសិកាដែលបានធ្វើឱ្យសកម្មដោយពន្លឺក៏ដោយ បណ្ណាល័យសារធាតុរំលាយអាហារមួយចំនួនអាចរងផលប៉ះពាល់ដោយសារតែស្ថេរភាពពីកំណើត និង/ឬអត្រាផ្លាស់ប្តូរយ៉ាងឆាប់រហ័ស (22)។ យ៉ាងណាក៏ដោយ វិធីសាស្ត្ររបស់យើងអាចកំណត់អត្តសញ្ញាណសារធាតុរំលាយអាហារទប់ស្កាត់ភាពស៊ាំពីរដែលត្រូវបានទទួលស្គាល់គឺ អាដេណូស៊ីន និង គីនូរ៉ែន ពីព្រោះវាខុសគ្នាយ៉ាងខ្លាំងរវាងប្រភេទគំរូ។
ការវិភាគមេតាបូណូមិករបស់យើងលើដុំសាច់ និងប្រភេទរង TIL ផ្តល់នូវការយល់ដឹងបន្ថែមអំពីតួនាទីនៃសារធាតុរំលាយអាហារនៅក្នុង TME អូវែរ។ ទីមួយ ដោយប្រើលំហូរស៊ីតូម៉ែត្រី យើងបានកំណត់ថាមិនមានភាពខុសគ្នានៃសកម្មភាពមីតូខនឌ្រីរវាងដុំសាច់ និងកោសិកា CD4 + T ទេ។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ ការវិភាគ LC-MS/MS បានបង្ហាញពីការផ្លាស់ប្តូរគួរឱ្យកត់សម្គាល់នៅក្នុងភាពសម្បូរបែបនៃសារធាតុរំលាយអាហារក្នុងចំណោមប្រជាជនទាំងនេះ ដែលបង្ហាញថាការសន្និដ្ឋានអំពីការរំលាយអាហារ TIL និងសកម្មភាពរំលាយអាហារទាំងមូលរបស់វាតម្រូវឱ្យមានការបកស្រាយដោយប្រុងប្រយ័ត្ន។ ទីពីរ MNA គឺជាសារធាតុរំលាយអាហារដែលមានភាពខុសគ្នាធំបំផុតរវាងកោសិកា CD45 និងកោសិកា T នៅក្នុងទឹកក្នុងពោះ មិនមែនដុំសាច់ទេ។ ដូច្នេះ ការបែងចែក និងទីតាំងដុំសាច់អាចមានឥទ្ធិពលខុសៗគ្នាលើការរំលាយអាហារ TIL ដែលបង្ហាញពីភាពខុសគ្នាដែលអាចកើតមាននៅក្នុងមីក្រូបរិស្ថានដែលបានផ្តល់ឱ្យ។ ទីបី ការបញ្ចេញមតិរបស់អង់ស៊ីម NNMT ដែលផលិត MNA ភាគច្រើនត្រូវបានកំណត់ចំពោះ CAF ដែលជាកោសិកាដុំសាច់ក្នុងកម្រិតតិចជាង ប៉ុន្តែកម្រិត MNA ដែលអាចរកឃើញត្រូវបានគេសង្កេតឃើញនៅក្នុងកោសិកា T ដែលមានប្រភពមកពីដុំសាច់។ ការបញ្ចេញមតិលើសកម្រិតនៃ NNMT នៅក្នុង CAF អូវែរមានឥទ្ធិពលជំរុញជំងឺមហារីកដែលគេស្គាល់ ដែលមួយផ្នែកដោយសារតែការជំរុញការរំលាយអាហារ CAF ការឈ្លានពានរបស់ដុំសាច់ និងការរីករាលដាល (27)។ ទោះបីជាកម្រិតទូទៅនៃ TIL មានកម្រិតមធ្យមក៏ដោយ ការបញ្ចេញមតិរបស់ NNMT នៅក្នុង CAF មានទំនាក់ទំនងយ៉ាងជិតស្និទ្ធទៅនឹងប្រភេទរង mesenchymal របស់ Cancer Genome Atlas (TCGA) ដែលជាប់ទាក់ទងនឹងការព្យាករណ៍មិនល្អ (27, 46, 47)។ ជាចុងក្រោយ ការបញ្ចេញមតិរបស់អង់ស៊ីម AOX1 ដែលទទួលខុសត្រូវចំពោះការរិចរិល MNA ក៏ត្រូវបានកំណត់ចំពោះចំនួនប្រជាជន CAF ផងដែរ ដែលបង្ហាញថាកោសិកា T ខ្វះសមត្ថភាពក្នុងការរំលាយ MNA។ លទ្ធផលទាំងនេះគាំទ្រគំនិតដែលថា ទោះបីជាត្រូវការការងារបន្ថែមទៀតដើម្បីផ្ទៀងផ្ទាត់ការរកឃើញនេះក៏ដោយ កម្រិតខ្ពស់នៃ MNA នៅក្នុងកោសិកា T អាចបង្ហាញពីវត្តមាននៃមីក្រូបរិស្ថាន CAF ដែលបង្ក្រាបប្រព័ន្ធភាពស៊ាំ។
ដោយសារកម្រិតនៃការបញ្ចេញមតិទាបនៃអ្នកដឹកជញ្ជូន MNA និងកម្រិតដែលមិនអាចរកឃើញនៃប្រូតេអ៊ីនសំខាន់ៗដែលពាក់ព័ន្ធនឹងការរំលាយអាហារ MNA វត្តមានរបស់ MNA នៅក្នុងកោសិកា T គឺមិននឹកស្មានដល់។ ទាំង NNMT និង AOX1 មិនអាចត្រូវបានរកឃើញដោយការវិភាគ scRNA-seq និង qPCR គោលដៅនៃក្រុមឯករាជ្យពីរបានទេ។ លទ្ធផលទាំងនេះបង្ហាញថា MNA មិនត្រូវបានសំយោគដោយកោសិកា T ទេ ប៉ុន្តែត្រូវបានស្រូបយកពី TME ជុំវិញ។ ការពិសោធន៍ក្នុងវីត្រូបង្ហាញថាកោសិកា T មានទំនោរប្រមូលផ្តុំ MNA ពីខាងក្រៅ។
ការសិក្សានៅក្នុងវីត្រូរបស់យើងបានបង្ហាញថា MNA ពីខាងក្រៅបង្កើតការបញ្ចេញមតិរបស់ TNFα នៅក្នុងកោសិកា T និងបង្កើនការភ្ជាប់របស់ Sp1 ទៅនឹងប្រូម៉ូទ័រ TNFα។ ទោះបីជា TNFα មានមុខងារប្រឆាំងដុំសាច់ និងប្រឆាំងដុំសាច់ក៏ដោយ នៅក្នុងជំងឺមហារីកអូវែរ TNFα អាចជំរុញការលូតលាស់របស់ជំងឺមហារីកអូវែរ (31-33)។ ការបន្សាប TNFα ក្នុងការដាំដុះកោសិកាដុំសាច់អូវែរ ឬការលុបបំបាត់សញ្ញា TNFα នៅក្នុងគំរូកណ្ដុរអាចធ្វើអោយប្រសើរឡើងនូវការផលិតស៊ីតូគីនរលាកដែលសម្របសម្រួលដោយ TNFα និងរារាំងការលូតលាស់របស់ដុំសាច់ (32, 35)។ ដូច្នេះ ក្នុងករណីនេះ MNA ដែលមានប្រភពមកពី TME អាចដើរតួជាសារធាតុរំលាយអាហារបង្ករលាកតាមរយៈយន្តការដែលពឹងផ្អែកលើ TNFα តាមរយៈរង្វិលជុំអូតូគ្រីន ដោយហេតុនេះជំរុញការកើតឡើង និងការរីករាលដាលនៃជំងឺមហារីកអូវែរ (31)។ ដោយផ្អែកលើលទ្ធភាពនេះ ការទប់ស្កាត់ TNFα កំពុងត្រូវបានសិក្សាជាភ្នាក់ងារព្យាបាលដ៏មានសក្តានុពលសម្រាប់ជំងឺមហារីកអូវែរ (37, 48, 49)។ លើសពីនេះ MNA ធ្វើឱ្យខូចដល់ជាតិពុលកោសិកា CAR-T ទៅនឹងកោសិកាដុំសាច់អូវែរ ដែលផ្តល់នូវភស្តុតាងបន្ថែមសម្រាប់ការបង្ក្រាបភាពស៊ាំដែលសម្របសម្រួលដោយ MNA។ ជារួម លទ្ធផលទាំងនេះបង្ហាញពីគំរូមួយដែលដុំសាច់ និងកោសិកា CAF បញ្ចេញ MNA ទៅក្នុង TME ក្រៅកោសិកា។ តាមរយៈ (i) ការរំញោចការលូតលាស់មហារីកអូវែរដែលបង្កឡើងដោយ TNF និង (ii) ការរារាំងសកម្មភាពពុលកោសិកា T ដែលបង្កឡើងដោយ MNA នេះអាចមានឥទ្ធិពលពីរយ៉ាងទៅលើដុំសាច់ (រូបភាពទី 5D)។
សរុបមក តាមរយៈការអនុវត្តការរួមបញ្ចូលគ្នានៃការបង្កើនកោសិកាយ៉ាងឆាប់រហ័ស ការធ្វើលំដាប់កោសិកាតែមួយ និងការវិភាគមេតាបូលីស ការសិក្សានេះបានបង្ហាញពីភាពខុសគ្នាដ៏ធំនៃភាពស៊ាំនឹងមេតាបូលីមរវាងដុំសាច់ និងកោសិកាទឹកក្នុងអ្នកជំងឺ HGSC។ ការវិភាគដ៏ទូលំទូលាយនេះបានបង្ហាញថា មានភាពខុសគ្នានៃការទទួលយកជាតិស្ករ និងសកម្មភាពមីតូខនឌ្រីរវាងកោសិកា T ហើយបានកំណត់ MNA ជាសារធាតុរំលាយប្រព័ន្ធភាពស៊ាំស្វយ័តមិនមែនកោសិកា។ ទិន្នន័យទាំងនេះមានឥទ្ធិពលលើរបៀបដែល TME ប៉ះពាល់ដល់ការរំលាយអាហារកោសិកា T នៅក្នុងជំងឺមហារីករបស់មនុស្ស។ ទោះបីជាការប្រកួតប្រជែងដោយផ្ទាល់សម្រាប់សារធាតុចិញ្ចឹមរវាងកោសិកា T និងកោសិកាមហារីកត្រូវបានរាយការណ៍ក៏ដោយ សារធាតុរំលាយក៏អាចដើរតួជាសារធាតុគ្រប់គ្រងដោយប្រយោលដើម្បីជំរុញការវិវត្តនៃដុំសាច់ និងអាចទប់ស្កាត់ការឆ្លើយតបនៃប្រព័ន្ធភាពស៊ាំខាងក្នុង។ ការពិពណ៌នាបន្ថែមអំពីតួនាទីមុខងារនៃសារធាតុរំលាយប្រព័ន្ធទាំងនេះអាចបើកយុទ្ធសាស្ត្រជំនួសសម្រាប់បង្កើនការឆ្លើយតបនៃប្រព័ន្ធភាពស៊ាំប្រឆាំងនឹងដុំសាច់។
សំណាក និងទិន្នន័យគ្លីនិករបស់អ្នកជំងឺត្រូវបានទទួលតាមរយៈឃ្លាំងជាលិកាដុំសាច់មហារីក BC ដែលត្រូវបានបញ្ជាក់ដោយបណ្តាញឃ្លាំងជាលិកាកាណាដា។ យោងតាមពិធីសារដែលត្រូវបានអនុម័តដោយគណៈកម្មាធិការសីលធម៌ស្រាវជ្រាវជំងឺមហារីក BC និងសាកលវិទ្យាល័យ British Columbia (H07-00463) សំណាក និងទិន្នន័យគ្លីនិករបស់អ្នកជំងឺទាំងអស់ទទួលបានការយល់ព្រមជាលាយលក្ខណ៍អក្សរ ឬបានលះបង់ការយល់ព្រមរបស់ពួកគេជាផ្លូវការ។ សំណាកត្រូវបានរក្សាទុកនៅក្នុង BioBank ដែលមានវិញ្ញាបនបត្រ (BRC-00290)។ លក្ខណៈលម្អិតរបស់អ្នកជំងឺត្រូវបានបង្ហាញក្នុងតារាង S1 និង S5។ សម្រាប់ការរក្សាទុកក្នុងសីតុណ្ហភាពត្រជាក់ កាំបិតវះកាត់ត្រូវបានប្រើដើម្បីបំបែកសំណាកដុំសាច់របស់អ្នកជំងឺដោយមេកានិច ហើយបន្ទាប់មករុញវាឆ្លងកាត់តម្រង 100 មីក្រូន ដើម្បីទទួលបានស៊ុស្ប៉ង់ស្យុងកោសិកាតែមួយ។ ទឹកក្នុងពោះរបស់អ្នកជំងឺត្រូវបានបង្វិលក្នុងល្បឿន 1500 rpm រយៈពេល 10 នាទីនៅសីតុណ្ហភាព 4°C ដើម្បីបំបែកកោសិកា និងយកសារធាតុរាវលើសចេញ។ កោសិកាដែលទទួលបានពីដុំសាច់ និងទឹកក្នុងក្រពះត្រូវបានរក្សាទុកក្នុងសីតុណ្ហភាពត្រជាក់ក្នុងសេរ៉ូម AB របស់មនុស្ស 50% ដែលត្រូវបានធ្វើឱ្យអសកម្មដោយកំដៅ (Sigma-Aldrich), RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) 40% និងឌីមេទីលស៊ុលហ្វុកស៊ីត 10%។ ស៊ុស្ប៉ង់ស្យុងកោសិកាតែមួយដែលរក្សាទុកទាំងនេះត្រូវបានរលាយ និងប្រើសម្រាប់ការកំណត់មេតាបូលីក និងមេតាបូលីតដែលបានពិពណ៌នាខាងក្រោម។
ឧបករណ៍ផ្ទុកពេញលេញមាន RPMI 1640 កម្រាស់ 0.22 μm ដែលបានត្រងរួច 50:50 ដែលបានបន្ថែម៖ AimV។ RPMI 1640 + 2.05 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) ដែលបានបន្ថែមជាមួយសេរ៉ូម AB របស់មនុស្សដែលបានធ្វើឱ្យអសកម្មដោយកំដៅ 10% (Sigma-Aldrich), 12.5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) (Fisher Scientific), 1 x ដំណោះស្រាយ Penicillin Streptomycin (PenStrep) (Thermo Fisher Scientific) និង 50 μMB-mercaptoethanol។ AimV (Invitrogen) ត្រូវបានបន្ថែមជាមួយ 20 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific) និង 2 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific)។ សារធាតុបណ្ដោះអាសន្នសម្រាប់ជ្រលក់ពណ៌ដោយប្រើលំហូរស៊ីតូម៉ែត្រ មានអំបិលផូស្វាតដែលត្រងរួច 0.22μm (PBS; Invitrogen) ដែលបានបន្ថែមជាមួយសេរ៉ូមមនុស្ស AB ដែលបានធ្វើឲ្យអសកម្មដោយកម្ដៅ 3% (Sigma)។ សារធាតុបណ្ដោះអាសន្នសម្រាប់បង្កើនកោសិកាមានសមាសធាតុនៃ PBS ដែលត្រងរួច 0.22μm និងបានបន្ថែមជាមួយសេរ៉ូម AB ដែលបានធ្វើឲ្យអសកម្មដោយកម្ដៅ 0.5% (Sigma-Aldrich)។
នៅក្នុងឧបករណ៍ផ្ទុកពេញលេញសីតុណ្ហភាព 37°C កោសិកាត្រូវបានប្រឡាក់ពណ៌ជាមួយ 10 nM MT DR និង 100 μM 2-NBDG រយៈពេល 30 នាទី។ បន្ទាប់មក កោសិកាត្រូវបានប្រឡាក់ពណ៌ជាមួយថ្នាំជ្រលក់ eF506 នៅសីតុណ្ហភាព 4°C រយៈពេល 15 នាទី។ រំលាយកោសិកាឡើងវិញនៅក្នុង FC Block (eBioscience) និង Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences) ពនលាយក្នុងសារធាតុរាវសម្រាប់លាបពណ៌លំហូរ cytometer (យោងតាមការណែនាំរបស់អ្នកផលិត) ហើយភ្ញាស់រយៈពេល 10 នាទីនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។ លាបពណ៌កោសិកាជាមួយអង្គបដិប្រាណមួយក្រុម (តារាង S2) នៅក្នុងសារធាតុរាវសម្រាប់លាបពណ៌លំហូរ cytometry នៅសីតុណ្ហភាព 4°C រយៈពេល 20 នាទី។ រំលាយកោសិកាឡើងវិញនៅក្នុងសារធាតុរាវសម្រាប់លាបពណ៌លំហូរ cytometry (Cytek Aurora; ការកំណត់រចនាសម្ព័ន្ធ 3L-16V-14B-8R) មុនពេលវិភាគ។ ប្រើ SpectroFlo និង FlowJo V10 ដើម្បីវិភាគទិន្នន័យចំនួនកោសិកា ហើយប្រើ GraphPad Prism 8 ដើម្បីបង្កើតទិន្នន័យ។ អាំងតង់ស៊ីតេពន្លឺមធ្យម (MFI) នៃ 2-NBDG និង MT DR ត្រូវបានធ្វើឲ្យមានលក្ខណៈធម្មតាតាមឡូហ្គល ហើយបន្ទាប់មកការធ្វើតេស្ត t ផ្គូផ្គងត្រូវបានប្រើសម្រាប់ការវិភាគស្ថិតិដើម្បីរាប់បញ្ចូលអ្នកជំងឺដែលត្រូវគ្នា។ ដកចំនួនប្រជាជនទាំងអស់ដែលមានព្រឹត្តិការណ៍តិចជាង 40 ចេញពីការវិភាគ។ បញ្ចូលតម្លៃ MFI 1 សម្រាប់តម្លៃអវិជ្ជមានណាមួយមុនពេលអនុវត្តការវិភាគស្ថិតិ និងការមើលឃើញទិន្នន័យ។
ដើម្បីបំពេញបន្ថែមយុទ្ធសាស្ត្របិទ/បើកដោយដៃនៃបន្ទះដំណើរការខាងលើ យើងបានប្រើចំណារពន្យល់ពេញលេញដោយដើមឈើកំណត់រូបរាង (FAUST) (21) ដើម្បីកំណត់កោសិកាដោយស្វ័យប្រវត្តិទៅឱ្យចំនួនប្រជាជនបន្ទាប់ពីលុបបំបាត់កោសិកាងាប់នៅក្នុង FlowJo។ យើងគ្រប់គ្រងទិន្នផលដោយដៃដើម្បីបញ្ចូលចំនួនប្រជាជនដែលហាក់ដូចជាត្រូវបានបែងចែកមិនត្រឹមត្រូវ (រួមបញ្ចូលគ្នា PD1+ ជាមួយកោសិកាដុំសាច់ PD1) និងចំនួនប្រជាជនដែលរក្សាទុក។ គំរូនីមួយៗមានកោសិកាជាមធ្យមច្រើនជាង 2% សម្រាប់ចំនួនប្រជាជនសរុបចំនួន 11។
ការបង្វិលដង់ស៊ីតេជម្រាល Ficoll ត្រូវបានប្រើដើម្បីបំបែក PBMC ចេញពីផលិតផលបំបែក leukocyte (STEMCELL Technologies)។ កោសិកា CD8 + T ត្រូវបានញែកចេញពី PBMC ដោយប្រើ CD8 MicroBeads (Miltenyi) ហើយពង្រីកនៅក្នុងឧបករណ៍ផ្ទុកពេញលេញដោយប្រើ TransAct (Miltenyi) រយៈពេល 2 សប្តាហ៍ ស្របតាមការណែនាំរបស់អ្នកផលិត។ កោសិកាត្រូវបានអនុញ្ញាតឱ្យឈររយៈពេល 5 ថ្ងៃនៅក្នុងឧបករណ៍ផ្ទុកពេញលេញដែលមាន IL-7 (10 ng/ml; PeproTech) ហើយបន្ទាប់មកត្រូវបានរំញោចឡើងវិញជាមួយ TransAct។ នៅថ្ងៃទី 7 ស្របតាមការណែនាំរបស់អ្នកផលិត កោសិកា CD45 MicroBeads របស់មនុស្ស (Miltenyi) ត្រូវបានប្រើដើម្បីបង្កើនកោសិកាក្នុងជុំជាប់ៗគ្នាចំនួនបី។ កោសិកាត្រូវបានបែងចែកសម្រាប់ការវិភាគលំហូរ cytometry (ដូចដែលបានពិពណ៌នាខាងលើ) ហើយកោសិកាមួយលានត្រូវបានបែងចែកបីដងសម្រាប់ការវិភាគ LC-MS/MS។ គំរូត្រូវបានដំណើរការដោយ LC-MS/MS ដូចដែលបានពិពណ៌នាខាងក្រោម។ យើងបានប៉ាន់ប្រមាណតម្លៃមេតាបូលីតដែលបាត់ជាមួយនឹងចំនួនអ៊ីយ៉ុង 1,000។ គំរូនីមួយៗត្រូវបានធ្វើឱ្យមានលក្ខណៈធម្មតាដោយចំនួនអ៊ីយ៉ុងសរុប (TIC) ដែលត្រូវបានបម្លែងដោយលោការីត និងត្រូវបានធ្វើឱ្យមានលក្ខណៈធម្មតាដោយស្វ័យប្រវត្តិនៅក្នុង MetaboAnalystR មុនពេលវិភាគ។
ស៊ុស្ប៉ង់ស្យុងកោសិកាតែមួយរបស់អ្នកជំងឺម្នាក់ៗត្រូវបានរលាយ និងច្រោះតាមរយៈតម្រង 40 μm ចូលទៅក្នុងឧបករណ៍ផ្ទុកពេញលេញ (ដូចដែលបានពិពណ៌នាខាងលើ)។ យោងតាមពិធីការរបស់អ្នកផលិត ការជ្រើសរើសវិជ្ជមានបីជុំជាប់ៗគ្នាដោយការបំបែកអង្កាំម៉ាញេទិកដោយប្រើ MicroBeads (Miltenyi) ត្រូវបានប្រើដើម្បីបង្កើនសំណាកសម្រាប់កោសិកា CD8+, CD4+ និង CD45- (លើទឹកកក)។ សរុបមក កោសិកាត្រូវបានធ្វើឱ្យសកម្មឡើងវិញនៅក្នុងសារធាតុបង្កើនកោសិកា (ដូចដែលបានពិពណ៌នាខាងលើ) ហើយរាប់។ កោសិកាត្រូវបានភ្ញាស់ជាមួយអង្កាំ CD8 របស់មនុស្ស អង្កាំ CD4 របស់មនុស្ស ឬអង្កាំ CD45 របស់មនុស្ស (Miltenyi) នៅសីតុណ្ហភាព 4°C រយៈពេល 15 នាទី ហើយបន្ទាប់មកលាងសម្អាតជាមួយសារធាតុបង្កើនកោសិកា។ សំណាកត្រូវបានឆ្លងកាត់ជួរឈរ LS (Miltenyi) ហើយប្រភាគវិជ្ជមាន និងអវិជ្ជមានត្រូវបានប្រមូល។ ដើម្បីកាត់បន្ថយរយៈពេល និងបង្កើនជំហានស្តារកោសិកាឡើងវិញ ប្រភាគ CD8 ត្រូវបានប្រើសម្រាប់ជុំទីពីរនៃការបង្កើន CD4+ ហើយប្រភាគ CD4 ត្រូវបានប្រើសម្រាប់ការបង្កើន CD45 ជាបន្តបន្ទាប់។ រក្សាដំណោះស្រាយនៅលើទឹកកកពេញមួយដំណើរការបំបែក។
ដើម្បីរៀបចំគំរូសម្រាប់ការវិភាគមេតាបូលីត កោសិកាត្រូវបានលាងសម្អាតម្តងជាមួយនឹងដំណោះស្រាយអំបិលត្រជាក់ ហើយមេតាណុល 80% ចំនួន 1 មីលីលីត្រ ត្រូវបានបន្ថែមទៅក្នុងគំរូនីមួយៗ បន្ទាប់មកត្រូវបានបង្វិល និងបង្កកក្នុងអាសូតរាវ។ គំរូត្រូវបានទទួលរងនូវវដ្តបង្កក-រលាយចំនួនបី ហើយបង្វិលក្នុងល្បឿន 14,000 rpm រយៈពេល 15 នាទី នៅសីតុណ្ហភាព 4°C។ សារធាតុរាវខាងលើដែលមានមេតាបូលីតត្រូវបានហួតរហូតដល់ស្ងួត។ មេតាបូលីតត្រូវបានរំលាយឡើងវិញក្នុងអាស៊ីតហ្វមីក 0.03% ចំនួន 50 μl បង្វិលដើម្បីលាយ ហើយបន្ទាប់មកបង្វិលដើម្បីយកកំទេចកំទីចេញ។
ស្រង់សារធាតុរំលាយដូចដែលបានពិពណ៌នាខាងលើ។ ផ្ទេរសារធាតុរាវខាងលើទៅដបក្រូម៉ាតូក្រាហ្វីរាវដែលមានប្រសិទ្ធភាពខ្ពស់សម្រាប់ការស្រាវជ្រាវមេតាបូឡូមិច។ ប្រើពិធីការព្យាបាលចៃដន្យដើម្បីព្យាបាលគំរូនីមួយៗជាមួយនឹងចំនួនកោសិកាស្រដៀងគ្នាដើម្បីការពារផលប៉ះពាល់ជាបាច់។ យើងបានធ្វើការវាយតម្លៃគុណភាពនៃសារធាតុរំលាយសកលដែលបានបោះពុម្ពផ្សាយពីមុននៅលើ AB SCIEX QTRAP 5500 Triple Quadrupole Mass Spectrometer (50)។ ការវិភាគក្រូម៉ាតូក្រាហ្វី និងការរួមបញ្ចូលតំបន់កំពូលត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើកម្មវិធី MultiQuant កំណែ 2.1 (Applied Biosystems SCIEX)។
ចំនួនអ៊ីយ៉ុង 1000 ត្រូវបានប្រើដើម្បីប៉ាន់ប្រមាណតម្លៃមេតាបូលីតដែលបាត់ ហើយ TIC នៃគំរូនីមួយៗត្រូវបានប្រើដើម្បីគណនាផ្ទៃកំពូលធម្មតានៃមេតាបូលីតដែលបានរកឃើញនីមួយៗដើម្បីកែតម្រូវការផ្លាស់ប្តូរដែលណែនាំដោយការវិភាគឧបករណ៍ពីដំណើរការគំរូ។ បន្ទាប់ពី TIC ត្រូវបានធ្វើឱ្យមានលក្ខណៈធម្មតា MetaboAnalystR(51) (ប៉ារ៉ាម៉ែត្រលំនាំដើម) ត្រូវបានប្រើសម្រាប់ការបំលែងលោការីត និងការធ្វើមាត្រដ្ឋានបន្ទាត់បទដ្ឋានដោយស្វ័យប្រវត្តិ។ យើងបានប្រើ PCA ជាមួយកញ្ចប់ vegan R ដើម្បីធ្វើការវិភាគស្វែងយល់អំពីភាពខុសគ្នានៃមេតាបូលីតរវាងប្រភេទគំរូ និងបានប្រើការវិភាគលើសលប់ដោយផ្នែកដើម្បីវិភាគអ្នកជំងឺ។ ប្រើវិធីសាស្ត្រ Ward ដើម្បីបង្កើត dendrogram ផែនទីកំដៅដើម្បីដាក់ជាក្រុមចម្ងាយ Euclidean រវាងគំរូ។ យើងបានប្រើ limma (52) លើភាពសម្បូរបែបនៃមេតាបូលីតស្តង់ដារ ដើម្បីកំណត់អត្តសញ្ញាណមេតាបូលីតដែលមានភាពសម្បូរបែបខុសៗគ្នានៅទូទាំងប្រភេទកោសិកាទាំងមូល និងមីក្រូបរិស្ថាន។ ដើម្បីសម្រួលដល់ការពន្យល់ យើងប្រើប៉ារ៉ាម៉ែត្រមធ្យមក្រុមដើម្បីបញ្ជាក់គំរូ ហើយពិចារណាប្រភេទកោសិកានៅក្នុងមីក្រូបរិស្ថានជាក្រុមនីមួយៗ (n = 6 ក្រុម); សម្រាប់ការធ្វើតេស្តសារៈសំខាន់ យើងបានធ្វើការវាស់វែងម្តងហើយម្តងទៀតចំនួនបីដងសម្រាប់សារធាតុរំលាយនីមួយៗ។ ដើម្បីជៀសវាងការចម្លងមិនពិត អ្នកជំងឺត្រូវបានរួមបញ្ចូលជាឧបសគ្គនៅក្នុងការរចនា limma។ ដើម្បីពិនិត្យមើលភាពខុសគ្នានៃសារធាតុរំលាយរវាងអ្នកជំងឺផ្សេងៗគ្នា យើងបានកែតម្រូវគំរូ limma រួមទាំងអ្នកជំងឺតាមរបៀបថេរ។ យើងរាយការណ៍ពីសារៈសំខាន់នៃភាពផ្ទុយគ្នាដែលបានកំណត់ជាមុនរវាងប្រភេទកោសិកា និងមីក្រូបរិស្ថាននៃ Padj <0.05 (ការកែតម្រូវ Benjamini-Hochberg)។
បន្ទាប់ពីការបង្កើនភាពរឹងមាំដោយប្រើឧបករណ៍ដកកោសិកាងាប់ Miltenyi (>80% នៃលទ្ធភាពរស់) ការធ្វើលំដាប់ប្រតិចារិកកោសិកាតែមួយត្រូវបានអនុវត្តលើសំណាកទឹកក្នុងពោះកក និងសំណាកដុំសាច់សរុបដោយប្រើពិធីការបញ្ចេញហ្សែន 10x 5′gene។ ករណីចំនួនប្រាំដែលមានដុំសាច់ និងទឹកក្នុងពោះដែលត្រូវគ្នាត្រូវបានវិភាគ ទោះបីជាលទ្ធភាពរស់ទាបពីសំណាកដុំសាច់មួយបានរារាំងការរួមបញ្ចូលរបស់វាក៏ដោយ។ ដើម្បីសម្រេចបាននូវការជ្រើសរើសអ្នកជំងឺច្រើន យើងបានផ្សំសំណាករបស់អ្នកជំងឺម្នាក់ៗនៅក្នុងគន្លងនៃឧបករណ៍បញ្ជាក្រូមីញ៉ូម 10x ហើយបានវិភាគទឹកក្នុងពោះ និងកន្លែងដុំសាច់ដោយឡែកពីគ្នា។ បន្ទាប់ពីការរៀបលំដាប់ [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp paired end (PE), Quebec genome; ជាមធ្យម 73,488 និង 41,378 ការអានក្នុងមួយកោសិកាសម្រាប់ដុំសាច់ និង ascites រៀងៗខ្លួន]] យើងបានប្រើ CellSNP និង Vireo (53) (ផ្អែកលើ CellSNP ជា SNP របស់មនុស្សទូទៅ (VCF) ដែលផ្តល់ដោយ GRCh38 ត្រូវបានកំណត់អត្តសញ្ញាណអ្នកបរិច្ចាគ។ យើងប្រើ SNPRelate ដើម្បីសន្និដ្ឋានអត្តសញ្ញាណជិតបំផុត (IBS) នៃស្ថានភាពហ្សែនរបស់អ្នកជំងឺ (IBS) ដោយមិនរាប់បញ្ចូលកោសិកាដែលមិនទាន់បានកំណត់ និងកោសិកាដែលត្រូវបានកំណត់ថាជា duplexes និងអ្នកបរិច្ចាគដែលត្រូវគ្នារវាងគំរូ ascites និងដុំសាច់ (54)។ ដោយផ្អែកលើភារកិច្ចនេះ យើងរក្សាករណីបីដែលមានតំណាងកោសិកាច្រើននៅក្នុងដុំសាច់ និង ascites សម្រាប់ការវិភាគខាងក្រោម។ បន្ទាប់ពីអនុវត្តជំហានច្រោះម៉ាសនៅក្នុងការវេចខ្ចប់ BioConductor scater (55) និង scran (56) នេះបានផ្តល់កោសិកាចំនួន 6975 (កោសិកាចំនួន 2792 និង 4183 ពីដុំសាច់ និង ascites រៀងៗខ្លួន) សម្រាប់ការវិភាគ។ យើងប្រើការដាក់ជាក្រុម Louvain របស់ igraph (57) នៃបណ្តាញអ្នកជិតខាងដែលនៅជិតបំផុតដែលបានចែករំលែក (SNN) ដោយផ្អែកលើ Jaccard ចម្ងាយទៅកាន់កោសិកាចង្កោមតាមការបញ្ចេញមតិ។ ចង្កោមទាំងនេះត្រូវបានបញ្ចូលដោយដៃទៅនឹងប្រភេទកោសិកាដែលអាចសន្មតបានដោយផ្អែកលើការបញ្ចេញមតិហ្សែនសម្គាល់ និងមើលឃើញជាមួយ t-SNE។ កោសិកា T ស៊ីតូស៊ីកត្រូវបានកំណត់ដោយការបញ្ចេញមតិនៃ CD8A និង GZMA ដោយមិនរាប់បញ្ចូលក្រុមរងដែលមានការបញ្ចេញមតិប្រូតេអ៊ីនរីបូសូមទាប។ យើងបានចូលមើលទិន្នន័យដែលបានបោះពុម្ពផ្សាយរបស់ Izar et al. (16) រួមទាំងការបង្កប់ t-SNE របស់ពួកវា អាចគ្រប់គ្រងការបញ្ចេញមតិត្រួតស៊ីគ្នារវាងសញ្ញាសម្គាល់កោសិកាភាពស៊ាំ និងការបញ្ចេញមតិ NNMT។
PBMC ត្រូវបានបំបែកចេញពីផលិតផលបំបែកកោសិកាឈាមស (STEMCELL Technologies) ដោយប្រើម៉ាស៊ីនបង្វិលដង់ស៊ីតេជម្រាល Ficoll។ កោសិកា CD3+ ត្រូវបានញែកចេញពី PBMC ដោយប្រើអង្កាំ CD3 (Miltenyi)។ នៅក្នុងវត្តមាន ឬអវត្តមាននៃ MNA កោសិកា CD3+ ត្រូវបានធ្វើឱ្យសកម្មជាមួយ CD3 ដែលចងភ្ជាប់នឹងបន្ទះ (5μg/ml) CD28 រលាយ (3μg/ml) និង IL-2 (300 U/ml; Proleukin)។ នៅថ្ងៃចុងក្រោយនៃការពង្រីក សមត្ថភាពរស់រានមានជីវិត (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) និងការរីកសាយ (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) ត្រូវបានវាយតម្លៃដោយលំហូរស៊ីតូម៉ែត្រី។ វាយតម្លៃមុខងារ effector ដោយការរំញោចកោសិកាជាមួយ PMA (20 ng/ml) និង ionomycin (1μg/ml) ជាមួយ GolgiStop រយៈពេល 4 ម៉ោង ហើយតាមដាន CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4), BioLegend) និង TNFα-fluorescein isothiocyanate (FITC) (MAb11, BD)។ រំញោចកោសិកា qPCR និង ChIP ជាមួយ PMA (20 ng/ml) និង ionomycin (1μg/ml) រយៈពេល 4 ម៉ោង។ សារធាតុរាវ ELISA ត្រូវបានប្រមូលមុន និងក្រោយពេលរំញោចជាមួយ PMA (20 ng/ml) និង ionomycin (1 μg/ml) រយៈពេល 4 ម៉ោង។
សូមអនុវត្តតាមពិធីការរបស់អ្នកផលិតដើម្បីញែក RNA ដោយប្រើ RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN)។ ប្រើ QIAshredder (QIAGEN) ដើម្បីធ្វើឱ្យគំរូមានលក្ខណៈដូចគ្នា។ ប្រើឧបករណ៍បំលែង RNA ទៅ cDNA ដែលមានសមត្ថភាពខ្ពស់ (Thermo Fisher Scientific) ដើម្បីសំយោគ DNA បំពេញបន្ថែម (cDNA)។ ប្រើ TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) ដើម្បីវាស់បរិមាណការបញ្ចេញហ្សែន (យោងទៅតាមពិធីការរបស់អ្នកផលិត) ជាមួយនឹងឧបករណ៍ស៊ើបអង្កេតដូចខាងក្រោម៖ Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [glyceraldehyde-3-phosphate off Hydrogen (GAPDH)] និង Hs01010726_m1 (SLC22A2)។ សំណាកទាំងនេះត្រូវបានដំណើរការលើប្រព័ន្ធ PCR ពេលវេលាជាក់ស្តែង StepOnePlus (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) នៅក្នុងបន្ទះប្រតិកម្មអុបទិកលឿន 96 រន្ធ MicroAmp (Applied Biosystems) ជាមួយនឹងខ្សែភាពយន្តអុបទិក MicroAmp។ តម្លៃ Ct ណាមួយដែលលើសពី 35 ត្រូវបានចាត់ទុកថានៅខាងលើកម្រិតកំណត់នៃការរកឃើញ ហើយត្រូវបានសម្គាល់ថាមិនអាចរកឃើញ។
អនុវត្ត ChIP ដូចដែលបានពិពណ៌នាពីមុន (58)។ សរុបមក កោសិកាត្រូវបានព្យាបាលដោយ formaldehyde (កំហាប់ចុងក្រោយ 1.42%) ហើយភ្ញាស់នៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់រយៈពេល 10 នាទី។ ប្រើសារធាតុ swelling buffer ដែលបានបន្ថែម (25 mM Hepes, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl និង 0.1% NP-40) លើទឹកកករយៈពេល 10 នាទី បន្ទាប់មករលាយឡើងវិញក្នុងសារធាតុ immunoprecipitation buffer ដូចដែលបានពិពណ៌នា (58)។ បន្ទាប់មកគំរូត្រូវបាន sonicated ជាមួយនឹងវដ្តដូចខាងក្រោម៖ 10 វដ្ត (20 ជីពចរ 1 វិនាទី) និងពេលវេលាឋិតិវន្ត 40 វិនាទី។ ភ្ញាស់អង្គបដិប្រាណ immunoglobulin ថ្នាក់ ChIP G (បច្ចេកវិទ្យាសញ្ញាកោសិកា; 1μl), histone H3 (បច្ចេកវិទ្យាសញ្ញាកោសិកា; 3μl), NFAT (Invitrogen; 3μl) និង SP1 (បច្ចេកវិទ្យាសញ្ញាកោសិកា; 3μl) ជាមួយគំរូនៅសីតុណ្ហភាព 4°CC អ្រងួនពេញមួយយប់។ ភ្ញាស់អង្កាំប្រូតេអ៊ីន A (Thermo Fisher Scientific) ជាមួយសំណាកនៅសីតុណ្ហភាព 4°C ដោយអង្រួនថ្នមៗរយៈពេល 1 ម៉ោង បន្ទាប់មកប្រើអង្កាំ chelex (Bio-Rad) ដើម្បីបង្កើន DNA ហើយប្រើ proteinase K (Thermo Fisher) សម្រាប់ការរំលាយប្រូតេអ៊ីន។ ប្រូម៉ូទ័រ TNFα ត្រូវបានរកឃើញដោយ PCR៖ ទៅមុខ GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; ផ្ទុយទៅវិញ GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (ផលិតផល 207-bp)។ រូបភាពត្រូវបានផលិតដោយ Image Lab (Bio-Rad) និងវាស់វែងដោយប្រើកម្មវិធី ImageJ។
សារធាតុរាវដែលលើសពីការដាំដុះកោសិកាត្រូវបានប្រមូលដូចបានរៀបរាប់ខាងលើ។ ការកំណត់ត្រូវបានអនុវត្តតាមនីតិវិធីរបស់អ្នកផលិតនៃឧបករណ៍ ELISA TNFα របស់មនុស្ស (Invitrogen) ឧបករណ៍ ELISA IL-2 របស់មនុស្ស (Invitrogen) និងឧបករណ៍ ELISA IFN-γ របស់មនុស្ស (Abcam)។ យោងតាមពិធីការរបស់អ្នកផលិត សារធាតុរាវដែលលើសពីការដាំដុះត្រូវបានពនលាយ 1:100 ដើម្បីរកឃើញ TNFα និង IL-2 និង 1:3 ដើម្បីរកឃើញ IFN-γ។ ប្រើឧបករណ៍អានស្លាកពហុប្រភេទ EnVision 2104 (PerkinElmer) ដើម្បីវាស់ការស្រូបយកនៅ 450 nm។
PBMC ត្រូវបានបំបែកចេញពីផលិតផលបំបែកកោសិកាឈាមស (STEMCELL Technologies) ដោយប្រើម៉ាស៊ីនបង្វិលដង់ស៊ីតេជម្រាល Ficoll។ កោសិកា CD3+ ត្រូវបានញែកចេញពី PBMC ដោយប្រើអង្កាំ CD3 (Miltenyi)។ នៅក្នុងវត្តមាន ឬអវត្តមាននៃ MNA កោសិកា CD3+ ត្រូវបានធ្វើឱ្យសកម្មជាមួយ CD3 ដែលចងភ្ជាប់នឹងបន្ទះ (5μg/ml) CD28 រលាយ (3μg/ml) និង IL-2 (300 U/ml; Proleukin) រយៈពេល 3 ថ្ងៃ។ បន្ទាប់ពី 3 ថ្ងៃ កោសិកាត្រូវបានប្រមូល និងលាងសម្អាតជាមួយទឹកអំបិល 0.9% ហើយគ្រាប់ត្រូវបានកកភ្លាមៗ។ ការរាប់ចំនួនកោសិកាត្រូវបានអនុវត្តដោយការវិភាគលំហូរកោសិកា (Cytek Aurora; ការកំណត់រចនាសម្ព័ន្ធ 3L-16V-14B-8R) ដោយប្រើ eBeads ចំនួន 123 ខ្ទង់។
សារធាតុរំលាយដែលបានស្រង់ចេញដូចបានរៀបរាប់ខាងលើ។ សារធាតុចម្រាញ់ស្ងួតត្រូវបានបង្កើតឡើងឡើងវិញក្នុងកំហាប់ 4000 សមមូលកោសិកា/μl។ វិភាគគំរូដោយក្រូម៉ាតូក្រាហ្វីដំណាក់កាលបញ្ច្រាស (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) និងជួរឈរ CORTECS T3 (2.1×150 mm, ទំហំភាគល្អិត 1.6-μm, ទំហំរន្ធ 120-Å; #186008500, Waters)។ ស្ពិចត្រូម៉ែត្រម៉ាស់ប៉ូល (6470, Agilent) ដែលអ៊ីយ៉ូដអេឡិចត្រូស្ព្រាយដំណើរការក្នុងរបៀបវិជ្ជមាន។ ដំណាក់កាលចល័ត A គឺ 0.1% អាស៊ីតហ្វមិក (ក្នុង H2O) ដំណាក់កាលចល័ត B គឺ 90% អាសេតូនីទ្រីល អាស៊ីតហ្វមិក 0.1%។ ជម្រាល LC គឺ 0 ទៅ 2 នាទីសម្រាប់ 100% A, 2 ទៅ 7.1 នាទីសម្រាប់ 99% B និង 7.1 ទៅ 8 នាទីសម្រាប់ 99% B។ បន្ទាប់មកធ្វើឱ្យជួរឈរមានតុល្យភាពឡើងវិញជាមួយនឹងដំណាក់កាលចល័ត A ក្នុងអត្រាលំហូរ 0.6 មីលីលីត្រ/នាទី រយៈពេល 3 នាទី។ អត្រាលំហូរគឺ 0.4 មីលីលីត្រ/នាទី ហើយបន្ទប់ជួរឈរត្រូវបានកំដៅដល់ 50°C។ ប្រើស្តង់ដារគីមីសុទ្ធរបស់ MNA (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Canada) ដើម្បីបង្កើតពេលវេលារក្សាទុក (RT) និងការបំលែង (RT = 0.882 នាទី, ការបំលែង 1 = 137→94.1, ការបំលែង 2 = 137→92, ការបំលែង 3 = 137→78)។ នៅពេលដែលការផ្លាស់ប្តូរទាំងបីកើតឡើងនៅពេលវេលារក្សាទុកត្រឹមត្រូវ ការផ្លាស់ប្តូរ 1 ត្រូវបានប្រើសម្រាប់ការវាស់វែងបរិមាណដើម្បីធានាបាននូវភាពជាក់លាក់។ ខ្សែកោងស្តង់ដារនៃ MNA (ក្រុមហ៊ុន Toronto Research Chemical Company) ត្រូវបានបង្កើតឡើងដោយការពនលាយជាបន្តបន្ទាប់ចំនួនប្រាំមួយដងនៃដំណោះស្រាយស្តុក (1 mg/ml) ដើម្បីទទួលបានស្តង់ដារ 0.1, 1.0, 10 និង 100 ng/ml និង 1.0 និង 10μg/ml រៀងៗខ្លួន។ ដែនកំណត់នៃការរកឃើញគឺ 1 ng/ml ហើយការឆ្លើយតបលីនេអ៊ែរគឺរវាង 10 ng/ml និង 10μg/ml។ ការចាក់គំរូ និងស្តង់ដារចំនួនពីរមីក្រូលីត្រនីមួយៗត្រូវបានប្រើសម្រាប់ការវិភាគ LC/MS ហើយគំរូត្រួតពិនិត្យគុណភាពចម្រុះត្រូវបានដំណើរការរៀងរាល់ការចាក់ចំនួនប្រាំបីដងដើម្បីធានាបាននូវស្ថេរភាពនៃវេទិកាវិភាគ។ ការឆ្លើយតប MNA នៃគំរូកោសិកាដែលបានព្យាបាលដោយ MNA ទាំងអស់ស្ថិតនៅក្នុងជួរលីនេអ៊ែរនៃការវិភាគ។ ការវិភាគទិន្នន័យត្រូវបានធ្វើឡើងដោយប្រើកម្មវិធីវិភាគបរិមាណ MassHunter (v9.0, Agilent)។
រចនាសម្ព័ន្ធ αFR-CAR ជំនាន់ទីពីរត្រូវបានយកចេញពី Song et al. (59)។ សរុបមក រចនាសម្ព័ន្ធនេះមានខ្លឹមសារដូចខាងក្រោម៖ លំដាប់អ្នកដឹកនាំ CD8a បំណែកអថេរខ្សែសង្វាក់តែមួយជាក់លាក់របស់មនុស្ស αFR តំបន់ហ៊ីង CD8a និងតំបន់ឆ្លងភ្នាស ដែនក្នុងកោសិកា CD27 និងដែនក្នុងកោសិកា CD3z។ លំដាប់ CAR ពេញលេញត្រូវបានសំយោគដោយ GenScript ហើយបន្ទាប់មកត្រូវបានក្លូនចូលទៅក្នុងវ៉ិចទ័របញ្ចេញមេរោគ lentiviral ជំនាន់ទីពីរនៅខាងលើកាសែតបញ្ចេញមេរោគ GFP ដែលប្រើដើម្បីវាយតម្លៃប្រសិទ្ធភាពបញ្ជូន។
មេរោគ Lentivirus ត្រូវបានផលិតឡើងដោយការបញ្ចូលកោសិកា HEK293T [American Type Culture Collection (ATCC); ដាំដុះនៅក្នុងឧបករណ៍ផ្ទុកមេរោគ Dulbecco's modified Eagle medium ដែលមានផ្ទុកសេរ៉ូមគោគភ៌ (FBS) 10% និង PenStrep 1% ហើយបានប្រើវ៉ិចទ័រ CAR-GFP និងប្លាស្មីតវេចខ្ចប់ (psPAX2 និង pMD2.G, Addgene) ប្រើប្រាស់ lipofection amine (Sigma-Aldrich)។ សារធាតុរាវដែលមានផ្ទុកមេរោគត្រូវបានប្រមូល 48 និង 72 ម៉ោងបន្ទាប់ពីការបញ្ចូល ត្រង និងប្រមូលផ្តុំដោយការបង្វិលដោយអ៊ុលត្រាវីយូឡេ។ រក្សាទុកសារធាតុរាវដែលមានផ្ទុកមេរោគនៅ -80°C រហូតដល់ការបញ្ចូល។
PBMC ត្រូវបានបំបែកចេញពីផលិតផលបំបែកកោសិកាឈាមសដែលបានបរិច្ចាគដែលមានសុខភាពល្អ (STEMCELL Technologies) ដោយការបង្វិលដង់ស៊ីតេជម្រាល Ficoll។ ប្រើមីក្រូប៊ីដ CD8 ជម្រើសវិជ្ជមាន (Miltenyi) ដើម្បីញែកកោសិកា CD8+ ចេញពី PBMC។ រំញោចកោសិកា T ជាមួយ TransAct (Miltenyi) និងក្នុងឧបករណ៍ផ្ទុក TexMACS [Miltenyi; បន្ថែមជាមួយសេរ៉ូមមនុស្សដែលបានធ្វើឱ្យអសកម្មដោយកំដៅ 3% 1% PenStrep និង IL-2 (300 U/ml)]។ ម្ភៃបួនម៉ោងបន្ទាប់ពីការរំញោច កោសិកា T ត្រូវបានបញ្ចូលជាមួយ lentivirus (សារធាតុរាវវីរុសប្រមូលផ្តុំ 10 μl ក្នុង 106 កោសិកា)។ 1 ទៅ 3 ថ្ងៃបន្ទាប់ពីការបញ្ចូលលើ Cytek Aurora (លើ FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+) វាយតម្លៃការបញ្ចេញមតិ GFP នៃកោសិកាដើម្បីបង្ហាញពីប្រសិទ្ធភាពបញ្ចូលយ៉ាងហោចណាស់ 30%។
កោសិកា CAR-T ត្រូវបានដាំដុះរយៈពេល 24 ម៉ោងនៅក្នុង Immunocult (STEMCELL Technologies; បន្ថែមជាមួយ 1% PenStrep) ក្រោមលក្ខខណ្ឌដូចខាងក្រោម៖ មិនបានព្យាបាល ត្រូវបានព្យាបាលដោយ adenosine 250 μM ឬ 10 mM MNA។ បន្ទាប់ពីការព្យាបាលជាមុន កោសិកា CAR-T ត្រូវបានលាងសម្អាតជាមួយ PBS ហើយផ្សំជាមួយកោសិកា SK-OV-3 ចំនួន 20,000 [ATCC; នៅក្នុងឧបករណ៍ផ្ទុក McCoy 5A (Sigma-Aldrich) ដែលបានបន្ថែមជាមួយ 10% FBS និង 1% PenStrep នៅ 10: សមាមាត្រ effector ទៅនឹងគោលដៅ 1 ត្រូវបានពង្រីកជាបីដងនៅក្នុងឧបករណ៍ផ្ទុក Immunocult ដែលបានបន្ថែម។ កោសិកា SK-OV-3 និងកោសិកា SK-OV-3 ដែលត្រូវបាន lysed ជាមួយ digitalis saponin (0.5mg/ml; Sigma-Aldrich) ត្រូវបានប្រើជាការគ្រប់គ្រងអវិជ្ជមាន និងវិជ្ជមានរៀងៗខ្លួន។ បន្ទាប់ពីដាំដុះរួមគ្នារយៈពេល 24 ម៉ោង សារធាតុរាវខាងលើត្រូវបានប្រមូល ហើយសារធាតុ lactate dehydrogenase (LDH) ត្រូវបានវាស់តាមការណែនាំរបស់អ្នកផលិត (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega)។ សារធាតុរាវខាងលើ LDH ត្រូវបានពនលាយ 1:50 ក្នុងសារធាតុ LDH buffer។ ភាគរយនៃការសម្លាប់ត្រូវបានវាស់ដោយប្រើរូបមន្តដូចខាងក្រោម៖ ភាគរយនៃការសម្លាប់ = ភាគរយនៃការកែតម្រូវ / អត្រាសម្លាប់អតិបរមា x 100% ដែលភាគរយនៃការកែតម្រូវ = កោសិកា T ដាំដុះរួមគ្នាតែប៉ុណ្ណោះ និងអត្រាសម្លាប់អតិបរមា = ការគ្រប់គ្រងវិជ្ជមាន-ការគ្រប់គ្រងអវិជ្ជមាន។
ដូចដែលបានពិពណ៌នានៅក្នុងអត្ថបទ ឬសម្ភារៈ និងវិធីសាស្រ្ត សូមប្រើ GraphPad Prism 8, Microsoft Excel ឬ R v3.6.0 សម្រាប់ការវិភាគស្ថិតិ។ ប្រសិនបើសំណាកច្រើនត្រូវបានប្រមូលពីអ្នកជំងឺដូចគ្នា (ដូចជាទឹកក្នុងពោះ និងដុំសាច់) យើងប្រើការធ្វើតេស្ត t ផ្គូផ្គង ឬរួមបញ្ចូលអ្នកជំងឺជាឥទ្ធិពលចៃដន្យក្នុងគំរូលីនេអ៊ែរ ឬទូទៅតាមការសមស្រប។ សម្រាប់ការវិភាគមេតាបូឡូមិច ការធ្វើតេស្តសារៈសំខាន់ត្រូវបានអនុវត្តជាបីដង។
សម្រាប់ឯកសារបន្ថែមសម្រាប់អត្ថបទនេះ សូមមើល http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
នេះជាអត្ថបទសម្រាប់ចូលមើលដោយសេរី ដែលចែកចាយក្រោមលក្ខខណ្ឌនៃអាជ្ញាប័ណ្ណ Creative Commons Attribution-Non-Commercial ដែលអនុញ្ញាតឱ្យប្រើប្រាស់ ចែកចាយ និងផលិតឡើងវិញក្នុងមធ្យោបាយណាមួយ ដរាបណាការប្រើប្រាស់ចុងក្រោយមិនមែនសម្រាប់ផលប្រយោជន៍ពាណិជ្ជកម្ម ហើយគោលការណ៍គឺថាស្នាដៃដើមគឺត្រឹមត្រូវ។ ជាឯកសារយោង។
ចំណាំ៖ យើងគ្រាន់តែស្នើសុំឱ្យអ្នកផ្តល់អាសយដ្ឋានអ៊ីមែលរបស់អ្នក ដើម្បីឱ្យមនុស្សដែលអ្នកណែនាំទៅកាន់ទំព័រដឹងថាអ្នកចង់ឱ្យពួកគេឃើញអ៊ីមែល ហើយវាមិនមែនជាសារឥតបានការទេ។ យើងនឹងមិនចាប់យកអាសយដ្ឋានអ៊ីមែលណាមួយឡើយ។
សំណួរនេះត្រូវបានប្រើដើម្បីសាកល្បងថាតើអ្នកជាអ្នកទស្សនា និងការពារការដាក់ស្នើសារឥតបានការដោយស្វ័យប្រវត្តិឬអត់។
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Jalph J.R. Dellini, Ralph J.R. Dell G. Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA រួមចំណែកដល់ការបង្ក្រាបប្រព័ន្ធភាពស៊ាំរបស់កោសិកា T និងតំណាងឱ្យគោលដៅព្យាបាលដោយប្រព័ន្ធភាពស៊ាំដ៏មានសក្តានុពលសម្រាប់ការព្យាបាលជំងឺមហារីកមនុស្ស។
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Jalph J.R. Dellini, Ralph J.R. Dell G. Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA រួមចំណែកដល់ការបង្ក្រាបប្រព័ន្ធភាពស៊ាំរបស់កោសិកា T និងតំណាងឱ្យគោលដៅព្យាបាលដោយប្រព័ន្ធភាពស៊ាំដ៏មានសក្តានុពលសម្រាប់ការព្យាបាលជំងឺមហារីកមនុស្ស។
© 2021 សមាគមអាមេរិចសម្រាប់ការជឿនលឿននៃវិទ្យាសាស្ត្រ។ រក្សាសិទ្ធិគ្រប់យ៉ាង។ AAAS គឺជាដៃគូរបស់ HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef និង CountER ។ ScienceAdvances ISSN 2375-2548 ។
ពេលវេលាបង្ហោះ៖ ថ្ងៃទី ១៨ ខែកុម្ភៈ ឆ្នាំ ២០២១